Biz Dr JL teşekkür ederiz. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Fransa) verdiği destek için. Bu çalışma CNRS, İNSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley tarafından ve Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) hibe tarafından desteklenmiştir Conseil Régional d&#39;Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Yön Générale des Entreprises (Pharmadol).

Tüm deneyler laboratuvar hayvanlarında (Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/ECC) ve bilinçli hayvanlarda 13 deneysel ağrı soruşturma için etik ilkelerin bakımı için Avrupa kurallarına sıkı göre yapılmıştır. Erkek C57BL6 / N Tac fareler (10 hafta, 25-30 g) çevre standartlarına uygun olarak tesisi işleten sorumlu bir bakım personeli ile kurumsal bir hayvan tesisine yerleştirilmiştir. Hayvanlar gruba ayrılmıştır yiyecek ve suya serbest erişim ile bir sabit sıcaklık (21 ± 1 ° C), 12 saat / 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında (kafes başına en fazla beş fare). Tüm deneyler 16 fareden oluşan bir grubu kullanarak günün aynı dönemine (10:00-16:00) gerçekleştirildi. Spesifik malzeme ve ekipmanlar malzemeleri tabloda belirtilmiştir. Morfin kaynaklı-hiperaljeziyi ve hoşgörü izlemek için bir beş-aşamalı prosedür Protokoldür15 gün, Şekil 1 bir süresi boyunca beş sıralı adımda (AE) ayrıldı. . İşleme 1 Fareler (Adım A, d-7 D-5&#39;e) <ol><li> Fareler Kulp ve özgürce süzgeç içine girmek onları alıştırmak. Böylece stres kaynaklı analjezi ile herhangi bir karışıklık minimize - - Bu ön basamak stresi azaltır ve hayvanlar fare süzgeç içine işleme ve manipülasyon, araştırmacı alışık sağlar. Her fare yavaşça her gün 5 dakika boyunca işlenir. </li></ol> . 2 Bazal Nosiseptif yanıt (Basamak B, D-1 d-4) <ol><li> Kuyruk Daldırma Testi (TİT) kullanarak kuyruk çekme potansiyelleri ölçün: <ol><li> 48 ° C&#39;ye termostatı ayarlayın </li><li> Yavaşça süzgeç içine fare tanıtmak. Su banyosunun içine kuyruk çıkıntılı 2/3 ucunu batırın ve kronometreyi başlatın. </li><li> Kısa sürede fare sıcak su kuyruğu çekilmesi gibi kronometreyi durdurun ve (sn) gecikme zamanı kaydedecektir. ThHerhangi bir nosiseptif reaksiyon e olmaması halinde, 25 saniye cut-off doku hasarını önlemek için kullanılır. </li><li> Kafesine fareyi değiştirmek ve serinin sonuna kadar bir sonraki test edin. </li><li> Aynı sırada, hayvanlardan ölçümleri alınarak, nosiseptif tepki ölçümler iki kez daha tekrarlayın. Her bir fare için Nosiseptif tepki gecikmesi (sn) birbirini izleyen üç tayini için ortalama değer olarak belirlenir. </li></ol></li><li> Kuyruk Basınç Testi (TPT) kullanılarak mekanik tepkileri ölçmek <ol><li> Yavaşça süzgeç içine fare tanıtmak ve analjezimetre ve konik ucu altında kuyruğunu yerleştirin. </li><li> Ilk nosiseptif reaksiyonu (mücadele, gıcırdıyor) oluşuncaya kadar kuyruk proksimal parçası üzerine düzgün artan bir baskı uygulamak için ayak-düğmesine basın. Hayvan tepki anda, nosiseptif tepki ortaya çıkaran (gram olarak), mevcut kuvveti kaydedilir. Herhangi bir reaksiyonun yokluğunda, bir 600 g cut-off değeri t önlemek için kullanılırzarar vermek. </li><li> Aynı fare kuyruk orta ve uzak kısımlarında bu tedbir tekrarlayın. En az 30 saniye bir aralık adaptasyonunu veya stres yanlılığı önlemek için belirli bir fare üzerinde önlemler arasında görülmektedir. Kafesine fareyi takın ve serisi (yani tüm fareler test edilmektedir) sonuna kadar bir sonraki hayvan test edin. Her bir fare için Nosiseptif değer (gram) ölçümleri (örneğin yakın, orta ve her bir hayvanın kuyruk distal kısmı) için, ortalama bir değer olarak alınmıştır. </li></ol></li><li> Sonraki günlerde tekrarlayın nosiseptif test (tüm prosedürleri adım 2 altında açıklanan), d-3 d-1. </li></ol> . Morfin Analjezi 3 Ölçme (Adım C; d0) <ol><li> Kararlı ve karşılaştırılabilir nosiseptif ortalama değerleri ile farelerin iki grup (grup başına n = 8), hangisi yöntem Nosiseptif (TIT veya TPT) seçimi kabul edilir sağlar: hayvanların en iyi kombinasyonunu tanımlar. Bu değer, bazal olarak alınacaktırGelecekteki &#39;Tuzlu&#39; ve &#39;Morfin&#39; grupları için referans nosiseptif cevabı. </li><li> Her bir hayvanın vücut ağırlığı ölçülür. </li><li> Deri altına uygulama (hayvanın vücut ağırlığının her kg&#39;ı başına 5 mg morfin) için steril fizyolojik salin (% 0.9 NaCl) içinde bir morfin çözeltisi (ml başına 0.5 mg morfin) hazırlayın. </li><li> Hem &#39;Saline&#39; ve TİT de &#39;Morfin&#39; grupları (yukarıda 2.1 altındaki tüm adımlar) her fare için (zaman noktası 0 olarak alınmıştır) nosiseptif tepki gecikme ölçün. Sonra TPT (yukarıda 2.2 &#39;tüm adımları) nosisepsiyonu ölçün. </li><li> Sırasıyla &#39;morfin&#39; ve &#39;tuzlu&#39; gruplarına deri altından morfin (25 g fare ağırlığı başına 0.5 mg / ml morfin çözeltisi, tipik olarak 0.25 mi) ve tuzlu su (25 g fare ağırlığı başına 0.25 mi) enjekte edilir. </li><li> Bir zaman boyunca TİT ve TPT üzerine nosiseptif değerleri (altındakiler yukarıda özetlenen tüm işlemler sırasıyla, 2.1 ve 2.2 adımları) (Tedbir 30 dakika interv atal) morfin değerlendirmek için (5 mg / kg) ile indüklenen analjezi: <ol><li> 30 dakika sonrası enjeksiyonundan sonra, TİT&#39;i sonra TPT kullanarak, &#39;Tuzlu&#39; ve &#39;Morfin&#39; gruplarının her bir fare için nosiseptif yanıtı (tek belirlenmesi) ölçün. </li><li> 1-1.5-2-2.5-3 ve 3.5 enjeksiyon sonrası: O zaman (saat olarak) zaman noktalarında tüm farelerde nosiseptif yanıt değerlerini (TİT ve TPT) ölçün. </li></ol></li></ol> 4 kronik morfin tedavisi - Hiperaljezi, morfin kaynaklı. (Adım D; d6 d1) <ol><li> Günü: d1 <ol><li> (2.1 ve 2.2 arasındaki adımlar) yukarıda tarif edildiği gibi TIT ve TPT ile ilgili nosiseptif tepki değerlerini ölçün. Dikkatli çekme potansiyelleri ve her bir hayvan için basınç limitleri açıklama. </li><li> Adım 3.2 &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir taze morfin çözeltisi hazırlayın. </li><li> &#39;Saline&#39; grubuna için tüm &#39;Morfin&#39; grubu ve fizyolojik tuzlu su (25 gr fare ağırlığı başına 0.25 mi), deri altından, morfin (5 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edilir. Let incie hayvanlar ertesi güne kadar bekletin. </li></ol></li><li> Gün On: d2, d3, d4, d5 ve Bölüm 4.1 altında açıklanan işlemleri tekrarlayın d6 </li></ol> . Analjezik Hoşgörü 5 Evidence (Adım E; d7) <ol><li> Zaten Bölüm 3&#39;te ayrıntılı zaman ders paradigmaya göre morfin kaynaklı analjezi değerlendirin. </li></ol> 6.. Veri Toplama ve İstatistiksel Analizler <ol><li> Bazal Nosiseptif Tepki Değerlerinin Değerlendirilmesi (Adım B) <ol><li> Her gün için hesaplayın (fazla Cı-4 d-1 döneme) SEM değerleri ± ortalama (n = 8) &#39;Salin&#39; ve &#39;Morfin&#39; grupları içinde TIT ve TPT dan elde olarak bazal nosiseptif yanıtlar için. </li><li> Her iki grup 2 için Şekil arsa süresi (gün) bir fonksiyonu olarak bazal nosiseptif ortalama değerleri. </li></ol></li><li> Gün d0 Morfin Ağrı zaman süreci analizi (Basamak C) ve d7 (Aşama E) <ol><li> Morfin sonra her zaman noktasında, hesaplayınEnjeksiyon, SEM değerleri ± ortalama (n = 8) Her bir grupta (saniye olarak) den elde edilmiştir TIT ve TPT (g) olarak nosiseptif yanıtlar için. </li><li> Arsa günde &#39;Salin&#39; ve &#39;Morfin&#39; grupları için bir zaman fonksiyonu 0 Şekil 3 ve gün 7 Şekil 5 olarak nosiseptif tepki değerleri anlamına gelir. </li></ol></li><li> Morfin kaynaklı hiperaljezi (Adım D) Gelişimi <ol><li> (D0-d7 tedavi dönemi boyunca) her bir gün için hesaplama SEM değerleri ± ortalama (n = 8) &#39;Salin ile tedavi edilmiş &quot;ve&quot; Morfin ile tedavi edilen gruplarının içinde TIT ve TPT dan elde olarak bazal nosiseptif tepki değerleri için. </li><li> Arsa &#39;Salin ile tedavi edilmiş &quot;ve&quot; Morfin ile tedavi grupları için, Şekil 4 süresi (gün) bir fonksiyonu olarak bazal nosiseptif tepki değerleri anlamına gelir. </li></ol></li><li> Analjezik Hoşgörü kanıt (Adım C ve E) <ol><li> Morfin zaman ders e belirleyinXperiment d0 Şekil 3 maksimal bir analjezik yanıtı uyarmak için morfin için gerekli zaman değeri (ya da zaman aralığı) gerçekleştirilir. </li><li> Referans zaman d7, Şekil 5 de tahmin etmek için (genellikle 30 dakika), bu değeri al nosisepsiyon taban çizgisi değeri (salinle tedavi edilen grup) ve akut morfin için gerçek analjezik yanıt (morfin ile tedavi edilen grubu). </li><li> Histogramlar Şekil 6 gibi bir zaman noktasında, tuzlu su ile muamele edilmiş ve morfin ile tedavi edilen gruplar için D0 ve d7 yapılan morfin zaman akışı deneylerinde 30 dakika alındığı Nosiseptif değerler sunulmaktadır. </li><li> İstatistikler: tek yönlü tekrarlayan ölçümler ANOVA kullanarak verileri analiz. Varyasyon faktörler (nesneler arasında) tedavi ve (konu içinde) zamanı idi. Her grupta ayrı ayrı farklılıkları kontrol etmek için, tekrarlayan ölçümler ANOVA yapıldı. İki grup arasındaki karşılaştırmalar eşleştirilmemiş t-test veya çift t-testi kullanılarak, uygun yapıldı. </li></ol></li><li> Anlamlılık düzeyi p &lt;0.05 olarak belirlenmiştir. Tüm İstatistiksel Analizler StatView Software kullanılarak gerçekleştirilmektedir. </li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

<html> Kritik Adımlar Nosisepsiyon ölçümleri için hayvan modeli seçimi Fareler suşları arasında nosiseptif ve analjezik duyarlılık Değişkenlik etiolojide farklı çeşitli ağrı modelleri kullanarak (yorum 14-16) değerlendirmeleri incelenmiştir (nosiseptif, enflamatuvar, nöropatik), modalite (termal, kimyasal, mekanik), süresi (akut, tonik, kronik) ve tatbikat alanı (deri içinden, deri altından, iç organ). Diğer suşlar ile karşılaştırıldığında bir yüksek bazal nosiseptif hassasiyet 17,18 ve 14,19 afyon bir orta analjezik tepki gösterir ve bu durum, C57BL/6J fareler (Jackson Laboratory için &quot;J&quot;), ağrı çalışmaları için uygun bir hayvan modeli oldu. Kronik morfin tedavisi ardından, aynı zamanda önemli bir analjezik toleransı 20,21, hiperaljeziyi 21,22 ve 20,23 bağımlılık gelişir. nt &quot;&gt; Burada, deney C57BL/6N Tac fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir B6 soy ayrı bir dalı aittir (&quot; Taconics grubu için Tac &#39;&quot;Ulusal Sağlık Enstitüsü için&quot; N.) C57BL / 6 fareleri, uzun olmasına rağmen değiştirilebilir, son çalışmalar C57BL/6J ve C57BL/6N 24 suşları arasında önemli davranış farklılıkları işaret olarak kabul. özellikle, termal ağrı akut (Tac bir de dahil olmak üzere) üç C57BL/6N substrains alt duyarlılığı olarak kabul edilebilir Bu fenotip için test avantaj. Erkek fareler çocuk erkeklerde 25 üzerinde gerçekleştirilir, hayvan modeli olarak fareler kullanılarak, ağrı çalışmaların büyük çoğunluğu olarak seçildi. Görüş analjezi veya hiperaljezi noktaları incelendiğinde bizim ellerimizde, onlar güçlü ve tekrarlanabilir verileri sağlamıştır. Bazen, biz C57BL/6N kadın TİT ve TPT testlerinde hem de daha değişken yanıtları sağlamak için bir eğilim fark ettim. Bu gözlem rağmenkadınların hormonal durumuna bağlı doğal varyasyonları yansıtmak, ağrı ve analjezi cinsiyet farklılıkların altında yatan genel mekanizmaları hala tartışma konusu olmaya devam etmektedir. Bu sıcak tartışmaların bazı yönleri kısaca bölümünün yanındaki &#39;tekniği Sınırlamalar&#39; sunulacak. Hayvan alışkanlık Fareler ilk bir hafta boyunca hayvan tesis alışması için izin verildi. Başka bir davranış çalışmaya benzer şekilde, 3 günlük bir test-iklime alıştırma periyodundan (Şekil 1, aşama A) uyularak gerçekleştirildi. Nosiseptif testleri strese duyarlı olarak, ilk önlemler özellikle olmayan Alışmış farelerde 26,27 olarak, sonraki olanlardan daha uzun gecikmeleri verebilir. Alışkanlık adımı da aynı gün içinde ve gün arasında daha dengeli nosiseptif tepki değerlerinin obtention 2 ve 4, Şekil sağlar. Nosiseptif ve analjezik sirkadiyen etkilerini azaltmak içinduyarlılık 28,29, bütün denemeleri 10:00-04:00 yapılmıştır. Nosiseptif testlerin seçimi Nosiseptif testler termal, mekanik, kimyasal veya elektriksel uyaranlar (yorum 26,27,30. Farklı nosiseptif yöntemleri farklı Nosiseptörlerin ve liflerin 18,31,32 yoluyla işlenen edilebilir Onların seçim kritik kullanabilirsiniz. Biz termal örnek olarak Randall ve Selitto 35 uyarlanan kuyruk daldırma testi (TİT) 33, D&#39;amour ve Smith 34 tarafından geliştirilen klasik kuyruk darbesi testinin değiştirilmiş versiyonu, ve kuyruk basınç testi (TPT), seçilmiş ve farelerde morfinin neden analjezi, hiperaljeziyi ve hoşgörü çalışma mekanik yöntemler. Her iki test yaygın sıçanlarda kullanılmaktadır. Bir zaman kesme sistematik doku hasarı riskini önlemek veya sınırlamak için tanımlanmıştır. Morfin-induced analjezi, hiperaljezi ve tolerans Bu güçlü bir analjezik ve OIH indükleyici olarak Morfin, prototip mu-opioid agonist, insanlarda ve hem de farelerde 1,2,36, burada seçildi. Morfin analjezik etki farenin suşları, tatbikat yolları ve nosiseptif yöntemleri ile değişir bilinmektedir. C57BL / 6 farelerinde, güvenilir bir analjezi, genellikle 1-20 mg / kg doz aralığında 14,21 morfin deri altı enjeksiyonu ile elde edilir. Buna göre, termal nosisepsiyon 19,21 değerlendirilmiştir olan ED 50 değeri (7-20 mg / kg) yakın 5 mg / kg, en morfin tek bir uygulama (sc) aşağıdaki akut analjezi çalışma seçtik. Tekrarlanan morfin uygulama sık ve hiperaljezi (ağrılı stimülasyonu için bir şiddetlenir hassasiyet (doz-yanıt eğrisinin bir sağa kayma ya da bir analjezik karşılık, genlik ve süresi azalıştan ya da kanıtladığı) analjezik toleransı ile eşliki) bazal nosiseptif değer bir azalma ile kanıtlandığı. Her ikisi de olumsuz etkiler tedavi süresi ve nosiseptif yöntemleri 21 opiat seçilir bileşik ve dozaj, doğasına, kemirgen suşları bağlıdır. Örneğin, tolerans ve hiperaljeziyi çalışma deneysel paradigmalar yüksek ve sabit (günde 20-40 mg / kg) ya da 22 (en fazla 50 ya da 200 mg / kg) 20,21 morfin dozları günlük yönetiminde oluşur. A, 8 günlük bir süre içinde, duruma göre, her gün morfin uygulamasından (sc 5 mg / kg) ile C57BL / 6 farelerinde hiperaljezi ve tolerans gelişimini teşvik etmiştir. Bu ılımlı morfin dozu daha iyi taklit klinik kullanım için daha yüksek olanlar tercih edilmiştir. TİT operasyonel penceresinin kurmak TİT bir muhtemel tuzak kemirgenler 26,37 arasında termoregülasyon kuyruk rolüne ilişkin olabilir. Ortam sıcaklığı nocicept önemli bir faktör olduğutepki ive varyasyonları, bu deneyler 38 boyunca (burada 21 ° C&#39;de) sabit tutulması gerekmektedir. Isı yoğunluğu, genellikle 5 ila 10 saniye 27 içinde bir nosiseptif tepki algılamak için kuruldu. Kısa olanlar testin diferansiyel gücü azaltabilir oysa Nitekim, daha fazla gecikmeleri, nosiseptif uyarana ilgisi olmayan hayvan hareketlerinin izlenmesi için riskini artırabilir. Bu 48 ° C sabit bir sıcaklıkta TIT ölçümleri gerçekleştirildi Kuyruk çekme gecikmeleri 9 sn (bazal nosiseptif değer) yakındır ve 25 sn 4 sn (hiperaljezi) den farklı idi (maksimal analjezi; kesti). Pratik nedenlerle ek olarak, sabit bir sıcaklıkta nosiseptif tepki değerlerinin ölçümleri önsel böylece veri yorumlama kolaylaştıran, nosiseptörlerin ve devrelerin aynı repertuar içerebilir. Olası Değişiklikler Analjezi ve OIH ölçü için TIT işletme penceresinin optimizasyonuNTS Analjezik yanıt odaklanırken, düşük bazal değerleri (yüksek ısı yoğunluğu) karşılık olarak bir gecikme tespiti lehine olabilir. Şekil 4, daha hızlı yanıt saptanmasını kolaylaştırabilir; Buna karşılık, bir ağrılı uyarıcı sonucu veya OIH gelişimini, daha yüksek taban çizgisi değerlerine (burada 48 ° C daha düşük bir ısı yoğunluk) gidermek için. Morfin kaynaklı analjezi,: (Kritik adım önce belirtildiği gibi 5 mg morfin bulundu rağmen / güçlü bir analjezik yanıtı Şekil 3 ikna etmek ve (tekrarlanan uygulama üzerine) önemli hiperestezisi Şekil 4 tanıtmak için uygun bir doz kg, kendi dozaj adapte edilebilir hiperaljezi ve tolerans). Örneğin, daha düşük dozlar, daha yüksek dozların hiperaljezi başlangıcını hızlandırmak ve arttırmak için genlik seçilebilir ise (bu cut-off kısıtlamaları ortadan kaldırır) analjezi genlik azaltmak için kullanılabilir. OveRall, &#39;nosiseptif pencerenin&#39; optimizasyon çalışmanın altında farelerin genetik arka uyarlanmış ve dikkate Nosiseptörlerin ve devrelerin farklı dizilerin katılımı için olasılığı dikkate alınmalıdır. Alternatif uyuşturucu agonistleri (fentanil, remifentanil) En çok klinik olarak kullanılan afyon agonistleri olarak mu-opioid reseptörü hedef de, in vitro ve in vivo olarak farmakolojik özellikleri açısından önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Örneğin, remifentanil ve fentanil için, morfin ile işaretlenmiş aksine, tam agonistler olarak davranırlar ve mu-opioid reseptörlerinin 39 içselleşmesini teşvik. Remifentanil birkaç dakika 41 ultra kısa bir yarı ömre sahiptir ise morfin ve fentanil gibi opium harici analjezikler, 40 saat aralığında yarı ömre sahiptir. İnsanlarda, OIH için en iyi kanıt, kısa etkili c olmak üzere, ameliyat sırasında afyon alınan hastaların birgibi remifentanil 2,42 gibi iyodu. Böylece, fentanil ve remifentanil TİT ve TPT paradigmalar altında, farelerde Hiperaljezi ve hoşgörü gelişimini incelemek için çok değerli araçlar olabilir. OIH indüksiyonu alternatif modları (akut uygulama vs kronik) OIH çok düşük ya da çok yüksek dozlarda 1,2 olsun, opiat tatbikat bir sonucu olarak, insan ve hayvan modellerinde görülmektedir. Biz morfin ılımlı dozda farelerin kronik tedavisi sonrasında OIH gelişimi burada rapor. . C57BL/6N farelerin tedavisi için birkaç gün 4 günlük morfin enjeksiyonu yeterli implante morfin granül ile değiştirilebilir bir berrak ve tekrarlanabilir bir durum Şekil hiperaljezik kanıt için gerekli olmuştur: çıkarılması üzerine, termal hiperaljezi ve allodini, mekanik hem de daha önce farelerde bildirilmiştir 43. Bir mikro-ozmotik pompası ile afyon infüzyonu başka bir olasılıktır<html> 44. Kemirgenlerde, uzun süreli hiperaljezi de elde insan cerrahisinde 36,45,46 bu mu-opioid agonistinin kullanımını taklit eden bir protokol kullanılarak fentanil akut verilmesini takip etmektedir. Tekniğin Sınırlamalar Ağrı için hayvan türleri ve modelleri Çok sayıda fare suşlarının karşılaştırmalı çalışmalar 4-gün tedavi, morfin, aşağıdaki 22 ağrılı uyaranlara 17,31,47 nosiseptif yanıtlarında ve OIH düzeylerinde büyük varyasyonlar için kanıt sağladı. Hayvan modellerinde (fareler ve sıçanlar) ağrı işleme ve modülasyon yatan mekanizmaları kronik ağrı hastalar için uygun olup olmadığını ve temel bir açıldı bir soru kalır. Böylece, çok dikkatli insanlar 16 hayvan verilerinin yorumlanması ve tahmin geçerlilik dikkat edilmelidir. Ağrı ve analjezi Cinsiyet farklılıkları, ntent &quot;&gt; ağrı için hayvan modelleri üzerinde en çok klinik öncesi çalışmalar, bu seçim yanlılığı rağmen, ortaya çıkan görünüm opioidi geliştirmek için opiat analjezikler 49,50, az yatkındır daha iyi yanıt olarak erkeği dikkate oldu. erkek kemirgenler 16,25,48 tarihinde yapılmıştır hiperaljeziyi 51,52 ve kadın meslektaşları (yorum 54) daha morfin analjezi 53 daha hoşgörülü kaynaklı. Ancak, nosisepsiyonun ve analjezik ilaçlar etkinliği açısından cinsiyet farkı böyle de devam etmeyin paradigma &#39;, bir tek beden herkese uyar&#39;. Nitekim, veri zenginliği şimdi çok sayıda değişkenler gibi opioid ilaç etkinliği ve seçicilik, nosiseptif deneyde, genetik arka plan, yaş, gonado-hormonal durum ya da sosyal etkileşim 48,54 olarak cinsiyet farklılıkları büyüklüğünü ve yönünü etkileyebilir gösterir. İnsanlarda klinik ağrı kadınlarda daha yaygın olduğunu, ancak bu gerçeği gerçek cinsiyet farklılıklarını yansıtan olmadığını tartışma 48,55,56 bir konudur. Fometa-analizler kadınlarda 57 bir anlamlı olarak daha fazla opioid etkinliğine işaret hastalar kontrollü konularda gerçekleştirilen oysa r örnek, elli klinik çalışmaların global analiz cinsiyetler arasında analjezik özelliklerinde anlamlı bir fark bulunmuştur. belirgin olmuştur ne tezat ikinci gözlem, kemirgenlerde bulunan, yine böyle ayrılıklar 16,48,55,57 için kökeni ile ilgili çeşitli sorular ortaya çıkarmaktadır. Toplamda, analjezi cinsiyet farklılıkları var ve liyakat daha altta yatan mekanizmaları ve klinik etkileri üzerinde durulmaktadır. Nosiseptif testler hakkında Kuyruk çekme testi spinal refleks ama supraspinal etkilere 58. tabi olabilir. TİT sıçanlar üzerinde gerçekleştirmek için nispeten kolay ama farelerde daha fazla uzmanlık gerektirir. Bir potansiyel zorluk istenmeyen stres yaratmadan doğru bir duruş içinde fare korumaktır. Önerilen protokolüne uygun olarak ayarlanabilirkohort boyutu. 16 hayvan (8 kontrol ve tedavi gören 8) kolayca kadar bazal nosiseptif tepki değerlerinin ölçümü olarak (birinci TIT kullanarak, daha sonra farelerin tüm dizi için TPT) endişe altında yönetilmektedir. Analjezi süresi dersleri izleme kazandırdığı zaman aralığı (burada 30 dakika) içinde kesin bir zaman çizelgesinin kurulması ve (sonra ilk TİT, TPT) test edilebilir hayvanların maksimum sayısının değerlendirilmesini gerektirir. Hayvanların bütün kohort böylece deneyi kinetik sınırlamaları saygı izin vermek için alt gruplara ayrılabilir. Mevcut / Alternatif Yöntemler ile ilgili Tekniğinin Önemi OIH fare karşı farelerde Sıçanlar yaygın akut ya da kronik bir opiat uygulama 46,59-61 ardından, opioid analjezik, hiperaljezi ve tolerans incelemek için kullanılmıştır. Gerçekten de, birkaç pratik nedenlerden dolayı, üstün olarak kabul edilebilirağrı deneyler 16,61 için bir hayvan modeli olarak farenin. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, genetik olarak tadil edilmiş farelerin üretimi basit bir işlem değildi. Çok sayıda genetiği değiştirilmiş fare suşları zaten mevcut olduğundan, bizim modeli farelerde OIH ve tolerans gelişiminde çok sayıda bireysel genlerin katkısını incelemek için bir fırsat sunuyor. Diğer nosiseptif testler karşı TİT ve TPT TIT tail flick test uyarımı alanı olan en belirgin fark bir çeşididir. Radyant ısı ile aksine, sıcak suya daldırma ile kuyruğun sıcaklığında hızlı ve düzgün bir artışa yol açar. Termal ağrı testi (sıcak levha veya Hargreaves testleri) diğer formları ile karşılaştırıldığında, TİT genelinde ve konular içinde hem de oldukça tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. TPT muhtemelen içeren mekanik nosisepsiyonun 26,27,35 çalışma için çok popüler bir testtirayrı nosiseptif lifler ve moleküler dönüştürücüler ardından TIT 32. Bu hızlı ve güvenilir ölçümler 59 sağlar ama deneyci ve büyük hayvan kohortlar bazı uzmanlık gerektirir. Bu çalışmada, diğer prosedürler veya aygıtta kullanılan analjezimetre bir alternatif olarak gerginlik ölçme dayanarak (inceleme 27) varolur. TPT von Frey filamentleri genellikle mekanik allodynia&#39;yı (yorum 27) değerlendirmek için alınır ise mekanik hiperaljeziyi eğitim için uygundur. Bu Tekniği Mastering sonra Gelecekteki Uygulamalar veya Tarifleri Burada mevcut deney OIH / tolerans modeli benzer ağrı modülasyonunda tek tek genlerin rolünü değerlendirmek amacıyla genetik olarak modifiye edilmiş fareler için adapte edilebilir. Ayrıca kronik ağrıyı gidermek için potansiyel terapötik maddelerin etkinliğini araştırmak için bir model sistem sağlar.

Opioid kaynaklı hiperaljezi (OIH) ve analjezik tolerans hayvanlarda ve insanlarda 1-3 opiat klinik etkinliklerini sınırlayabilmektedir. Pro-enflamatuar 4,5 &#39;ya pro-nosiseptif (anti-opioid) 6,7 sistemlerinin katılımı halen hipotezler incelenmiştir. OIH ve tolerans altında yatan mekanizmaların aydınlatılması uygun hayvan modelleri, deney protokollerini ve moleküler araçları kullanarak, in vivo ve in vitro yaklaşımlar bir arada gerektirmektedir. Davranış farmakoloji laboratuvar hayvanlarında analjezik ve hiperaljezik durumlarını izlemek ve ölçmek için egemen paradigma (sıçan, fare) &#39;dir. Hayvanın uygun bir gövde parçası (arka pençe, yükleme) bir zararlı uyarıcı (termal, mekanik ya da kimyasal) uygulaması kolay atılır bir nocifensive çekilmesine yol açar. Biz OIH, uyaran kayıt ve ölçülmesi için burada metodolojik bir yaklaşım önermiştir vekuyruk-daldırma ve kuyruk basınç testleri kullanarak, vahşi tip farelerde tolerans. Prosedür farelerde termal ve mekanik nosiseptif tepki değerlerinin bir kolay, hassas ve tekrarlanabilir belirlenmesini sağlar. Video protokolü de gösterildiği gibi, C57BL / 6 fareleri, kronik morfin uygulamasından alttaki önemli hiperaljezi deneyim ve birkaç gün boyunca korur. Her ikisi de, termal ve mekanik nosiseptif değerler önemli ölçüde naif hayvanlarda bazal ölçümleri ile karşılaştırıldığında azalır. Ayrıca, bizim deneysel set-up OIH, morfin (tolerans) için analjezik yanıt düşüş gelişimine ek olarak, izlemenizi sağlar. Sunulan veriler bu literatürde 1,10-12 tartışmalı olmasına rağmen hiperaljezi ve hoşgörü, ortak hücresel ve moleküler mekanizmaları 8,9 içerebilir olduğu görüşünü desteklemektedir. Son olarak, bu protokol benzer modülatöründen tek tek genlerin rolünü değerlendirmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler şekilde uyarlanabilirağrı tion. Aynı zamanda, bir opiat analjezik etkileri iyileştirmek için potansiyel terapötik maddelerin etkinliğini değerlendirmek için bir model sistem sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:220px;">Name</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Company</td>
			<td rowspan="2" style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td rowspan="2" style="width:291px;">Comments/description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">C57BL/6N Tac mice</td>
			<td style="width:231px;">Taconic, Ry, Denmark</td>
			<td style="width:139px;">C57BL/6N Tac B6-M</td>
			<td style="width:291px;">Male mice (25-30g)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Morphine hydrochloride</td>
			<td style="width:231px;">Francopia, Paris, France</td>
			<td style="width:139px;">CAS n&#176; 52-26-6</td>
			<td style="width:291px;">Delivered with special authorization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Syringes (Terumo)</td>
			<td style="width:231px;">Dutscher, Brumath, France</td>
			<td style="width:139px;">050000</td>
			<td style="width:291px;">Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Needles (Terumo)</td>
			<td style="width:231px;">Dutscher, Brumath, France</td>
			<td style="width:139px;">050101</td>
			<td style="width:291px;">G26 &#189; (Terumo reference : NN2613RO1)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:231px;">Home-made</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
			<td style="width:291px;">Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Thermostated water bath GR150</td>
			<td style="width:231px;">Grant Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td style="width:139px;">GP 0540003</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Analgesimeter</td>
			<td style="width:231px;">Panlab, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:139px;">LE 7306</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Kaleidagraph software</td>
			<td style="width:231px;">Synergy software, Reading, PA, USA</td>
			<td style="width:139px;">Kaleidagraph 4.03&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Scientific graphing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">STATview software</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:291px;">Free download; Statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of morphine-induced hyperalgesia and analgesic tolerance in mice using thermal and mechanical nociceptive modalities

Opioid kaynaklı hiperaljezi ve tolerans ciddi hayvanlarda ve insanlarda ağrı kesiciler gibi uyuşturucuların klinik etkinliğini etkileyebilir. Her iki fenomenlerin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir ve bunların aydınlatılması hayvan modellerinin çalışma ve uygun deneysel protokollerin tasarımı yararlanmalıdır. Burada, indükleyici kayıt ve vahşi tip farelerde kuyruk-daldırma ve kuyruk basınç testleri kullanılarak, analjezik tolerans gösteren hem de morfin kaynaklı hiperaljezi miktarının belirlenmesi için bir metodolojik yaklaşımı tarif eder. Videonun gösterildiği gibi, protokol beş ardışık aşamaya ayrılır. Kullanım ve alışkanlık fazlar hayvanların bazal nosiseptif tepki güvenli bir kararlılık sağlar. Her ikisi de, termal ve mekanik duyarlılığında bir artışa ile gösterildiği gibi kronik morfin uygulama, önemli bir hiperaljeziyi indükler oysa sonra analjezi zamanlı kursların karşılaştırma akut ya da temsilcisieated morfin tedavisi açıkça analjezik yanıt genliğinde bir azalma ile kendini gösteren tolerans gelişimini gösterir. Bu protokol, aynı şekilde nosisepsiyon ve morfin analjezi modülasyonunda tek tek genlerin rolünü değerlendirmek amacıyla genetik olarak modifiye edilmiş fareler için adapte edilebilir. Ayrıca opiat analjezik etkinliğini artırmak için potansiyel terapötik ajanların etkinliğini araştırmak için bir model sistemi sağlar.

Naif Farelerin Bazal nosiseptik Değerleri Değerlendirme (Adım B) TIT ve TPT sekans ortalama nosiseptif tepki değerlerini sağlayan, bütün farelerin kohort (n = 16) uygulanmıştır. Hayvanların en iyi kombinasyona izin iki gruba (n = 8) farelerin, benzer ve kararlı bazal nosiseptif değerleri görüntülemek Tuzlu ve Morfin, Şekil 2 olarak anılacaktır. Her iki grubun denklik ne nosiseptif testi geçerli (bir a posteriori tanım TİT: Şekil 2A; TPT: seçildi Şekil 2B). Gün 0 Morfin Analjezinin Zaman-ders (Adım C) Morfin analjezi TIT Şekil 3A ve Şekil 3B TPT her ikisini de kullanarak naif farelerde morfinin tek bir enjeksiyon (SC) (5 mg / kg) takiben değerlendirilmiştir. Bir şekilde tekrarlanan ölçümler ANOVA revea hem testler, istatistiksel analizlerTIT tedavisi için ve zaman arasında önemli bir etkileşim olduğu l (F (7, 98), 72, p &lt;0.001 =) ve TPT (F (7, 98) = 31, p &lt;0.001). TİT ve TPT veriler ANOVA (p&gt; 0.05, F (7, 49) = 0,49) serum enjeksiyonu hiçbir etkisi olduğunu gösterir ve F (7, 49) = 1.85, p&gt; 0.05, sırasıyla TİT ve TPT için tekrarlanan ölçümler kullanılarak analiz testleri), morfin enjeksiyonu) TIT ve TPT testleri için sırasıyla güçlü farelerde analjezi (F (7, 49) = 92,46, p &lt;0.001) ve F (7, 49) = 34,37, p &lt;0.001 uyarmaktadır. Morfin maksimal analjezik etkisi TIT 30 dakika sonra ve serum fizyolojik enjekte edilen kontrol grubuna göre (p &lt;0.001, eşleştirilmemiş t-test) ile karşılaştırıldığında TPT 60 dakika sonra ulaşıldı. Farelerde Tekrarlanan Morfin Yönetimler İndükler Hiperaljezi (Adım D) Bazal nosiseptif değerleri her gün ölçüldütuzlu su ya da morfin uygulamasından önce (protokolü). Ve mekanik (F (, Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, 6 günlük tedavi süresi boyunca, günde bir kez, morfin idareleri anlamlı ve ilerici termal indirilmesi (Şekil 4A F (7, 56) = 11.6, p &lt;0.001, tekrarlanan ölçümler için ANOVA) indüklenen Şekil 4B) bazal nosiseptif değerleri; 7,56) 15,55, p &lt;0.001, tekrarlanan ölçümler için ANOVA =. Hiperaljezi it (salin enjekte edilen kontrol grubu ile karşılaştırıldığında p &lt;0.01, t-test) TIT in 1. günde anlamlı başladı hızla gelişen ve TPT günde 2 tuzlu kıyasla (p &lt;0.05, t-test, önceki ) denetimleri enjekte. 7. günde de morfin Analjezi için zaman-ki, kronik morfin tedavisi (Adım E) sonra 7. günde, (d6 d0) 7 günlük bir süre boyunca günlük olarak, morfin ya da tuzlu su enjeksiyonları uygulanmasından farenin T incelendiIT bazal nosiseptif değerleri için birinci 5A ve Şekil 5B, Şekil TPT ve akut morfine bunların analjezik tepki (5 mg / kg, sc.) Dir. Şekil 4&#39;te gösterilen hiperaljezi gelişimi ile uyumlu olarak, kronik morfin ile tedavi edilen farelerin bazal nosiseptif değeri (zaman 0) tuzlu su enjekte edilmiş kontrol farelerinde (p &lt;0.001, eşleştirilmemiş t-test) önemli ölçüde daha düşüktü. Akut morfin sonra, kronik morfin ile tedavi edilen grubun nosiseptif tepki önemli ölçüde artmış, ancak sadece biraz TIT 30 dakika içinde ve TPT (p &lt;0.01, p &lt;0.05, eşleştirilmemiş t ölçülen serum fizyolojik enjekte edilen kontrol farelerinin bazal nosiseptif değerini aşmıştır -testi, sırasıyla) ve TİT 60 dakika (p &lt;0.05, t-test). 2 saat kaynaktan morfin muameleden sonra deneyin sonuna kadar, nosiseptif tepkileri kontrol farelerinin kişilerce (p daha düşük değerlere geri&lt;0.001, t-test). Morphine Farelerin azami analjezik Yanıtların karşılaştırması (Day 0) önce ve sonra kronik morfin tedavisi (Gün 7). Şekil 6&#39;da sunulan Nosiseptif eşik değerleri TIT (A) &#39;dan ve Şekiller 3 (gün 0) ve 5 (Gün 7)&#39; de gösterildiği gibi TPT (B) ya da tuzlu su, morfin enjeksiyonundan sonra 30 dakika gerçekleştirilmiştir. Morfin analjezi düzeyinde önemli bir azalma hem nosiseptif testlerinde 0. günde başlangıç ​​analjezi tepki (p &lt;0.001 ikili t-testi) ile karşılaştırıldığında, 7 gün boyunca kronik morfin tedavisi sonrasında farelerde gözlenmiştir. Bu veriler tolerans ağrı aşırı duyarlı hayvanlarda geliştirmek etmediğini ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. Beş adım promorfin kaynaklı-hiperaljeziyi ve hoşgörü izlemek için rektiğini düşündürmektedir. protokol 15 gün toplam süresi boyunca beş ardışık adımlarla (AE) ayrılmıştır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig2highres.jpg" width="500" /> . Bazal nosiseptif tepki değerleri (Basamak B, D-1 d-4) Şekil 2 Tanım. Kuyruk daldırma (TIT) (A) ve arka basıncı (TPT) (B) testleri hayvanların bütün dizi uygulanır bazal nosiseptif değerlerini değerlendirmek için. Bundan sonra, fareler iki grup (n = 8), &quot;Saline &#39;olarak adlandırılır ve kabul edilir her türlü nosiseptif tedavi, sabit ve karşılaştırılabilir nosiseptif ortalama değerleri gösterirler, böylece&#39; Morfin grupları tanımlanmıştır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src = &quot;/ files/ftp_upload/51264/51264fig3highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; TIT (A) ve TPT (B) 0. günde (Aşama C) morfin analjezi için Şekil 3,. Zaman ders. Farelerin bazal nosiseptif tepki değeri bir morfin (5 mg / kg, sc sonra her 30 dakikada belirlendi. ) ya da tuzlu su enjeksiyonları. Veriler ± SEM olarak ifade edilmiştir, grup başına n = 8 fare edilir. * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001, eşleşmemiş t-testi, kontrol grubuna kıyasla. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig4highres.jpg" width="500" /> . Tekrar morfin uygulamasından (Adım D; d6 d1) aşağıdaki hiperaljezi Şekil 4, Development. Farelerin bazal nosiseptif TIT değeri belirlendi (A) ve TPT (B) günde bir kez daha önce morfin (5 mg / kg,sc.) veya tuzlu su yönetimi. Veri ± SEM olarak ifade edilen ortalama değerler, grup başına n = 8 fare edilir. * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001 eşleştirilmemiş t-testi ile, tuzlu su ile tedavi edilen kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Zaman takibi 7. günde de kronik morfin-ile tedavi edilmiş farelerde analjezi morfin TIT de (Adım E) (A) ve kronik morfin (siyah nokta) veya tuzlu su (beyaz üçgenler) ile muamele edildi TPT (B). Fare için Gün 0 6 güne kadar, günde 7 morfinin, sırasıyla, tek bir enjeksiyon (5 mg / kg, sc.) veya tuzlu su aldı. Farelerin Nosiseptif tepki, morfin ya da tuzlu su enjeksiyonundan sonra her 30 dakikada belirlendi. Veriler ± SEM olarak ifade edilmiştir, n = grup başına 8 fare edilir. * P &lt;0.05, ** P &amp; #60; Salin ile tedavi edilmiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, eşleştirilmemiş t-testi ile 0.01. Sembolleri boyutlarını aşmamasına Hata çubukları gizlenir. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6,. Burada bildirilen kronik morfin tedavisi (Gün 7). Değerler, Şekil 3 ve Şekil 5&#39;te gösterilen deneyler vardır (gün 0) ve sonra daha önce morfin farelerin yüksek analjezik tepkiler (5 mg / kg, sc.) Karşılaştırılması. Nosiseptif TIT değerleri (A) ve TPT (B), morfin ya da tuzlu su enjeksiyonundan sonra 30 dakika ölçüldü. Veriler ± SEM olarak ifade edilmiştir, n = grup başına 8 fare edilir. *** P &lt;0.001, eşleştirilmiş t-testi ile.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities at JoVE.com

Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Bu opioid kaynaklı hiperaljezi ve farelerde tolerans gelişimini incelemek için bir protokol açıklar. Naif ve morfin ile tedavi edilen hayvanların, termal ve mekanik nosiseptif yanıtların ölçümü dayanarak, ağrı duyarlılığı (hiperaljezi) &#39;de artışı ölçmek ve kronik opiat uygulama ile bağlantılı analjezi (tolerans) azalma sağlar.

Termal ve Mekanik nosiseptik Usuller kullanma Farelerde Morfin kaynaklı Hiperaljezi ve Analjezik Hoşgörü Değerlendirilmesi

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

assessment-morphine-induced-hyperalgesia-analgesic-tolerance-mice

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drugs for Pain Management: Opioid Analgesics and General Anesthetics

SCIENTISTS IN ACTION

33.0K Görüntüleme.  Université de Strasbourg.  Bu opioid kaynaklı hiperaljezi ve farelerde tolerans gelişimini incelemek için bir protokol açıklar. Naif ve morfin ile tedavi edilen hayvanların, termal ve mekanik nosiseptif yanıtların ölçümü dayanarak, ağrı duyarlılığı (hiperaljezi) 'de artışı ölçmek ve kronik opiat uygulama ile bağlantılı analjezi (tolerans) azalma sağlar. 

Video: Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Denge kullanarak Fare Motor Denge ve Koordinasyon Değerlendirme

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Nörobilim

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Diyabetik Sıçanlarda Termal Nosiseptif Eşik Hızlı Belirlenmesinde

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Visual Evoked Potential Recordings in Mice Using a Dry Non-invasive Multi-channel Scalp EEG Sensor

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable because of the plunger-spring-barrel structural facet and mechanical strengths resulting from metal materials. The whole process for acquiring the VEP responses in vivo from a mouse consists of four steps: (1) sensor assembly, (2) animal preparation, (3) VEP measurement, and (4) signal processing. This paper presents representative measurements of VEP responses from multiple mice with a submicro-voltage signal resolution and sub-hundred millisecond temporal resolution. Although the proposed method is safer and more convenient compared to other previously reported animal EEG acquiring methods, there are remaining issues including how to enhance the signal-to-noise ratio and how to apply this technique with freely moving animals. The proposed method utilizes easily available resources and shows a repetitive VEP response with a satisfactory signal quality. Therefore, this method could be utilized for longitudinal experimental studies and reliable translational research exploiting non-invasive paradigms.

We designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable. This paper describes the whole process from manufacturing the proposed EEG electrode to signal processing of visual evoked potential (VEP) signals measured on a mouse scalp using a dry non-invasive multi-channel EEG sensor.

Görsel uyarılmış potansiyel kayıtları bir kuru Non-invaziv çok kanallı kullanarak farelerde EEG sensör kafa derisi

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical and thermal stimuli. QST is used to determine normal dogs&#39; sensory thresholds and evaluate alterations in peripheral and central sensory pathways caused by various disease states, including osteoarthritis, spinal cord injury, and cranial cruciate ligament rupture. Mechanical sensory thresholds are measured by electronic von Frey anesthesiometers and pressure algometers. They are determined as the force at which the dog exhibits a response indicating conscious stimulus perception. Hot thermal sensory thresholds are the latency to respond to a fixed or ramped temperature stimulus applied by a contact thermode.
Following a consistent protocol for performing QST and paying attention to details of the testing environment, procedure, and individual study subjects are critical for obtaining accurate QST results for dogs. Protocols for the standardized collection of QST data in dogs have not been described in detail. QST should be performed in a quiet, distraction-free environment that is comfortable for the dog, the QST operator, and the handler. Ensuring that the dog is calm, relaxed, and properly positioned for each measurement helps produce reliable, consistent responses to the stimuli and makes the testing process more manageable. The QST operator and handler should be familiar and comfortable with handling dogs and interpreting dogs&#39; behavioral responses to potentially painful stimuli to determine the endpoint of testing, reduce stress, and maintain safety during the testing process.

This work describes a standard protocol for mechanical and hot thermal quantitative sensory testing to evaluate the somatosensory system in dogs. Sensory thresholds are measured using an electronic von Frey anesthesiometer, pressure algometer, and hot contact thermode.

Mekanik ve Sıcak Termal Kantitatif Duyusal Test Kullanılarak Köpeklerde Duyusal Eşiklerin Değerlendirilmesi

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

Spinal Nosiseptif Devrelerde Ağ Aktivitesini Mikroelektrot Dizileri Kullanarak Kaydetme

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using reflexive tests that allow inferences regarding pain's nociceptive component but provide little information about the affective or motivational component of pain. Developing tests that capture these components of pain are therefore translationally important. Hence, researchers need to use non-reflexive behavioral assays to study pain perception at that level. Mechanical conflict-avoidance (MCA) is an established voluntary non-reflexive behavior assay, for studying motivational responses to a noxious mechanical stimulus in a 3 chamber paradigm. A change in a mouse's location preference, when faced with competing noxious stimuli, is used to infer the perceived unpleasantness of bright light versus tactile stimulation of the paws. This protocol outlines a modified version of the MCA assay which pain researchers can use to understand affective-motivational responses in a variety of mouse pain models. Though not specifically described here, our example MCA data use the intraplantar complete Freund's adjuvant (CFA), spared nerve injury (SNI), and a fracture/casting model as pain models to illustrate the MCA procedure.

The mechanical conflict-avoidance assay is used as a non-reflexive readout of pain sensitivity in mice which can be used to better understand affective-motivational responses in a variety of mouse pain models.

Farelerde Ağrı Davranışını Ölçmek için Mekanik Çatışmadan Kaçınma Testi

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

Farelerde Kraniyal Pencere Cerrahisi için Robotla Delinmiş Kraniotomiden Kaynaklanan Termal Hasarın Değerlendirilmesi

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...