Biz minnetle, bu protokolü geliştirildi dayandığı temel Eric Wieschaus kabul etmiş sayılırsınız. Çalışmalarımız Verna &amp; Marrs McLean, Biyokimya Anabilim Dalı ve Moleküler Biyoloji Başlangıç ​​Ödülü, Baylor College of Medicine tarafından desteklenmektedir.

1. Embriyo Koleksiyon Bardaklar birleştirin <ol><li> Mümkün olduğunca pürüzsüz kenar, ustura ile 100 ml Üç mısır beher alt kesti. Bu kesinlikle gerekli olmasa da, bardak, aynı zamanda üst kapalı üç köşe Döşeme halinde ele kolaydır. </li><li> Tel örgü (6 cm x 6 cm) bir kare kesin. Önceden ısıtılmış sıcak levha, iç davlumbaz, katman, ağır alüminyum folyo bir parça üstüne tel örgü kare. Kesme alt kenarı fincan sıcak örgü üzerine sıkıca bastırın. Birkaç saniye bekleyin ve şimdi bağlı mesh ile kupayı kaldırmayı. Folyo da sopalarla ise, sadece o kabuğu. </li><li> Gecede bardağı soğutun. Ince taneli zımpara kağıdı ile herhangi bir keskin kenarları aşırı makas örgü, kum ve çıkarın. </li></ol> 2. Elma Suyu Agar Tabaklar olun <ol><li> 6L şişesi, 100 g BD Bacto Agar ve 3L distile su birleştirir. 30 dakika yavaş egzoz ayarı agar Otoklav. </li><li> Bir heyecan çubuğu ile 2L şişesi, 100 g sakaroz, 1L elma suyu, ve 6 g p-hidroksibenzoik asit birleştirir. Sıcak bir plaka üzerine karıştırarak kaynama çözüm ısıtın. En fazla 2 dakika boyunca kaynatın. Elma suyu karışımı serin ve daha sonra heyecan çubuğu ile agar eklemek için izin ver. Tamamen karıştırın. </li><li> 60x15 mm petri kaplarına dökülmeden önce 60 ° C su banyosunda soğutmak için kombine bir çözüm izin verin. Alternatif olarak, bir peristaltik pompa agar dağıtmak için kullanılabilir. Plakaları, en az 4 saat süreyle oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 4 ıslak kağıt havlu ve mağaza bir katman ° C ile Rubbermaid kaplarda Stack </li></ol> Notlar: <ul><li> Sonbahar ya da kış, ek bir 100 ml su agar eklemek için gerekli olabilir. </li><li> Petri kutularının marka önemlidir! Sadece BD Falcon yemekleri mısır Üç bardak uygun. Özel sipariş bilgileri aşağıda Malzeme tablo bulunabilir. </li></ul> 3. Embriyo Koleksiyon Bardaklar GFP Sinekler <ol><li> Şişe kurarak toplama ihtiyaçlarına göre GFP stokları genişletin görüntüleme için yaklaşık iki hafta önce uçar. Bir şişe sinek genellikle en az 50 kadın ve 30 erkek ile bir embriyo toplama kabına doldurmak için yeterli olandan daha fazla. En iyi döşenmesi için, sinek (yani en az 5 gün sonrası kuluçka) yeni eclosed olmalıdır. </li><li> Kabaca eşit parçaya Red Star aktif kuru maya ve distile su ile küçük bir bardak doldurarak yapıştırın bir maya ve maya eriyene kadar karıştırın. Macun ıslak fıstık ezmesi yaklaşık tutarlılık olmalıdır. Daha fazla maya veya su tutarlılık değiştirmek için eklenebilir. Maya salçası, 4, birkaç gün için kullanılır, ve saklanmalıdır, kapalı ° C </li><li> Maya yapıştırın hazır olduğunda, 4 elma suyu plakaları kaldırmak ° C depolama. Maya hamuru ile elma suyu plakalar ve bunların 22-25 ısınmasını bekleyin Streak ° C, yumurtlama teşvik edecektir. </li><li> Sonra yine yarım, yarım yuvarlak bir filtre kağıdı katlayın. 8-9 cm çapında kesin ve çeyrek daire içinde akordeon kıvrımları. Daire açın, invert ve örgü temas edene kadar bir toplama kabına yerleştirin. Sonbahar ve sinek ezmek, böylece kağıt bardak güvenli olduğundan emin olun. Filtre kağıdı, isteğe bağlıdır, ancak çiftleşme için davetkar bir ortam sağlar, ve fincan nem tutar. </li><li> Stok adı ve tarih ile birlikte bir fincan etiketleyin. Fincan ters şişe hafifçe sallayarak ve hemen hazırlanmış bir elma suyu plaka ile fincan kapağı sineklerin şişe toplama kabına aktarın. Plaka fincan bir lastik bant ile sabitleyin. Doğrudan güneş ışığı ile bir alanda bardak örgü yüzü yukarı ayarlayın. Sinekler karanlıkta yatıyordu olmaz gölgeler, fincan düştüğü emin olun. </li><li> Elma suyu plakası, gerektiği gibi değiştirin. İki saat koleksiyonları, oda sıcaklığında, görüntüleme cellularization için iyi çalışır. </li></ol> 4. Montaj Odası hazırlayın <ol><li> Embriyolar için bir montaj odası hazırlamak için, 2-3 cm uzunluğunda çift taraflı bant bir parça kesme ve bir slayt üzerine yerleştirin, teyp ve slayt uzun ekseni hizalayarak. Kenarları hizalanır emin olmak için, ikinci bir 2-3 cm, çift taraflı bant ve diğer bant parçasının üstüne katmanı uzun bir parça kesin. </li><li> Bir jilet kullanarak, bant ve slayt uzun eksenine dik merkezi dışında iki yaklaşık 3 mm keser. Kesimler arasında bir kanal yapmak için bandı çıkarın. Kanal içine Halokarbon 27 Petrol pipetleyin bir damla. Bu kanal, embriyoların burada monte edilecektir. </li></ol> Notlar: <ul><li> Sadece ½ inç Scotch çift taraflı bant, embriyoları yerleştirmek için doğru kalınlığı. </li><li> Halokarbon 27 Yağ oksijen geçirgen ve embriyo dehidratasyon önlerken oksijen alışverişi sağlar. Refraktif indeks nedeniyle, Halokarbon 27 Yağ evreleme için de idealdir.ve görüntüleme embriyolar. </li></ul> 5. Dechorionate Embriyolar <ol><li> Toplamak ve dechorionate embriyolar için, tüm yüzey tamamen daldırın elma suyu agar plaka üzerinde yeterince% 50 çamaşır suyu dökün. Embriyoların koryon serbest bırakmak için, iletilen ışık Zeiss Discovery V8 gibi, bir diseksiyon mikroskop kullanarak izlemek. Koryon gevşetir ve bir kaç embriyolar (30-60 saniye) sürümleri gibi, bir hücre süzgeç içine çamaşır suyu ve embriyolar dökün. </li><li> Fışkırtma bir şişe saf su ile derhal ve şiddetle süzgeç embriyolar yıkayın. Dab süzgeç kağıt havlu üzerine. Dabbing sonra herhangi bir pembe havlu görüldüğü takdirde, su ile embriyolar yıkama devam etmektedir. </li><li> Temiz bir elma suyu plaka (maya yapıştırın olmadan) 10-50 embriyo transferine nemli bir fırça kullanın. Yırtık bir kağıt havlu kenarı ile su uzak Wick ve hemen Halokarbon 27 Yağı küçük bir miktarı ile embriyoların kapsayacak. </li></ol> Notlar: <ul><li> Clorox çamaşır suyu kullanmayın. Bunun yerine, &lt;% 6 sodyum hipoklorit Austin Ticaret Bleach, A-1 gibi bir marka kullanın. </li><li> Aşırı ağartma veya yetersiz durulama düzensiz cellularization Duygusal embriyolar neden olacaktır. </li></ul> 6. Sahne ve Montaj Embriyolar <ol><li> Iletilen ışık ile diseksiyon mikroskop kullanarak, plaka üzerinde embriyolar aşamasına Bownes 20 morfolojik yönergeleri izleyin. Forseps kullanarak, montaj odasına kanal Bownes evre 4 karşılık, 5 mitotik döngüsü 11 veya 12 embriyoların transferi. Dorsal ve ventral tarafı aşağı görünür ve yan tarafında bir çizgi embriyolar düzenleyin. Embriyolar yalnız petrol bu yönde kolayca düzenlenir. Kapak kayma aşağıda uygulandıktan sonra oksijen komşuları mahrum kalabalık embriyolar birlikte etmeyin. (Aralarında embriyo uzunluğu yaklaşık yarım bırakın). </li><li> Kanalın bir tarafında çift taraflı bant kayma 25x25 mm kapak kenarına yatırın. Kanal kapağı için kapak kayma bırakın. Hava altında yakalanmış ise, kapak kayma kenarında Halokarbon 27 Yağı küçük bir miktar uygulanır. Kılcal etkinlik kanal içine yağ çekme ve hava dışarı itecektir. </li></ol> Notlar: <ul><li> Embriyolar evreleme için bir başka mükemmel bir kaynak aşağıdadır: Campos-Ortega, JA ve Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster Embriyonik gelişim. Springer-Verlag, Berlin. Bu kitap artık yayınlanmış olmasına rağmen, kullanılan kopya Amazon.com düzenli olarak kullanılabilir. </li><li> Idareli Halokarbon 27 Yağ her zaman kullanın. Bu montaj daha kolay hale getirecektir. Ayrıca aşağıdaki görüntüleme adımları mikroskop objektif üzerine yağ sızmaya yanlışlıkla önleyecektir. </li></ul> 7. Resim Embriyolar <ol><li> Tabii burada Nasıl devam görüntüleme olduğu hücre şekil değişikliği ve size hitap soru tarafından dikte olacaktır. Herhangi bir şekil değişikliği için, montaj odasına ya dik ya da ters mikroskop yere iletilen ışık embriyolar bulmak ve daha sonra bölgeye bir ilgi odağı konfokal görüntüleme geçmek. Nikon&#39;un MicroscopyU (tartışılacak gibi konfokal mikroskopi için en iyi uygulamalar, <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">uyun</a> http://www.microscopyu.com/articles/confocal) . Photobleaching ve fototoksisite önlemek için, mümkün olduğu kadar az lazer gücü, canlı embriyolarının ifşa özellikle dikkatli olun. </li><li> Cellularization için, biz bir Zeiss 710 lazer tarama konfokal mikroskop görüntü, bir C-Apochromat 40x/1.2 W Corr amacı ile. Bu mikroskop, 18-20 ° C den arasında değişen sıcaklıklarda, sıcaklık kontrollü bir oda içinde yer alır Sıcaklık kontrolü kesinlikle gerekli değildir, ancak mikroskop için daha iyi ve görüntü daha tutarlı hale getirir. Biz düzenli olarak embriyo ortasına yakın tek bir düzlemde görüntü, kesit plazma zarı invajinasyonları (Şekil 2) takip etmek. , Sadece invajinasyon dinamikleri takip için 30-60 saniyelik aralıklarla zaman atlamalı görüntüleme için yeterli ve embriyolar oksijensizlik hiçbir belirgin belirti&gt; 90 dakika için görüntüleme dayanacak. </li><li> Görüntüleri aldıktan sonra, görüntü analiz paketleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri freeware, ImageJ (adı da dahil olmak üzere herhangi bir sayı <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">kullanılarak</a> analiz edilebilir http://rsbweb.nih.gov/ij). Bu veriler daha sonra film (Film 1), diziler (Şekil 2) veya kymographs 21 olarak sunulabilir. </li></ol> Not: <ul><li> C-Apochromat suya daldırma 40x/1.2 W Corr amacı sulu örneklerinde derin doku görüntüleme için sapmaları sınırlar yüksek diyafram nedeniyle orta bölümünde embriyo yakın görüntüleme için çok uygun ve yüksek çözünürlük ve yüksek floresan sinyal verir. Buna ek olarak, bu amacaçok uzun bir çalışma mesafesi (220 mikron). Ancak, diğer su ya da gliserin daldırma hedefleri ilgi hücre şekil değişikliği embriyo yüzeyine yakın görüntülü özellikle iyi bir performans olacak. </li></ul> 8. Alternatif Yöntem: &quot;embriyo-tutkal&quot; Montaj Embriyolar <ol><li> Cellularization daha başka bir hücre şeklini değiştirmek için, belirli bir yönde kolayca tek başına petrol tutulmaz embriyolar monte etmek için gerekli olabilir. Bunu yapmak için, daha önce açıklanan bir alternatif montaj metodu kullanın. Sintilasyon flakon 250 mcL heptan ile 20 cm çift taraflı bant ile birleştirerek &quot;embriyo-tutkal&quot; yaparak başlayın. Sintilasyon bir nutator flakon ya da dönen bir platform yerleştirin ve geceleme karıştırın. </li><li> Embriyo yapıştırıcı bir sarı pipet ucu batırın ve sonra tutkal bir iz bırakarak, bir slayt boyunca ucu iz. Heptan buharlaşan iken, agar bir blok gerekli yönde embriyolar sahnelenen hizalayın. (Görüntülü embriyo yüzey agar karşı karşıya olması gerektiğini unutmayın. Örneğin, ventral karık oluşumu sırasında görüntü hücre şeklini değiştirmek için, agar karşı karşıya ventral yüzü embriyolar monte edin.) </li><li> Yapıştırıcı ile slayt, invert ve yavaşça agar bloğu embriyoların karşı tutkal izi basın. Şimdi tekrar slayt çevirin. Embriyolar uygun bir yönlendirmeye sıkışmış olacak. Embriyoların her iki tarafında çift taraflı bant ile iki kat, Halokarbon 27 Yağ kapağını ve bir lamel geçerlidir. Yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme ile devam edin. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Embriyoların sağlıklı ve en iyi görüntü ise, daha sonra cellularization 50-60 dakika almalı ve plazma membran invajinasyonları girişine yaklaşık 40 mikron. Ancak, embriyolar üzerinde ağartılmış, fototoksisite tarafından oksijen yoksun veya hasarlı olup olmadığını, daha sonra invajinasyon ya özellikle görüntülü alanda, yavaş ya da duracaktır. Embriyo sağlık Böyle bozulma, sık sık değişmiş geliştirme ve larva olarak yumurtadan bir başarısızlık ile sonuçlanır. Böylece, görüntüleme sonra tahlil embriyo sağlık için sıkı bir test için, nemlendirilmiş bir odasında slaytlarınız tutmak ve ertesi gün kuluçka izlemek. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Embriyo toplama görüntüleme iş akışı, iş akışı protokol dört ana aşamaya bölünebilir . İlk aşamada, tüm bireysel kaynakları ve bileşenleri hazırlanır ve daha sonra embriyo toplama fincan elma suyu agar plaka ve GFP sinekler embriyo-döşeme ortamı yaratmak için bir araya konur. İkinci aşamada ise, elma suyu agar plakları üzerine koydu, yumurta ve embriyolar toplanır. Üçüncü aşamada ise, embriyoların plaka kaldırılır, sahnelenen ve montaj odasına aktarılır. Dördüncü evrede, monte embriyolar konfokal mikroskop görüntülü. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Cellularization zaman atlamalı görüntüleme Temsilcisi veri Embriyolar dorsal (D) ve açıkça görünür ventral (V) taraf ile monte edilir ve kesit plazma zarı invajinasyonları takip etmek onların ortasına yakın görüntülü. Burada gösterilen embriyo ifade GFP-Myosin-2 prob 6, plazma zarı invajinasyonları ucunda yoğunlaşmaktadır. Böylece, zamanla bu ön ingression izleme plazma zarı invaginates hangi hızda verir. 0:00 dakika zaman noktası cellularization başlangıçlı karşılık gelir. 56:00 dakikalık bir zaman noktasında kısa bir süre sonra, gastrulasyon embriyonun ventral tarafında başlar. Bar 40 mikron. Movie 1. Cellularization zaman atlamalı görüntüleme Temsilcisi film Bu film Şekil 2 tekabül etmektedir. , Görüntüleme cellularization tüm süreci kaydetmek için yakalama pseudocleavage karık regresyon, önceki mitotik döngüsü 13 başladı ve gastrulasyon hareketleri embriyonun ventral tarafında görüldü kadar devam etti. Görüntüler bir dakikalık aralıklarla toplanmıştır. Şiddetleri gastrulasyon hareketleri daha kolay hale getirmek için alım sonrası artmıştır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Video için tıklayın</a> <table border="1"><tbody><tr><td> * Gelişimsel olay ve zamanlama </td><td> Hücre şekil değişiklikleri ile ilgili </td><td> Hastalık ya da insan sağlığı için bir bağlantı </td><td> Canlı görüntüleme ile son referanslar </td></tr><tr><td> Pseudo-bölünme karık oluşumu (4, 90 dakika pf) </td><td> Sitokinez </td><td> Poliploidi ve kanser ilerlemesi 1 </td><td> Mavrakis ve ark, 2009 8 Cao ve ark, 2010 9 </td></tr><tr><td> Cellularization (5, 130 dakika pf) </td><td> Sitokinez </td><td> Poliploidi ve kanser ilerlemesi 1 </td><td> Cao ve ark, 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 11, 2008 </td></tr><tr><td> Ventral karık formasyonu; Mezoderm invajinasyon (6, 180 dakika pf) </td><td> Apikal daralma; Epitel mezenkimal geçiş </td><td> Kanser metastaz 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 12, 2007 Martin ve ark, 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband uzantısı (7, 195 dakika pf) </td><td> Yakınsak uzantısı </td><td> Nöral tüp defektleri 3 </td><td> Bertet ve ark, 2004 14 Blankenship ve ark, 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11, 320 dakika, pf) </td><td> Epitelyal tüp oluşumu ve dallanma </td><td> Anjiyogenez 4 </td><td> Caussinus ve ark, 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Dorsal kapatma (14, 620 dakika pf) </td><td> Apikal daralma </td><td> Yara iyileşmesi 5 </td><td> Gorfinkiel ve ark, 2009 18 Solon ve ark, 2009 19 </td></tr></tbody></table> Yaşayan sinek embriyolar görüntülü cep şekil değişiklikleri Tablo 1. * Bownes sahne sayısı ve süresi sonrası fertilizasyon (pf), her olay başladığında, Campos-Ortega, 1985 göre sıralanmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td> Stok Fly </td><td> Etiketler </td><td> Orijinal referans </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Plazma membran </td><td> Morin ve ark, 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Plazma membran </td><td> Morin ve ark, 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venüs </td><td> Plazma membran </td><td> Mavrakis ve ark, 2009 8 </td></tr><tr><td> Spagetti Squash GFP (SQH-GFP) </td><td> Miyozin-2 </td><td> Royou ve ark, 2002 6 </td></tr><tr><td> E-kaderin-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Hücre-hücre kavşaklar </td><td> Oda ve ark, 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-aktin </td><td> Kiehart ve ark, 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin-Venus (Utro Venüs) </td><td> F-aktin </td><td> Sokac ve ark. Yayınlanmamış sonuçları </td></tr></tbody></table> Tablo 2 sinek embriyolar görüntüleme hücre şekil değişikliği Faydalı stokları

<ol>
	<li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+and+cancer.">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li><li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease.">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li><li>Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+understanding+the+genetic+basis+of+neural+tube+defects.">Toward understanding the genetic basis of neural tube defects.</a> Clin Genet. 71, 295-310 (2007).</li><li>Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+tube+morphogenesis+during+Drosophila+tracheal+development+requires+Piopio,+a+luminal+ZP+protein.">Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein.</a> Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).</li><li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis.">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li><li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo.">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo.">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li><li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation.">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li><li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. u. f. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Rab11+effector,+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization.">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li><li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization.">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li><li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abelson+kinase+(Abl)+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila.">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li><li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation.">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li><li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation.">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li><li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. a. r. t. i. n. e. z., A, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li><li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure.">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li><li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization.">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li></ol>

Protokol, burada, gelişmekte olan sinek embriyonun hücre şekil değişiklikleri bir dizi canlı, konfokal görüntüleme izin verecektir nitelendirdi. GFP stokları görüntüleme için ayrı bir laboratuvar (Tablo 2) tarafından hazırlanan, ancak pek çok hisse senedi de Indiana Üniversitesi&#39;nden (Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi olarak merkezlerinin halka açık <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">olabilir</a> http://flystocks.bio.indiana.edu) ve flytrap Yale Üniversitesi (Men...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>12-550-343</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips 25x25</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (Corning #2865-25)</td>
<td>1 2-524C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Squirt bottles (H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-897-11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 352070)</td>
<td>14-432-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bulbs for small pipets, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>03-448-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scintillation vials with caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (Wheaton #986546)</td>
<td>66021-533</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tri-Corn Beakers, 100 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>60970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Petri dish 60x15mm </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 351007)</td>
<td>08757 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD#352350)</td>
<td>08-771-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yellow pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ranin</td>
<td>L200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel mesh, 304, 12x24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150-F-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass 5&frac34; inch Pasteur Pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P4 Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>09-803-6F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber bands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A620645</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scotch double-sided tape, &frac12; inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A8137DM-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jerry&#x2019;s Artarama</td>
<td>56460</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps High Precision Inox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>72701-DZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD #214010)</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H 8773</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemical/Fisher Scientific</td>
<td>H360-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD# 214010)</td>
<td>90000-760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7903</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p-Hydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H5501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Star Active Dry Yeast</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LeSaffre</td>
<td>15700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels, C-fold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kleenex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heavy duty aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reynolds Wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Austin&#x2019;s A-1 Commercial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100% Apple juice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Spray or Tree Top</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging cell shape change in living drosophila embryos

Gelişmekte olan Drosophila melanogaster embriyo konfokal görüntüleme yaşamak için son derece müsait olan hücre şekil değişiklikleri bir dizi uğrar. Hücre sinek şekil değişiklikleri, yüksek organizmalarda benzer olup, doku morfolojilerinden sürücü. Yani, birçok durumda, yaptıkları çalışmada insan hastalığı (Tablo 1) 1-5 anlamak için doğrudan etkisi vardır. Hücre alt ölçekte, bu hücre şekil değişiklikleri, gen ekspresyonu, sinyal iletimi, hücre polarite, iskelet remodeling ve membran ticareti değişen faaliyetlerinin ürünüdür. Böylece, Drosophila embriyo doku morfolojilerinden ile ilgili olarak hücre şekil değişiklikleri değerlendirmek bağlamında sadece sağlar, ama aynı zamanda şekil hücreleri, alt-hücresel faaliyetler çalışma tamamen fizyolojik bir ortam sunmaktadır. Burada açıklanan protokol görüntü cellularization denilen özel bir hücre şeklini değiştirmek için tasarlanmıştır. Cellularization, dramatik plazma membran büyüme bir süreç olduğunu ve sonuçta hücresel blastodermin sinsityal embriyo dönüştürür. Interfaz mitotik döngüsü 14 olduğunu, plazma zarı aynı anda birincil epitel hücrelerinin bir sayfa oluşturmak için her ~ 6000 cortically demirlemiş çekirdeklerinin etrafında invaginates. Sayaç önceki önerileri, cellularization Miyozin-2 kontraktilite 6 tarafından yönlendirilen değil, ancak bunun yerine büyük ölçüde iç mağazaları 7 zarının ekzositoz tarafından körüklenen . Böylece, cellularization sitokinez veya enine-borucuk (T-tübül) kas morfolojilerinden olarak plazma zarı invajinasyon veya genişleme gerektiren hücre şekil değişiklikleri sırasında membran kaçakçılığı eğitimi için mükemmel bir sistem. Bu protokol sinek embriyo diğer hücre şekil değişiklikleri görüntüleme kolayca uygulanır ve sadece embriyo toplama aşamasında, değiştirme veya belirli bir oryantasyon (Tablo embriyo monte etmek için &quot;embriyo tutkal&quot; olarak hafif uyarlamalar gerektirir olduğunu unutmayın 1) 8-19. Tüm durumlarda, iş akışı temelde aynıdır (Şekil 1). Klonlama ve Drosophila transgenesis için standart yöntemler, Yeşil Floresan Protein (GFP) veya türevleri erimiş bir ilgi protein ifade istikrarlı sinek stokları hazırlamak için kullanılan ve bu sinekler, embriyo yenilenebilir bir kaynak sağlamak . Alternatif olarak, floresan proteinleri / problar doğrudan sinek embriyolara 9-10 basit mikro-enjeksiyon teknikleri ile tanıtıldı. Sonra, gelişimsel bir olay ve görüntülü olarak hücre şekil değişikliği göre, embriyolar toplanan ve diseksiyon mikroskobu morfolojisi tarafından sahnelenen, ve son olarak konumlandırılmış ve zaman atlamalı bir konfokal mikroskop görüntüleme için monte edilmiş.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos at JoVE.com

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Meyve sineği Drosophila melanogaster, erken gelişimi iyi görüntüleme yaklaşımlar için uygundur hücre şekil değişiklikleri bir dizi ile karakterizedir. Bu makale, Drosophila embriyolar canlı konfokal görüntüleme için gerekli olan temel araçları ve yöntemleri tanımlamak ve cellularization denilen bir hücreye şeklini değiştirmek üzerinde durulacak.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

14.2K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine (BCM). Meyve sineği Drosophila melanogaster, erken gelişimi iyi görüntüleme yaklaşımlar için uygundur hücre şekil değişiklikleri bir dizi ile karakterizedir. Bu makale, Drosophila embriyolar canlı konfokal görüntüleme için gerekli olan temel araçları ve yöntemleri tanımlamak ve cellularization denilen bir hücreye şeklini değiştirmek üzerinde durulacak.

Video: Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biyoloji

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...