Yazarlar, Rioja Salud Vakfı (Fondos FEDER) ve İspanya Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00) desteğine teşekkür etmek istiyor. Cristina Romero Aranda, AECC'den (Asociación Española Contra el Cáncer) bir burs ile finanse edilmektedir.

1. Petri tabaklarında C. elegans yetiştirin
<ol><li>NGM plakaları hazırlayın ve besin kaynağı olarak E. coli OP50 ile tohumlayın (Şekil 1). C. elegans'ı tarif edildiği gibi büyütün ve koruyun17. Tohumlanmış plakaları 4 ° C'de bir aya kadar saklayın.</li>
	<li>Solucanları eklemeden önce plakaları istenen sıcaklığa ayarlayın.<ol>
<li>Solucanları aktarmak için, eski bir plakadan bir parça agar çıkarın ve taze bir tabağa yerleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, steril bir solucan toplayıcı (bir Pasteur pipetinin ucuna monte edilmiş, düzleştirilmiş bir ucu olan 1 inçlik 32 gauge platin tel parçası) ile tek hayvanları yakalayın ve yeni plakaya yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanları istenen sıcaklıkta büyütün.<ol>
<li>C. elegans solucanlarını standart sıcaklık olan 20 ° C'de büyütün. Bununla birlikte, ısıya duyarlı mutantların gelişimini analiz etmek için, genellikle 25 ° C'de bir gece inkübasyonu gerçekleştirin. Belirli mutantlara bağlı olarak, bu inkübasyonun süresini ve sıcaklığını gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Embriyoları monte etmeden önce 4D mikroskopi kaydını hazırlayın (Şekil 2)
<ol><li>Embriyoyu hazırlamadan önce mikroskop ve sıcaklık kontrollerini ayarlayın. C. elegans embriyoları çok hızlı bir şekilde bölünür. Embriyoları monte ettikten hemen sonra kayda başlamaya hazır olun.</li>
	<li>Kayıt sıcaklığını 15 °C, 20 °C veya 25 °C olarak ayarlayın.<ol>
<li>Embriyoları rutin olarak 25 ° C'de kaydedin. Fenotiplerini göstermek için ısıya duyarlı mutantları kısıtlayıcı sıcaklıkta kaydedin. Bir WT kontrolünü (farklı bir preparatta yapılırsa) mutantlarla aynı sıcaklıkta kaydedin. NOT: WT embriyoları, hücre soyunda ek farklılıklar olmaksızın 25 ° C'de daha hızlı ve 15 ° C'de daha yavaş gelişir. Mikroskopları sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirin. Sürgüyü soğutarak veya ısıtarak ek kontrol son derece arzu edilir. Bu, suyun mikroskop hedefi ve kondenserin etrafındaki metal bir halka aracılığıyla belirli bir sıcaklıkta dolaştırılmasıyla sağlanabilir. Amaç ve hazırlık, daldırma yağı ile doğrudan temas halindedir ve sıcaklık transferi verimlidir. Bu sistem, kayıt sıcaklığının hassas bir şekilde kontrol edilmesini ve embriyo gelişimi sırasında sıcaklık değişimlerinin gerçekleştirilmesini sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopi yazılımında kayıt parametrelerini tanımlayın.<ol>
<li>Standart bir C. elegans kaydı için (floresan taramaları olmadan) şunları seçin: Her biri 1 mikron mesafede 30 odak düzleminden oluşan z-yığınları. Her z-yığınının başlangıcı arasında 30 saniyelik aralıklar. 1500 z-yığını (12,5 saatlik kayıt). NOT: Hem ticari hem de açık kaynaklı mikroskop kontrol programları, görüntüleri yakalamak için bu iş akışını tanımlamak için kullanılabilir. Şimdi mikroskop kaydetmeye hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embriyoları hazırlayın ve monte edin
<ol><li>Güzel bir görüntü elde etmenin ilk adımı olarak ince, homojen bir agar pedi hazırlayın (Şekil 3).<ol>
<li>Deiyonize suda 50 ml% 4.5'lik bir agar çözeltisi hazırlayın. Mikrodalgada kaynamaya ısıtın ve 3 ml'lik cam tüplere 0.5 – 1 ml dökün.</li>
		<li>Kurulaşmayı önlemek için tüpleri balmumu filmi ile dikkatlice kapatın. Kapalı agar tüpleri oda sıcaklığında iki aya kadar saklanabilir.</li>
		<li>Laboratuvar tezgahında, 80 ° C'de bir ısı bloğuna sahip olun: içinde ince bir boya fırçası bulunan saf petrol jölesi (erimiş) bir test tüpü. Pasteur pipet içeren damıtılmış su içeren bir test tüpü. NOT: Bu, gerekli tüm malzemelerin sıcak olmasını ve agarın pedi yapma sürecinde katılaşmamasını sağlar.</li>
		<li>Balmumu filmini agar tüplerinden birinin üstünden çıkarın ve agar'ı eritmek için bir alkol brülörü üzerinde dikkatlice ısıtın. Cam tüpten atılan sıcak agar yanıklara neden olabileceğinden dikkatli olun.</li>
		<li>Agar eritildikten sonra, agar'ı sıvı halde tutmak için tüpü ısı bloğuna yerleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, agar tüplerini bir brülör kullanmadan eritmek için deneyden 1 saat önce ısı bloğuna yerleştirin. Erimiş agar bir gün sonra atılmalıdır.</li>
		<li>Bir plastik parçası üzerine diğer iki kişi arasına bir mikroskop slaytı (Slayt A) yerleştirin.</li>
		<li>Başka bir slayt alın (Slayt B) ve bir elinizde parmaklarınızla tutun.</li>
		<li>Öte yandan, sıcak Pasteur pipetini kullanarak Slayt A'nın ortasına küçük bir damla erimiş agar yerleştirin.</li>
		<li>Slaytlar A ve B arasında çok ince bir ped oluşturmak için hemen B slaytını agar damlasına bastırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoları monte edin.<ol>
<li>Toplayıcı ile 5-10 gravid hermafrodit toplayın ve bunları suyla dolu bir saat ustası bardağına yerleştirin.</li>
		<li>Hermafrodit nematodlarını kesmek ve stereomikroskop altında uterustan erken yumurtaları (1-4 hücre) çıkarmak için bir neşter kullanın.</li>
		<li>3.1.10 adımındaki slaytı alın ve agar pedini Slayt A'da göstermek için yavaşça Slayt B'yi kaydırın.</li>
		<li>Kılcal bir tüp ile pipetleyerek agar pedinin ortasına erken bir yumurta yerleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, agar pedine bir dizi embriyo içeren bir damla pipet yerleştirin ve daha sonra erken evre embriyoları arayın. Bu adımı stereomikroskop altında yapın.</li>
		<li>Gerekirse, yumurtayı kürdanın ucuna yapıştırılmış bir kirpikle dürterek hareket ettirin.</li>
		<li>Kılcal pipetle fazla suyu çıkarın. NOT: Bir kılcal pipet, bir Pasteur pipeti bir alkol brülörü üzerinde ısıtıp her iki ucundan çekerek kolayca hazırlanabilir.</li>
		<li>Hazırlığı dikkatlice bir kapak fişi ile örtün. Hava kabarcıklarını önlemek için, kapak kaymasının bir kenarını slaytın üzerine yerleştirin ve kapak kaymasını yavaşça ve eğik bir şekilde preparasyona örtmek için bitişik kenar boyunca bir neşteri yavaşça kaydırın.</li>
		<li>Agar pedini çevreleyen alanın 3/4'ünü suyla doldurmak için pipet kullanın. Alanın 1 / 4'ünü hava ile bırakın.</li>
		<li>Uzun kayıt süreleri boyunca kurumasını önlemek için kapak kapağını petrol jölesi ile kapatın.</li>
		<li>İnce fırçayı, ince bir erimiş petrol jölesi tabakasını kapak kapağının kenarına uzatmak için kullanın. NOT: Şimdi hazırlık kayıt için hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DIC'yi ayarlayın ve 4D mikroskopi kaydını başlatın
<ol><li>Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin. Düşük büyütme hedefini (5x veya 10x) kullanarak embriyoyu odaklayın.</li>
	<li>100x daldırma hedefine geçin.</li>
	<li>Nomarski görüntüsü elde etmek için mikroskobun optik bileşenlerini ayarlayın.<ol>
<li>Kondenseri odaklayın.</li>
		<li>Kondenserin diyaframını tamamen açın ve alan diyaframını kapatın (bu, daha yüksek bir sayısal diyafram açıklığı ve dolayısıyla daha yüksek çözünürlük sağlayacaktır).</li>
		<li>Mikroskoptaki her iki polarizörün de maksimum ışık sönmesine neden olacak şekilde yönlendirildiğini kontrol edin.</li>
		<li>Wollaston prizmasını çevirerek embriyonun bir taraftan aydınlatılmış üç boyutlu güzel bir görüntüsünü elde edin. Embriyonun diğer tarafta aydınlatılmasının etkisini elde etmek için prizmayı diğer yöne çevirin. NOT: Bu adımlar, kayıttan önce bir test numunesi üzerinde gerçekleştirilebilir, böylece analiz edilen numunede yalnızca ince ayar yapılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü yakalamayı mikroskopta başlatın.</li>
</ol>5. 4D filmi analiz edin (Şekil 4).
NOT: Kayıt tamamlandıktan sonra, hücre kökenini yeniden yapılandırmak ve analiz etmek için hücre kökeni izleme yazılımını kullanın.
Hücre soyu izleme yazılımı, hücre kültürlerindeki veya doku fragmanlarındaki embriyonik gelişim veya dinamiklerin ayrıntılı analizlerini yapmak için güçlü bir araçtır. Program, hücre bölünmeleri, hücre döngüsü uzunluğu, göç veya apoptozun yanı sıra kinetiği de dahil olmak üzere, kaydedilen her hücrenin tam hücre soyunun oluşturulmasını içeren numunenin hücresel dinamikleri hakkında çeşitli veri setlerini çıkarır ve nicelleştirir. Ek olarak, hücre farklılaşması, hücrenin morfolojik değişiklikleri veya spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile puanlanabilir. Temel olarak, yazılım ekranı iki pencere görüntüler: sol pencerede, 4D film ileri ve geri veya yukarı ve aşağı üst veya alt seviyelere oynatılabilir, böylece her hücre kayıt boyunca zaman ve mekanda takip edilebilir. Sağ dulda, hücre soyu oluşturulur. 4B filmde bir hücre çekirdeğine tıklamak, soy penceresinde hücre adı, kaderi ve uzamsal koordinatların bilgilerini depolayan bir nokta oluşturur. Belirli bir hücrenin hücre soyundan, 4B filmi ileri doğru oynatarak ve zaman içinde o belirli hücrenin mitozunu işaretlemek için periyodik olarak çekirdeğe tıklanarak oluşturulur. Kaydedilen hücrelerin her biri için bu işlemin tekrarlanması, embriyonun veya numunenin tam hücre soyunu oluşturur. Her hücrenin uzamsal koordinatları için depolanan bilgiler daha sonra 3B embriyo modellerini ve hücre göç yollarını yeniden yapılandırmak için kullanılır.
<ol><li>Soy izleme yazılımını açın ve üst çubuk menüsüne gidip aşağıdakileri seçerek yeni bir proje oluşturun: Dosya | Yeni proje.</li>
	<li>Kayıt sıcaklığına bağlı olarak hücre soyağacı şablonunu seçin: 25 °C'de kayıt için DB08, 20 °C'de kayıt için DB10 ve 15 °C'de kayıt için DB12.</li>
	<li>Ortaya çıkan pencerede kayıt parametrelerini ayarlayın: tarama sayısı (genellikle 1500), taramalar arasındaki süre (30 saniye), düzey sayısı (30) ve düzeyler arasındaki mesafe (1 mikron).</li>
	<li>Görüntü dosyasını ve biçimini seçin.<ol>
<li>Görüntülerin kaydedildiği görüntü dizinini seçin.</li>
		<li>Görüntülerin tek görüntü (düzey ve zaman başına bir görüntü) olarak mı yoksa çok görüntülü z yığınları olarak mı kaydedileceğini seçin.</li>
		<li>Dosya adını ve görüntü biçimini belirleyin. Rutin olarak, tek görüntüler aşağıdaki adlar altında kaydedilir: X0000L00C1 (tarama 0, seviye 0, kanal 1 için) X0000L01C1 (tarama 0, seviye 1, kanal 1 için) X0000L02C1 (tarama 0, düzey 2, kanal 1 için) ... X0001L00C1 (tarama 1, düzey 0, kanal 1 için) X0001L01C1 (tarama 1, düzey 1, kanal 1 için) ... X0300L04C1 (tarama 300, seviye 4, kanal 1 için) ... NOT: Görüntüleri sıkıştırılmış bir biçimde kaydetmek, sabit diskinizde yer tasarrufu sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işık kanallarını tanımlayın: DIC optikleri için 1, GFP için 2, RFP için 3, vb. 4B kayıtta kullanılanları ekleyin. Bunları tespit etmek için "kanal işleme etkin" i tıklayın.</li>
	<li>Embriyonun hücre soyunu izlemeye başlayın. Ekran artık iki ana pencere içeriyor: video penceresi ve hücre kökeni penceresi.<ol>
<li>Soy penceresinde, bir soy dalı seçin ve video penceresinde bu hücreye karşılık gelen hücre çekirdeğini tıklatmak için fareyi kullanın.</li>
		<li>İmleç tuşlarını kullanarak 4B filmi ileri, geri veya yukarı veya aşağı bir seviyede oynatarak hücreyi uzamsal olarak ve zaman içinde takip edin.</li>
		<li>Periyodik olarak hücre çekirdeğine tıklayın. Bu, soy dalında bir nokta oluşturur ve şu anda hücrenin uzamsal koordinatlarını kaydeder. Sonuç olarak, hücre soyu ilerler ve embriyonun 3D rekonstrüksiyonları mümkündür.</li>
		<li>return tuşuna tıklayarak mitozu işaretleyin. Ardından yavru hücrelerden birini seçin ve daha önce olduğu gibi izleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyonik hücrelerin geri kalanının tüm hücre soyunu izlemesi veya apoptoz geçirenler gibi ilgilenilen spesifik hücreleri takip etmesi için işlemi tekrarlayın (5.6.1 ila 5.6.4 arasındaki adımlar).</li>
	<li>Mutant soyu kalıplaşmış WT C. elegans hücre soyu ile karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Modern biyolojideki en büyük zorluklardan biri, çok hücreli organizmaların gelişimini anlamaktır. C. elegans, gelişmekte olan embriyoda hücre çoğalması ve hücre farklılaşması arasındaki ince koordinasyonu incelemek için en uygun modellerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Optik açıdan bakıldığında, şeffaf gövdesi ve küçük boyutu bu nematodu DIC mikroskobu için ideal bir örnek haline getirir. Benzer özelliklere sahip diğer organizmalar da 4D mikroskopi analizine tabi tutulmuştur 11,12,13,14,15,16.
Bu gelişimsel çalışmalar için, ileri veya geri genetik ile gen inaktivasyonu, embriyogenezdeki katılımına dair bir ipucu sağlar. Bir genin gelişimde rol oynadığı kanıtlandıktan sonra, bir sonraki adım, doğru vücut planının oluşturulmasındaki rolünü tanımlamaktır. İmmün boyama çoğu model için seçilen yaklaşımdır. Bu teknik, hücre farklılaşmasındaki veya spesifik belirteçlerin ekspresyonundaki sorunları aydınlatır. Bununla birlikte, bu yaklaşımın önemli bir sınırlaması, yalnızca gelişimin sabit bir noktasında tek veya daha fazla işaretleyicinin ifadesinin statik bir görünümünü sağlamasıdır. Bu belirteçlerin gelişim boyunca dinamik bir görünümü ancak farklı embriyoların farklı zaman noktalarında boyanmasıyla elde edilebilir. Ek olarak, bu tür sabit örneklerde hücre soyu rekonstrüksiyonu mümkün değildir.
4D mikroskopi, embriyonik gelişimi incelemek için tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Bu teknik, hücre düzeyinde çözünürlükte gelişim dinamiklerini ortaya koymaktadır. Embriyodaki iğ oryantasyonundaki problemler, hücre göçü, apoptoz, hücre kaderi spesifikasyonu gibi herhangi bir kusur, araştırmacı tarafından ileri ve geri görselleştirilebilen, nicelleştirilebilen ve puanlanabilen bir 4D filmde ortaya çıkacaktır. Bu tekniği kullanarak, embriyodaki hemen hemen her hücre, embriyonun hareket etmeye başladığı ana kadar takip edilebilir. Sadece görünür ışık ve Nomarski optikleri ile 4D mikroskopiye tabi tutulan embriyolar fotohasara maruz kalmaz. Floresan taramalar, bir genin ne zaman ve nerede ifade edildiğini tespit etmek için kayıt içinde de birleştirilebilir. Önemli fotohasara maruz kalan embriyolar, standart bir WT soy embriyosuna kıyasla güçlü UV ışınlamasına neden olan hücre döngüsü uzantısı ile tanımlanır. Bu durumda, UV lamba yoğunluğunu düşürerek ve kamera hassasiyetini veya pozlama süresini artırarak fotohasar azaltılabilir. Morfolojik özellikler ve moleküler belirteçler, herhangi bir mutantın embriyonik gelişimini netleştirmeye yardımcı olabilir.
Bir 4D mikroskopi sisteminin kurulması laboratuarda uygulanması kolaydır ve bazı uygulamalardan sonra, hücre dinamiklerinin eşsiz bir analizini ve hücre kültürlerinin soy izlemesini ve mikroskop alanındaki her hücrenin çözünürlük seviyesinde yaşayan şeffaf örnekleri mümkün kılar. DIC görüntülerinde hücre soyağacı izleme hala elle işlenir. Zaman alıcıdır ve yazılım aynı hücreyi işaretleyen farklı soy dalları gibi soy hatalarını tespit etse de, hatalar mümkündür. GFP etiketli hücrelerin otomatik tespiti iyi geliştirilmiş2 olsa da, işaretsiz hücrelere ve görünür ışık görüntülerine dayanan tamamlayıcı soy izleme yazılımı hala erken aşamadadır ve tam bir embriyo analizi için gerçekten yararlı değildir. Hiç şüphesiz görüntü tanıma sistemlerinin görünür ışık mikroskobu alanına uygulanması bu alanda büyük bir ilerlemeyi beraberinde getirecektir.

4D mikroskopi, araştırmacıların biyolojik bir numunenin hücre dinamiklerini hem mekansal hem de zaman içinde kaydetmelerini ve ölçmelerini sağlayan çok odaklı bir hızlandırılmış kayıt sistemidir. Hücre kültürleri, mayalar veya canlı dokular 4D analize tabi tutulabilir, ancak bu teknik özellikle canlı embriyoların gelişimini analiz etmek için uygundur. Bu analizin çözünürlüğü, embriyonun her bir hücresinin seviyesine ulaşır. Her hücre bölünmesi tespit edilebilir ve hücre hareketleri zamanla izlenebilir. Hücre kaderleri, hücrelerin kazandığı konum ve şekle göre değerlendirilir. Nomarski optiklerinin kullanımı, odak düzlemine müdahale eden ortogonal polarize ışık huzmeleri kullanarak lekesiz şeffaf numunelerin kontrastını arttırır. Elde edilen görüntüler üç boyutlu görünür, bir tarafta aydınlatılır.
Çekirdeklerin otomatik tespiti ve hücre soylarının oluşturulması için konfokal mikroskopi ve GFP transgenik hayvanların kullanımına dayanan diğer yöntemler geliştirilmiştir 1,2. Bu sistemlerin avantajı açıktır: Yazılım, her çekirdeği belirli bir süre boyunca manuel olarak işaretleme ihtiyacını büyük ölçüde geçersiz kılar (geç aşamalarda bazı manuel denetimler gerekmesine rağmen). Bununla birlikte, hücre farklılaşması, göç, apoptoz veya ceset yutulması sırasında meydana gelenler gibi hücre şekli veya membran dinamiklerindeki değişiklikleri içeren hücresel süreçler, floresan etiketli çekirdek görüntülerinde siyah bir arka plan olarak gizli kalır.
Buna karşılık, 4D Nomarski mikroskobu (DIC mikroskobu, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu olarak da adlandırılır), vahşi tip veya mutant hayvanların gelişimi sırasında meydana gelen hem çekirdekleri hem de hücre şekli değişikliklerini gösterir. Bu, standart mikroskoplar kullanarak hücre soyağacı izlemesine izin verir ve yalnızca iletilen ışığı kullanır. Belirli ifade kalıplarını göstermek dışında transgenik hayvanları kullanmaya genel bir ihtiyaç yoktur, bu durumda floresan taramaları birbirine karışabilir. Bu nedenle, bu, DIC mikroskobu 3,4,5,6,7 altında vurgulanabilen embriyogenez veya apoptoz gibi dinamik hücre süreçleri üzerinde çalışan birçok laboratuvar için en uygun yaklaşım olabilir.
Mikroskobik görüntüleri yakalamak ve kaydedilen örnekte hücre soylarını, 3B modelleri, hücre geçiş yollarını vb. Yeniden yapılandırmak için çeşitli esnek ve kullanıcı dostu programlar mevcuttur. Standart bir deneyde, görüntüler, sayısı numune kalınlığına bağlı olan sabit bir mesafede, bir dizi odak düzleminde elde edilir. Analizin zamansal çözünürlüğü, tarama sıklığı artırılarak optimize edilebilir. Kayıt süresi için bilgisayar depolama kapasitesi dışında neredeyse hiçbir sınır yoktur. Örneğin, bir C. elegans embriyo gelişim analizi için, 12 saat boyunca her 30 saniyede bir 30 odak düzleminde (her biri 1 mikron adım) rutin olarak görüntüler elde ediyoruz.
Bu sistemler, Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster 11, diğer nematod embriyoları12,13, tardigradlar 14,15 ve hatta erken fare embriyoları 16 gibi çeşitli hayvan embriyolarının analizine uygulanmıştır. Tek şart, mikroskop altında slayt hazırlığında gelişebilen şeffaf bir embriyoya sahip olmaktır.
Özetle, DIC tabanlı 4D mikroskopi özellikle 1) küçük, şeffaf hayvanların embriyonik gelişimini analiz etmek için yararlıdır: hücre soyunun, hücre göç yollarının izlenmesi, 3D modellerin oluşturulması, vb. 2) gen ekspresyon kalıplarını tanımlamak; 3) mayadan insan hücrelerine kadar hücre kültürü dinamiklerini incelemek; 4) doku dinamiklerini veya embriyo parçalarını analiz etmek; 5) hücre ölümü kinetiğini ve ceset yutulmasını ölçmek; ve 6) embriyonik gelişimsel özelliklere dayalı karşılaştırmalı filojeni analizi yapmak. Bu konulardan herhangi birine (veya benzerlerine) ilgi varsa, 4D mikroskopi kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Cell Lineage Tracing software</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Motorized microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td></tr><tr><td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td></tr></tbody></table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

4D mikroskopi, farklı hayvanlarda embriyonik gelişim sürecini çözmek için paha biçilmez bir araçtır. Son yıllarda, Caenorhabditis elegans , gelişimi incelemek için en iyi modellerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Optik açıdan bakıldığında, boyutu ve şeffaf gövdesi bu nematodu DIC (Diferansiyel Girişim Kontrastı veya Nomarski) mikroskopisi için ideal bir örnek haline getirir. Bu makalede, C. elegans nematodlarının yetiştirilmesi, embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskopi ve hücre soyağacı takibinin yapılması için bir protokol gösterilmektedir. Yöntem, Nomarski görüntülerinin çok odaklı hızlandırılmış kayıtlarına ve belirli bir yazılımla yapılan analizlere dayanmaktadır. Bu teknik, hücresel düzeyde embriyonik gelişim dinamiklerini ortaya koymaktadır. Iğ oryantasyonundaki problemler, hücre göçü, apoptoz veya hücre kaderi spesifikasyonu gibi mutantlardaki herhangi bir embriyonik kusur etkili bir şekilde tespit edilebilir ve puanlanabilir. Embriyonun hemen hemen her bir hücresi, embriyonun hareket etmeye başladığı ana kadar takip edilebilir. Bir C. elegans embriyosunun tüm hücre soyunun 4D DIC mikroskopisi ile izlenmesi zahmetlidir, ancak belirli bir yazılımın kullanılması bu görevi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ek olarak, bu tekniğin laboratuvarda uygulanması kolaydır. 4D mikroskopi çok yönlü bir araçtır ve embriyonik gelişimin benzersiz bir analizini yapma olasılığını açar.

İndirgenmiş glutatyonu (GSH) yenilemek için gerekli olan ve nematodda redoks homeostazını sürdürmeye dahil olan glutatyon redüktaz enzimini kodlayan gsr-1 geni için bir C. elegans mutantının embriyonik gelişimini karakterize etmek için, erken embriyonik arrest fenotip18'e neden olan fonksiyon aleli olan bir gsr-1 (tm3574) delesyon mutantının 4D mikroskopisini gerçekleştirdik. Hem WT hem de dengeli gsr-1 (tm3574) mutant C. elegans nematodları, besin kaynağı17 olarak E. coli OP50 ile tohumlanan NGM plakalarında yetiştirildi. gsr-1 (tm3574) solucanları iki nesil boyunca 20 ° C'de heterozigot olarak yetiştirildi ve daha sonra homozigot solucanları ayıran (anne yükü sayesinde yetişkinliğe kadar büyüyebilen) embriyo analizinden önce bir gecede inkübasyon için 25 ° C'ye kaydırıldı. Yoğuşmayı önlemek için solucan plakalar karton kutular içinde inkübe edildi (Şekil 1). Genç embriyoları çıkarmak için gravid nematodları kesilerek açıldı.
Aynı koşullar altında mutantın embriyonik gelişimini stereotiplenmiş WT'ye karşı karşılaştırmak için, bir WT (kontrol olarak) ve bir gsr-1 (tm3574) embriyosu yan yana aynı preparasyona yerleştirildi. 4D mikroskopi iş akışı, DIC optikleri ile donatılmış standart bir motorlu dik mikroskop üzerinde çalıştırıldı. Mikroskop kontrol programında seçilen kayıt parametreleri şunlardı: her biri 1 mikron mesafede 30 odak düzleminin z-yığınları, her bir z-yığınının başlangıcı ile 1500 z-yığını arasında 30 saniyelik aralıklar (12.5 saatlik kayıt). Kayıt sıcaklığı 25 ° C'ye ayarlandı (hem odada hem de mikroskop aşamasında) (Şekil 2).
Kayıt tamamlandıktan sonra, görüntü dosyası açıldı ve video penceresinde gösterilen hücre çekirdeklerine tıklanarak soy izleme yazılımı kullanılarak hücre soyu yeniden yapılandırıldı (Şekil 4). İzlenen gsr-1 (tm3574) mutant embriyonik hücre soyu arka planda tasvir edilen C. elegans WT soyu ile karşılaştırıldı. Önemli bir sonuç, embriyonik gelişim sırasında hücre döngüsünün ilerleyici bir gecikmesinin tespit edilmesiydi. Sonuç olarak, mutant embriyolar ara aşamalarda tutuklanırken, WT embriyoları ilerledi ve sonunda larva olarak yumurtadan çıktı.
Embriyoların mikroskop altında hazırlanması ve doğrudan gözlemlenmesi veya geç embriyonik belirteçlere karşı antikorlarla immünoboyama, WT'ye kıyasla mutantta yüksek oranda genç embriyonun varlığını ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, hücre döngüsü gecikmesinin doğrudan kanıtı ve kesin nicelleştirilmesi, yalnızca bir 4D mikroskopi deneyi ile zarif ve kolay bir şekilde gösterilebilir. Hücre farklılaşması veya apoptoz gibi embriyonik gelişimin diğer önemli özellikleri (Şekil 5), tek bir deneyde gelişimin birçok yönünün ayrıntılı bir analizini sunan 4D mikroskopi kullanılarak dinamik bir şekilde görselleştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Şekil 1: C. elegans nematodları laboratuvar koşullarında yetişmektedir. Nematodlar E. coli tohumlu NGM plakalarında yetiştirilir, karton kutularda saklanır ve 15 °C, 20 °C veya 25 °<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">C'de</a> inkübe edilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Şekil 2: 4D mikroskopi kayıt yazılımının ekran görüntüsü. İki farklı mikroskop kontrol yazılımı programı örneği (A ve B). Bu programlar, 4D mikroskopi kaydı sırasında mikroskop ve görüntü yakalamayı kontrol etmek için iş akışları oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Resim 3: Agar pedinin hazırlanması ve montajı ile ilgili C. elegans embriyosunun seri fotoğrafları gösterilmektedir. A . Hazırlanmış agar tüpleri. B-C. Agar pedinin hazırlanması. D. Kısmen suyla dolu kaydırın. E. Slaytın petrol jölesi ile kapatılması. F. Son hazırlık. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Şekil 4: Hücre soy izleyici yazılımının seri ekran görüntüleri. Program, bir hücre döngüsü gecikme mutantının (solda) ve bir WT (sağda) C. elegans embriyosunun embriyonik hücre soyunun yeniden yapılandırılmasına izin verir. A. Gelişimin erken bir adımı. B-C. Her iki embriyonun gelişimi zamanla ilerler. D. WT embriyosu düzgün gelişir ve uzamaya başlarken, mutant tutuklanır. Her durumda program video penceresini ve soy penceresini görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Şekil 5: Bir C. elegans WT embriyosundaki apoptotik hücrelerin mercimek refraktil şekli. Morfolojik özelliklerle tanımlanan hücre kaderi, 4D mikroskopi ile değerlendirilebilir. Resim, fasulye aşamasında bir C. elegans embriyosunu göstermektedir. Canlı hücreler, granüler bir sitoplazma ile çevrili pürüzsüz şekilli çekirdekler gösterir. Buna karşılık, apoptotik hücreler (sarı oklar) yoğunlaşır ve mercimek benzeri, refraktil bir şekil alır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K Görüntüleme.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion dahil Kuvvetleri Tahminleri

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Mühendislik

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

Kırınım Analizi hayatın Caenorhabditis elegans Fourier tabanlı

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Gelişim Biyolojisi

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Nörobilim

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biyoloji

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme

Kırınım Analizi hayatın Caenorhabditis elegans Fourier tabanlı

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Temel

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize'a Time Lapse Mikroskopi kullanın