Protokolümüz, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun K18 insan ACE2 transgenik fare modelinde in vivo ve ex vivo canlı görüntüleme viral tespiti ve viral izleme için floresan veya ışıldayan eksprese eden rekombinant SARS-CoV-2'nin kullanımını tanımlamıştır. Bu tekniğin temel avantajı, K18 insan ACE2 transgenik fare modelinde SARS-CoV-2'nin in vivo ve ex vivo çalışmaları için viral tespitin ve izlemenin uygulanması ve fizibilitesinedir. K18 insan ACE2 transgenik fare modelinde SARS-CoV-2'nin in vivo görüntülenmesinin kullanılması, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun in vivo tedavisi için terapötikleri değerlendirmek için mükemmel bir seçenek sunmaktadır.
SARS-CoV-2 muhabirlerinin uygulanması, patojeniteyi, viral replikasyonu ve trofizmi in vivo olarak değerlendirmek için mükemmel bir seçenek sunmaktadır. SARS-CoV-2'yi eksprese eden lusiferaz ile yapılan in vivo çalışmalar için, biyolüminesans sinyalini iyileştirmek için farelerin tıraş edilmesi ve substrat enjeksiyonundan sonra hızlı görüntüleme yapılması önerilir. İn vivo görüntüleme sistemini veya IVIS'i başlatarak ve parametreleri ayarlayarak biyolüminesans izlemeye başlayın, görüntü modunu Biyolüminesans olarak tıklayın, ardından filtreyi açın ve pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın.
Daha sonra, önceden traş edilmiş ve anestezi uygulanmış bir fareyi izolasyon odasından çıkarın ve PBS'de 1 ila 10 oranında seyreltilmiş lusiferaz substratının 100 mikrolitresini fareye retro-orbital olarak uygulamak için 25 gauge iğne kullanın. Ardından fareyi tekrar izolasyon odasına yerleştirin, izolasyon odasını hipotermiyi önlemek için bir ısıtma bileşeni ile donatılmış IVIS makinesine aktarın ve yazılım programında Al'ı seçerek görüntülemeyi başlatmak için IVIS görüntüleyici kapağını kapatın. Elde edilen biyolüminesans görüntülerini analiz etmek için, hassas sinyali belirlemek ve akıyı ölçmek için yazılımdaki ROI veya ilgi alanı aracını kullanın.
Görüntüleme yazılımını başlatın ve parametreleri ayarlayın. Görüntü modunu Floresan olarak tıklayın, uyarımı 500 nanometrede ve emisyon filtrelerini 530 nanometrede ayarlayın ve maruz kalma süresini Otomatik olarak ayarlayın.
Eksize edilmiş akciğerleri iki mililitre 1X PBS içeren 6 delikli bir plakaya yerleştirin ve fazla kanı çıkarmak için durulayın. %70 etanol kullanarak numuneler arasındaki ameliyat aletlerini dezenfekte edin ve temizleyin. IVIS makinesini başlattıktan sonra, akciğerleri siyah bir tabakaya yerleştirin ve dokuları birbirinden ayırın.
Daha sonra tepsiyi biyogüvenlik kabininin içindeki izolasyon odasının içine yerleştirin ve ardından izolasyon odasını IVIS'e aktarın. IVIS görüntüleyici kapağını kapatın ve görüntüleme sistemini başlatmak için Al'a tıklayın. Floresanı analiz etmek için, ROI aracını kullanın ve her bir ciğerin etrafına yatırım getirisi çekin.
Her yatırım getirisini manuel olarak ölçün ve ardından verilen ortalama radyant verimlilik değerlerini kullanın ve alay virüslü farelerden çıkarın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, dokuları daha sonra işlenmek üzere eksi 80 santigrat derecede saklamak üzere kuru buz dondurma için bir kriyotüp içine yerleştirin. Doku homojenatlarından elde edilen süpernatı kullanarak, on kat seri seyreltme gerçekleştirin ve Vero E6 hücrelerinin akan tek katmanlarını, üçlü olarak her bir süpernatant seyreltmenin bir mililitresi ile enfekte edin.
Virüsün nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede bir saat boyunca adsorbe olmasına izin verin. Bir kez yapıldıktan sonra, hücreleri bir mililitre 1X PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri, nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 72 saat boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 1 agar içeren% 1 agar içeren iki mililitre enfeksiyon sonrası ortamda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, plakaları% 10 nötr tamponlu formalin içinde 24 saat boyunca dört santigrat derecede inaktive ederek tüm plakanın suya batırılmasını sağlayın.
Plakaları biyogüvenlik seviyesi üçten çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.5 Triton X-100 ile üç kez yıkayın. Daha sonra, geçirgenleştirilmiş hücreleri 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir mililitre 2.5 sığır serum albümini veya BSA ve PBS ile bloke edin, ardından 37 santigrat derecede bir saat boyunca 2.5 BSA'da seyreltilmiş SARS-CoV nükleokapsid proteini çapraz reaktif monoklonal antikoru 1C7C7'nin mililitre başına bir mililitre bir mikrogramda inkübasyon. Hücreleri bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre ABC ve diaminobenzen veya DAB, peroksidaz substrat kitlerini kullanarak plakları geliştirin, ardından viral titreleri mililitre başına plak oluşturan birimler olarak hesaplayın.
Çalışmada, biyolüminesan nanolusiferaz veya Nluc'un kolayca tespit edildiği ve farelerin rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olduğu, ancak rSARS-CoV-2 vahşi tip veya sahte enfekte olanların enfekte olmadığı gözlenmiştir. Kantitatif analizler, enfeksiyon sonrası farklı günlerde Nluc yoğunluğunu gösterdi. rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olmuş farelerin akciğer yüzeyindeki brüt lezyonlar, rSARS-CoV-2 vahşi tip enfekte gruptakilerle karşılaştırılabilirdi.
Ek olarak, viral titreler tespit edildi ve rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olmuş fareler, enfeksiyondan sonraki farklı günlerde tüm organlarda rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olanlarla karşılaştırılabilirdi. Aynı zamanda, Nluc aktivitesi sadece rSARS-CoV-2 Nluc ile enfekte olmuş farelerin organlarında tespit edildi. Ayrı bir sahte enfekte ve virüs bulaşmış fare grubu, vücut ağırlığı ve sağkalımındaki değişiklikler için 12 gün boyunca izlendi.
rSARS-CoV-2 Nluc ve rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olmuş fareler vücut ağırlıklarının% 25'ini kaybetti ve hepsi enfeksiyondan yedi ila sekiz gün sonra viral enfeksiyona yenik düştü. rSARS-CoV-2 Venüs enfeksiyonundan sonra, Venüs ekspresyonu, rSARS-CoV-2 Venüs ile enfekte olmuş farelerin tüm akciğerlerinde kolayca tespit edildi, ancak rSARS-CoV-2 vahşi tipi veya sahte enfekte olanlarla enfekte olmayanlar tespit edilmedi. Kantitatif analizler, Venüs yoğunluğunun enfeksiyondan iki gün sonra zirveye ulaştığını ve enfeksiyon ve enfekte farelerin akciğerleri boyunca azaldığını gösterdi.
Akciğer yüzeyinin görüntüleri, rSARS-CoV-2 Venüs ile enfekte olmuş farelerin brüt lezyonlarının, rSARS-CoV-2 vahşi tip enfekte farelerinkiyle karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, rSARS-CoV-2 Venüs enfeksiyonu, tüm organlarda rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olmuş farelerde gözlenenlerle karşılaştırılabilir viral titrelerle sonuçlandı. rSARS-CoV-2 Venüs ve rSARS-CoV-2 vahşi tipi ile enfekte olmuş fareler, vücut ağırlıklarının% 25'ini kaybetti ve enfeksiyon sonrası dokuzuncu günde hayatta kalma olmadan viral enfeksiyona yenik düştü.
SARS-CoV-2'yi ifade eden muhabirin sonuçları, viral enfeksiyonun geçerli vekilleri olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun tedavisi için karşı önlemlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına ve değerlendirilmesine yol açabilir.
