Yazarlar Armenise-Harvard Vakfı, Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), Trento (Ecomm) Özerk Eyaleti ve finansman için CIBIO kabul.

1. DNA Şablon hazırlanması <ol><li> E. standart bir laboratuar gerilme plazmid arıtınız örneğin E. coli gibi, coli DH5a veya bir ticari kit ile Nova Mavi. Alternatif olarak, doğrusal bir PCR ürünü, benzer şekilde, ticari bir kit ile daha da arıtılabilir. Sadece H 2 O ile DNA Zehir. </li><li> Fenol-kloroform DNA çözümü 26 ayıklayın. </li><li> UV emme ya da diğer uygun yöntemlerle, örneğin DNA konsantrasyonu ve saflığı belirlemek. Bu, transkripsiyon, çeviri için son derece etkili bir saf DNA kullanılması önemlidir. </li></ol> 2. İnce Lipid Film hazırlanması <ol><li> Kuru lipid toz tartmak ve çözücü içinde çözülür. 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) için, stok çözeltileri, 40 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda kloroform içinde hazırlanır. Not: Organik çözücü madde her zaman cam pipetler ve şişeler ile ele alınması gerekir. Diğer bir deyişle, plastik kesinlikle kullanılmamalıdır. Mağaza stercihen argon altında, -20 ° C &#39;de hava geçirmez, çözücü dayanıklı amber cam şişeler içinde tak çözümler. </li><li> 5 ml&#39;lik bir yuvarlak tabanlı şişe içine kısım 12 mmol POPC (40 mg / ml stok çözeltisinden 220 ul). </li><li> Ince bir lipid filmi elde etmek için bir döner buharlaştırıcı (Şekil 1) ile birlikte çözücü buharlaşır. <ol><li> Güvenli şekilde dairesel bir klip ile damıtma tüp yuvarlak tabanlı şişeye takmak ve şişenin dönüş başlar. </li><li> Kondansatör bobin suyun dolaşımı başlatmak. Kloroform 61.2, düşük bir kaynama noktası ° C, normal atmosfer basıncında olduğu için bir ısıtma banyosu kullanarak, gerekli değildir. </li><li> Sistem musluğunu açık olduğunu kontrol ederek atmosfere açık olduğundan emin olun. Vakum pompası açın ve yavaş yavaş sisteme vakum uygulamak için valfli yakın. </li><li> Ince bir lipid filmi opak bir filmin oluşturulması için döner buharlaştırma sırasında yuvarlak tabanlı şişeye duvarlarında yatırılırBu gözle görülebilir. Döner buharlaşma 0.5-2 saat devam edelim. Süreci durdurmak için, yavaş yavaş, vakum basıncı serbest değiştirilmesini durdurmak ve yuvarlak tabanlı bir şişe çıkarın. </li></ol></li></ol> 3. Lipid Tekrar Süspansiyonu ve veziküllü Homojenizasyon <ol><li> Direk tabanı yuvarlak bir şişeye ince lipid filmi için, 1 ml 2 M 18.2 H O ekleyin. Maksimum hızda şiddetle vorteks çözüm, yaklaşık 3.200 rpm, lipid filmi gözle gözlemlenebilir cam, ayrılana kadar. </li><li> 2 mL mikrosantrifüj tüpü içine lipid dispersiyon aktarın. </li><li> Set-up bir halka bir 5 mm uçlu bir homojenizatör tutmak için stand. Güvenli bir şekilde tutmak için yağ dispersiyonu homojenleştirici altında bir mikrosantrifüj standı yerleştirin. 18.2 MQ H 2 O ucu çeker ve birkaç saniye çalıştırarak homojenizatör dağıtma elemanı durulayın. </li><li> Th sağlanması lipid dispersiyon içine doğrudan dispersiyon eleman yerleştirinucunda mikrosantrifüj tüp alt dokunmaz. Güç seviyesi 4 veya 14.000 rpm&#39;de 1 dakika homojenize. </li></ol> 4. Vezikül Ekstrüzyon ve Liyofilizasyon <ol><li> Bir dış kılıf oluşur mini-ekstruder (Şekil 2), ve iki teflon iç zar destekler, iki O-ring, ve bir Teflon yatak evler tutucu somun parçaları birleştirin. <ol><li> Iç membran desteklerin oluklar içine iki O-ring yerleştirin. Prewet iki filtre ve bir 400 nm membran. Filtreler aralarında membranı ile O-ring içinde teflon karşı yerleştirilir. </li><li> Membran O-halkalar arasında iki filtre ile çevrili bir membran ile ekstrüder dış kasa içine destekler yerleştirin. Muhafaza içinde teflon yatak yerleştirin ve tutucu somunu takın ve elle sıkın. </li></ol></li><li> Iki şırınga durulayın ve 18.2 M su ile bir doldurun. Küçük s içine şırınga iğneleri kaydedinekstruder düzeneğinin her iki ucundaki Teflon oles. Iğneler kolayca slayt gerekir, iğne zorlamayın. Ekstruder konut ve sıkın içine şırınga ile ekstruder sabitleyin. </li><li> Yavaş yavaş bir şırınga dışında ve diğer içine su iterek ekstrüzyon yoluyla su geçirin. Bu, bir pasaj temsil eder. Mevcut sızıntı vardır sağlamak üç pasajların toplam tekrarlayın. Su şırınga çıkarın ve su atmayın. </li><li> Numune ile bir şırınga ile doldurun, ekstrüdere bağlayın ve yukarıdaki adım 4.3 &#39;de açıklandığı gibi yavaş zarından vezikül çözeltisi geçmektedir. 11 pasajların toplam 10x tekrarlayın. Ekstrüzyon işlemi ilerledikçe, örnek daha az bulanık ve zar boyunca itmek için kolay olacaktır. Direncinde ani bir düşüş, ancak genellikle bir membran kırılması gösterir. </li><li> Ekstrüde vezikül çözüm aktarın ve mikrosantrifüj tüpleri içine veziküllerin 40 ul hacimde olun.Flaş kuru buz ya ya da sıvı azot her kısım dondurma. </li><li> 30 gecede bir santrifüj evaporatör ° C ile her kısım Lyophilize -20 ° C&#39;de liyofilize boş kesecikler Mağaza </li></ol> 5. Transkripsiyon-çeviri Makine Kapsüllenen <ol><li> Transkripsiyon yapıldı reaksiyon bileşenleri karıştırmak ve RNaz inhibitörü, 20 adet ekleyin. Buz üzerinde inkübe edin. </li><li> DNA şablonu ekleyin. Bir kontrol reaksiyonu için, 250 bir plazmid kodlayan mVenus ng veya bir T7 promotörü arkasına transkripsiyonel benzer bir floresan protein ve güçlü E. coli, ribozom bağlanma yeri tavsiye edilir. </li><li> RNase içermeyen su ile nihai hacim 25 ul getirin. </li><li> Adım 5.3 &#39;de monte edilmiş, reaksiyon 10 ul ile liyofilize veziküllerin Hidrat bir kısım (adım 4.6&#39; dan itibaren). Kısaca vorteks karışım veziküller yeniden süspanse kadar. Bu en az 30 saniye almalıdır. </li><li> 3 boyunca buz üzerinde inkübe edilir, reaksiyon0 dakika veziküller şişmeye izin vermek. </li><li> 50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, pH 7.4 ile 27.0 ml ve 20.2 mg / ml Proteinaz K DNaz ve RNaz 1.5 ul içine veziküllerin 1.5 ul ekleyerek 30 ul son hacim olması için 20 kat vezikül seyreltin Proteinaz K alternatif extravesicular malzeme düşmesine aynı zamanda bu noktada ilave edilebilir. </li><li> 37, en az 2.5 saat boyunca inkübe ° C. </li></ol> 6. Mikroskopla inceleme <ol><li> Farklı zaman noktalarında veziküller ve floresan protein üretim ilerleme inceleyin. Veziküller 400 nm vezikül ekstrüzyonu için kullanılan membranın gözenek boyutundan daha büyük bir çapa sahip olacaktır. <ol><li> Standart bir mikroskop lamı üzerine bir 20 x 5 mm silikon ayırıcı koyarak bir örnek odası hazırlayın. Örnek odasına veziküllerin Pipet 10 ul. Odanın içinde bir silikonlu cam kapak kayma yerleştirin. </li><li> Bir 63X yağ dağılımı o ile veziküller dikkatsömürülen floresan protein için uygun filtre seti kullanılarak parlak bir alan ve floresan mikroskobu ile r benzer amaçlı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Hücre içermeyen sentetik biyoloji henüz emekleme aşamasında olmasına rağmen, gelişmeler giderek daha karmaşık hücre-benzeri sistemler yapılabilir hangi bir temel atılmıştır var. Veziküller 28 tam olarak tanımlanmış bileşenler 9 içeriden transkripsiyon-çeviri makine sulandırma çevreye duyarlı yapay cells17, 18 inşa daha sonra çabaları kolaylaştırmak özellikle anlamlıydı. Benzer şekilde, yapay hücre çalışmaları evrimsel süreçleri 4,29,30 soruşturma için kullanılmıştır, mekanik RNA ayrıntıları ve protein sentezi 22,31, metabolik load32, 33 etkiler ve viral parçacıkların 34 montaj. Önemli olarak, yeterli bilgiye şimdi temel hücresel işlev, bu daha önceki raporlar ve burada tarif edilen protokollere yapılan aşağıdaki laboratuar vezikül içinde yeniden tesis edilebilir bulunmaktadır. , Anlatılan kapsülleme pr kolay olmasının yanı sıra,ocedure birçok faydası vardır. Örneğin, çok sayıda boş, liyofilize edilmiş bir vezikül alikotları önceden yapılabilir ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanır. Protokol organik çözücüler, ciddi sıcaklık değişiklikleri, ya da diyaliz uzun süre tabi olmayan biyolojik moleküllerin yok. Biz gerektiği gibi prosedürün yumuşaklığı ek bileşenlerin dahil kolaylaştıracaktır bekliyoruz. Ayrıca kapsülleme veya transkripsiyon-çeviri verimlilik membran lipid bileşimi değişen yan etkiler gözlenen değil. Bu nedenle, membran proteinleri, belirli morfolojileri veya görselleştirme ile birleşmesiyle daha yumuşak lipidler makul yararlanılabilir. Anlatılan yöntemin başlıca sınırlaması edilen veziküllerin boyutu veya lameller, homojen olmayan olmasıdır. Birçok uygulama için, bu zorlukların verilerin yorumlanması karışmaz. Bununla birlikte gerekirse, ek adımlar dar inci dahil edilebilirE boyut dağılımı ve kapsülleme sonra böyle ekstrüzyon daha fazla mermi olarak membran katmanları, azaltmak, donma-çözülme, ya da diyaliz 35. Bu ve diğer sorunları aşmak Kuşkusuz daha iyi yöntemler geliştirilecektir. O zamana kadar, biz protokol de hücresel taklit yapımı için uygun olması için burada açıklanan bulabilirsiniz.

Hücre içermeyen, in vitro transkripsiyon yapıldı reaksiyonlar ve sentetik lipidlerden veziküllerin üretilmesi yeni bir şey değildir. Ancak, taklit bir cep içine iki birleştirerek challenging1-6 önemli ölçüde daha fazladır. E. T7 RNA polimerazı ile veya coli hücre ekstreleri transkripsiyon yapıldı makine 7,8 kaynağı olarak kullanılabilir. Protein ekspresyonu ve katlanmasını kolaylaştırmak ek hücre bileşenlerinin varlığı hücre ekstreleri yarar. Alternatif olarak, tek tek saflaştırılmış RNA ve protein moleküllerinin bir karışımı, saf bir sistem, yani 9 İntraveziküler protein sentezi 4,10-14 aracılık etmek için kullanılabilir. Saf bir sistem tam olarak tanımlanmış hücresel taklit yapımı için izin verir ve hücre ekstreleri bulunan nükleaz aktivitesi muzdarip değildir. Pratik olarak, bu sayede düşük kapsülleme etkinliği 11 ile süreçleri kolaylaştıran, daha az DNA şablonu gerekli olduğu anlamına gelir </sup&gt;. Daha az sıklıkla kullanılmasına rağmen, hücresel taklit ökaryot cells15 elde edilen hücre ekstreleri ile inşa edilebilir. Bugüne kadar, çevre anlamda genetik olarak kodlanmış kapsüllü şelaleler ve hücresel taklit 16-18 bildirilmiştir. Transkripsiyon-çeviri reaksiyonları izlemek için en basit yolu genetik olarak kodlanmış unsurların floresan veya lüminesans ölçmektir. In vitro reaksiyonlar sıklıkla radyo-etiketleme ile ölçülür, ancak tipik olarak, ateşböceği lusiferaz 19 veya GFP kullanılır. Floresan algılama ayrıca böylece biyolojik benzeri süreçlerin stokastik doğası içine bazı bilgiler sunan, sitometri tabanlı yöntemlerle veziküller 20,21 nüfusu en izlenmesi için izin verir. Bu izleme yöntemleri i ile uyumlu floresan proteinleri bir toplama dahil tasarım kurallarının küçük bir set ve hangi gelen oluşturmak için parçaları bir kütüphane, tanımlamak için kullanılmıştırN in vitro transkripsiyon ve çeviri-22, ifade 22 genetik kuruluşun etkisi, sigma faktörleri 16 aktivitesini ve transkripsiyonel terminatörler 23 verim. Bununla birlikte, çok in vitro öngörülebilir inşa yeteneği, genetik olarak kodlanmış cihazlar artırmak için yapılması gereken orada kalır. Veziküller yapmak için pek çok yöntem vardır. En sık kullanılan yöntem, sulu solution24 tabanda tarafından izlenen bir cam yüzeyi üzerinde ince bir lipid filmi üretimi bağlıdır. Sulu çözelti transkripsiyon yapıldı makine içeriyorsa, örneğin, daha sonra veziküllerin bir kısmını oluşturduğu protein üretimi için gerekli olan bileşenler içerebilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin kapsülleme etkinliği veziküllerin sadece küçük bir yüzdesi aktif olduğunu, yani düşüktür. Alternatif yöntemlerin çoğu, çok daha yüksek bir kapsülleme eff ile karakterizeiciency veziküller su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıklarının dönüşüm kullanılması. Bu tür yöntemler ileride olağan olması muhtemeldir olsa da, şu anda bu yöntemlerin özel ekipman ihtiyacı muzdarip ve değişmiş membran bileşimler ile 25 veziküller verir. Vezikül yöntemlere su-içinde-yağ bir avantaj membran lameller kontrol etmek için potansiyeldir. Burada tarif edilen yöntem, ek bir homojenleştirme adımı da dahil olmak üzere hafif değişiklikler ile Yomo laboratuar 11 tarafından tarif edilen ince bir lipid filmi protokolüne dayanmaktadır. Bu yöntem, kolay, ucuz, ve de transkripsiyon yapıldı makine kapsüllenmesi için uygundur sağlam veziküller verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Bireysel moleküllerden moleküllerin sistemlerine ilgi vardiya olarak, laboratuvar giderek artan sayıda daha iyi hücresel yaşamın karmaşıklığı temsil hücresel taklit aşağıdan yukarıya doğru inşa etmek için çalışmışlardır. Su-içinde-yağ emülsiyonları, mikroakışkan cihazlar, ve kabarcıklar dahil olmak üzere, işleme bölümlere ayrılmış hücresel taklit oluşturmak için alınabilir yolları bir dizi vardır, bugüne kadar. Mevcut seçeneklerden her biri belirli avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, su-içinde-yağ emülsiyonları yüksek bir kapsülleme etkinliği vermek değil de canlı hücre geçirgenlik bariyeri taklit ederler. Bu tarifnamede tarif edilen metotların en önemli avantajı, bunların hepsi kolay ve uygulamak için ucuz olmasıdır. Transkripsiyon-çeviri makine böyle bir santrifüj evaporatör ve bir ekstruder olarak ortak enstrümantasyon, sömüren bir süreç fosfolipid veziküller içinde kapsüllenir. Reaksiyonları floresans spektroskopisi ile izlenmektedir. Protokols rekombinant protein ekspresyonu, hücre taklit yapımı, hücresel yaşam için minimum gereksinimleri arama, ya da genetik devre montajı için adapte edilebilir.

Flüoresans mikroskobu extravesicular malzeme enzimatik olarak bozulmuş olduğu için bu floresans sadece (Şekil 3), kesecikler içinde görülmektedir ortaya koymaktadır. MVenus ifadesi için, İntraveziküler floresan 37 ° C&#39;de 1.5 saat sonra, görülmeye başlar ve 6 saat içinde maksimum floresans yoğunluğunu ulaşır. Uygun sıcaklık ve inkübasyon süresi, kullanılan özel yapıları bağlı olarak değişebilir. Örneğin, farklı floresan proteinleri bir sıcaklıkta bağımlı bir şekilde çok farklı olgunlaşır. Diğer bir deyişle, protein üretim gözlem protein sentezi ve katlama üzerine değil, aynı zamanda kromofor oluşumu sadece bağımlı değildir. Genel olarak protein sentezi transkripsiyon ve çeviri için gerekli olan 27 azaltılmış ürün akışı için izin vermek için membran proteini içeren gözenekler artırılabilir. Bu benzer bir transkripsiyon-translasyon yürütmek için tavsiye ediliryararlanan genetik yapı işlevsel olduğundan emin olmak için vezikül yokluğunda yon reaksiyonu. Bu kontrol Reaksiyon daha kolay fluoresans spektroskopisi yerine mikroskopisi tarafından izlenir. Şekil 4, bir yapı kodlama mVenus in vitro transkripsiyon, çeviri reaksiyonunda bir göstermektedir. Kesilmemiş reaksiyonlar benzer İntraveziküler reaksiyonlar çok daha yüksek toplam floresan yoğunlukları verir. Toplam hacmi İntraveziküler extravesicular hacmi (yani seyreltme etkisi) &#39;den daha az olduğu için bu kapsülleme etkinliği nedeniyle ve. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. Döner buharlaştırıcı ve vakum pompası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . Şekil 2.. Konut ve ekstruder parçaları ayrı ayrı gösterilir. Soldan sağa, şırınga, tutucu somun, teflon rulman, iç membran birbirine bakan siyah O-ring, ekstruder dış kaplama, ve ikinci şırınga ile destekler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resim için tıklayınız</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Lipozomlarda mVenus protein üretimi Şekil 3 Floresan görüntüleri A ve C:.. Çok katmanlı veziküller Aydınlık alan görüntüleri 1.5 saat ve 2.5 saat sonra B ve &amp;# 160; D: mVenus üretimi floresan (yeşil renkli) 1.5 ve 2.5 saat, sonra sırasıyla görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resim için tıklayınız</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Şekil 4,. MVenus in vitro transkripsiyon ve çeviri kapsüllenmemiş in vitro kontrol reaksiyonu. Flüoresan yoğunluğu, 4 saat boyunca her 5 dakikada bir ölçüldü. Veriler bir Real-Time PCR cihazı ile elde edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resim için tıklayınız</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Bu yazıda veziküller, transkripsiyon ve çeviri makine kapsülleme ve protein üretiminin izlenmesi hazırlanması için basit bir yöntem tarif eder. Elde edilen hücre-içermeyen sistemler gittikçe daha karmaşık hücresel taklit oluşturmak için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir.

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Görüntüleme.  University of Trento.  Bu yazıda veziküller, transkripsiyon ve çeviri makine kapsülleme ve protein üretiminin izlenmesi hazırlanması için basit bir yöntem tarif eder. Elde edilen hücre-içermeyen sistemler gittikçe daha karmaşık hücresel taklit oluşturmak için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. 

Video: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Biyomühendislik

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Hücresel Elektrik Mikroçevriminin Sonlu Eleman Modellemesi

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...