C.elegans embriyogenez yaklaşık 13 saat sürer ve genellikle bir seferde bir embriyo filme tarafından izlenir. Ancak protokolümüz, 80-100 embriyonun eşzamanlı 3Boyutlu zaman atlamalı görüntülemesine olanak sağlıyor. Gelişmekte olan c.elegans embriyolarının çok sayıda için veri toplama yeteneği, gelişimsel olayların ve büyük ölçekli ekranların nicel analizi de dahil olmak üzere yeni bir deney yelpazesini ortaya çıkar.
Bu protokol, farklı gelişimsel süreçleri yakalamak veya ilgi dokularında belirteçlerin herhangi bir kombinasyonunu ifade eden görüntü embriyolarına kolayca uyarlanabilir. Embriyoları kuyuların içine düzgün bir şekilde dağıtmak zordur. Farklı Z düzlemlerinde kümelenmeden alan başına birden fazla embriyonun yakalanmasını sağlamak için birbirine yakın olmalıdırlar.
Yan yana diseksiyon, buz üzerinde iki araştırmacı kullanmanızı ve kullanılmayan kuyuları engellemenizi öneririz. Biz de hızlı bir şekilde iyi hazırlanmış 384-iyi plaka kurmak için bazı yararlı hileler gösterecektir. Kullanılmayan kuyuları maskelemek için PCR yapışkan folyo ile cam dipli 384 kuyulu bir plakayı mühürleyerek başlayın.
Kullanım için kuyuların bir alt kümesini ortaya çıkarmak için folyoyu kesmek için jilet veya neşter kullanın. Her kuyuya 70 mikrolitre taze hazırlanmış TMHC ekleyin ve plakayı buzüzerinde tutun. Kenar efektlerini önlemek için plakanın dış iki satırını hariç tonuyla.
Hızlı numune hazırlama için iki araştırmacı tarafından yan yana diseksiyon önerilir. Çözeltinin tamamı kaplandığında, her koşulda bir depresyon slaytı içinde yaklaşık 10 gravid yetişkini 150 mikrolitre buz gibi TMHC çözeltisine aktarmak için ince cımbız ve diseksiyon mikroskobu kullanın. Cımbız ve neşter kullanarak, embriyoları serbest bırakmak ve bir ağız aspiratör içine çekilen bir kılcal pipet yüklemek için solucanlar incelemek.
İki ila sekiz hücreli evre embriyoların tümünün hazırlanan plakanın ayrı kuyularına aktarılması için ağız pipetini kullanın ve herhangi bir kuyuda agrega bulunmadığını doğrulamak için plakayı inceleyin. Tüm embriyolar toplandığında, santrifüj ile örnekleri yerleştirin ve plakanın alt kısmından herhangi bir kalıntı kaldırmak için bir etanol ıslatılmış mendil kullanın. Plakayı sıcaklık kontrollü bir ortamla donatılmış bir konfokal mikroskobun plaka tutucusuna yerleştirin ve uygun embriyolara sahip alanları belirlemek için her kuyunun ön tayinini yapmak için 10X hedefini kullanın.
Tarayın sonunda, 60X hedefine geçin, her noktada odak düzlemini her kuyuda bir ila dört alana göre ayarlayın ve 10 saat boyunca her 20 dakikada bir iki mikrometre aralıklarla 18 Z-kesit elde edin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, embriyonik öldürücülüğü değerlendirmek için gece görüntülemenin başlamasından yaklaşık 20 ila 24 saat sonra, düşük, bütün parlak alan taraması yapın. embriyoCropUI çalıştırılabilir kullanarak otomatik kırpma için, ilk Zenodo ve test dosyaları programı indirin.
zip programın platformda düzgün çalışıp çalışmadığını belirlemek için. Bir kez indirilen, unzip ve embriyoCropUI yürütülebilir dosyabulmak için gidin ve programı başlatmak için çift tıklayın. Kırpmak için ilk özel 4B görüş alanını yüklemek için açık'ı seçin.
Birden fazla boyutlu bir TIFF serisini kırpma yaparken, yalnızca klasör içindeki serideki ilk görüntüyü yükleyin. Tüm görüntüler yüklendiğinde görüntüleme parametrelerini belirtin, arka plan çıkarma ve zayıflatma düzeltmesini seçin ve görüntü toplama sırasını ve piksel başına mikronları ayarlayın. Ardından çalıştır'ı seçin, kırpılmamış klasörle aynı yolda yeni bir alt klasör etiketlenir ve kırpılan sürümler bu konuma kaydedilir.
Görselleştirme için, açık ve birleşik MSV2 ImageJ eklentisi ve grafik kullanıcı arabirimi talimatları Zenodorepov2 indirin. Zenodo docx ve IMageJ eklentisi açın. Üç ve dördüncü satırları bulun ve kırpmadan sonra resim klasörlerinin depolanacak konumu girdi.
İşlenecek koşulların görüntü klasörü adları ve her gecelik deneme için benzersiz alfasayısal tanımlayıcı. Tüm bilgiler girildiğinde çalıştır'ı tıklatın. Kırpılan resim klasörlerini içeren dış klasöre gitmek için bir istem başlatacak bir pencere görüntülenir.
Seçildikten sonra görüntüleme parametrelerinin belirtimine izin verecek başka bir pencere görüntülenir. Tamam'ı tıklatın. Bileşik dosya biraraya başlayacaktır.
Bileşik oluşturulduğunda, açık bırakılan dosyaları gözden geçirin. Birlikte görüntülendiğinde özel muhabir suşları en büyük gelişimsel olaylar için bilgilendirici okumalar sağlar. Sülfat belirtimi dahil, dorsal intercalation, epidermal muhafaza, uzama, ve nörogenez.
Enjeksiyondan 24 saat sonra görüntüleme için en uygun zaman noktasıdır. Bu süre itibariyle maternal protein tükenmesi ve zigotik gen ekspresyonunun inhibisyonu, sülfat belirtimi ve morfogenezde yer alan genlerin geniş bir spektrumu nda farklı, yüksek oranda tekrarlanabilir imza fenotipleri veren etkilidir. Diseksiyon ve embriyo seçimi adımları sırasında sabırlı olmak önemlidir.
Kümelenmeyi en aza indirmek ve uygun odak düzlemlerini seçmek de yüksek kaliteli veri sağlamak için gereklidir. Protokolümüz çeşitli floresan marker suşları ile ve RNAi veya mutantlar ile birlikte yapılabilir. İşleme araçlarımız, kolaylaştırılmış, otomatik leştirilmiş veya manuel veri analizine olanak sağlar.
Burada açıklanan suşları, yöntemleri ve araçları kullanarak grubumuz embriyonik gelişim için gerekli olan yaklaşık 2.000 geni hedefleyen RNAi tabanlı yüksek içerikli bir ekran gerçekleştirdi. Bu proje için yarı-yüksek iş metotları gerekliydi.
