LPE bir İskoç Kıdemli Klinik Fellow ve Baş Bilim Ofisi (SCD/03) desteğiyle kabul eder. Bu eser LPE (089930) için Wellcome Trust Projesi Hibe tarafından finanse edildi. NARG Bir Wellcome Trust Programı Hibe (080.088) ve bir ekipman Grant (075.470) (DeltaVision için), tarafından ve FP7-2007-2013 Grant (SAĞLIK-F2-2010-260338-Allfun) tarafından finanse edildi. Biz yardımcı destek ve tavsiye için özellikle Kevin MacKenzie Aberdeen görüntüleme tesisi Üniversitesi, teşekkür etmek istiyorum.

1. C. albicans Büyüme ve Koşullar <ol><li> 1 ml 1 M NaOH, 10 ml% 1 (w / v) adenin hemisulphate tuz ve 20 g teknik agar (önceden 11 de ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi), amino asitler olmadan 6.9 g maya nitrojen baz ekleyerek, SC-Ura agar plakaları hazırlayın. Distile H 2 O ile 900 ml hacim Makyaj Otoklav, agar soğumasını bekleyin, ama kuvvetlendirmek ve sonra aseptik koşullarda 50 ml steril% 40 D-glukoz ve 50 ml steril% 4 SC-Ura terk eklemek için yeterli değildir. Karıştır, Petri kutularına dökün ve soğumaya ve katılaşmaya agar plakaları bırakın. Mağaza agar plakalar 5 ° C &#39;de kullanılana dek. </li><li> Streak C. albicans serotip A koloni CAI4 + CIp10 gliserol stoklarından -80 ° C&#39;de depolanan SC-Ura agar plaka üzerine. </li><li> 30 plaka inkübe ° C &#39;ye kadar 5 koloniler form ve mağaza ° C </li><li> Kültür bir tek C. albicans 5 ml SC-Ura orta (1.1 gibi, ancak teknik agar olmadan reçete) de koloni ve 30 gece inkübeDurağan faz C. oluşturmak için ° C, 200 rpm albicans. </li></ol> 2. C. Floresein izotiyosiyanat kullanma albicans Boyama (FITC) <ol><li> 10 ul C. ekle albicans gecede 990 ul PBS (pH 7.4) bir kültür ve haemocytometer kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. </li><li> C. görselleştirme yardımcı olmak fagositoz deneyleri sırasında albicans, 1 leke × 10 8 C. karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika için 0.05 M karbonat-bikarbonat tampon maddesi (pH 9.6) içinde 1 mg / ml FITC ile albicans. </li><li> Ilişkisiz FITC kaldırmak için, C yıkayın 5 dakika boyunca 3.000 az 1 ml 1 x PBS, santrifüj × g albicans, 1 ml 1 x PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 3 kez tekrarlayın. </li><li> 1 süspanse pelet × 10 6 hücre / 1 x PBS ul. </li></ol> 3. J774.1 Fare Makrofaj Hücre Hattı hazırlanması <ol><li> 75 cm2 doku içinde J774.1 makrofajlar bakımıDMEM ortamı içinde kültür şişeleri% 10 oranında arttırılmıştır (v / v) cenin dana serumu (FCS), 200 U / ml penisilin / streptomisin ve 2 ile 37 ° C de% 5 CO 2 mM L-glutamin. Birincil makrofaj hazırlanması ayrıntı 12, 13 içinde başka bir yerde anlatılmıştır. </li><li> Doku kültürü şişesi J774.1 hücreleri kazıyın ve 50 ml Falcon tüp transfer. Bir hücre pelet elde etmek için 5 dakika süreyle 600 × g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 10 ml önceden ısıtılmış takviye edilmiş DMEM ortamı içinde tekrar süspansiyon topak süpernatantı ve çıkarın. 35 mm cam tabanlı görüntüleme tabak DMEM ortamı ilave 2 ml bir haemocytometer ve plaka 1 × 10 6 J774.1 makrofajlar kullanarak hücreleri saymak. 37 gece boyunca inkübe ° C,% 5 CO2. </li><li> Önceki görüntüleme ile takviye edilmiş DMEM ortamı yerine 2 ml CO 2-bağımsız ortamı (10% (v / v) cenin dana serumu (FCS), 200 U / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile) ilave ön-ısıtılmış 1 uM LysoTracker Kırmızı DND-99 içeren.</li></ol> 4. Canlı Hücre video Mikroskopi Fagositoz Assay <ol><li> Mikroskop seçimi mevcut yerel ne bağlı olacaktır, ancak mikroskop kurulum ters evre, 37 ısıtılmış bir çevre odası dahil etmek gerekir ° C ve seçilen lekeler için uyarma / emisyon filtresi (FITC ve TRITC). </li><li> Deney öncesinde mikroskop ısıtıcı açın ve 37 kadar ısıtmak için çevresel kontrol odası için yeterli süre tanıyın ° C. Stabilize etmek odasının sıcaklığı için alınan zaman farklı mikroskop kurulumları için değişecektir. </li><li> Mikroskop ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımı yükleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme çanak monte edin ve J774.1 makrofajlar bulmak için odak ayarı. Iletilen ışık, ve etki süreleri yüzdesi ayarlayarak TRITC ve DIC görüntüleri en iyi duruma getirin. </li><li> Görüntüleme çanak çıkarın ve ekleyin 3 × 10 6 FITC-lekeli C. t albicansO çanak. Zaman kaydedin o C albicans çanak eklenir. Sahneye çanak dönün ve FITC görüntülerin görünümünü gerekirse optimize. Gerekirse bir sayı listesini ayarlayın. </li><li> Tüm noktaları odak ve kanalları optimize edildiğinde görüntüleme başlasın. FITC, TRITC ve DIC görüntüler 6 saat boyunca her dakika yakalayın. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var. NG Gilead Sciences tarafından temel araştırma için sınırsız ödenekle destek almıştır. LE erken ilaç geliştirme GSK için danışman olarak çalışıyor.

Burada, makrofaj fagositozu incelemek için canlı hücre görüntü mikroskopi kullanımı için bir yöntem tarif edilmektedir. Video mikroskopi analizi için birden çok bilgi ek katmanlar sunuyor. Bir temel avantajı, verilerin alımını 6 saatlik gözlem süresi boyunca her bir zaman noktası için (tek bir deneyden elde) elde edilebilir olmasıdır. Daha da önemlisi, tarif edilen yöntem fagositozunu, tek aşamaları diferansiyel analizine olanak sağlar. Bu, örneğin, göstermiştir ki, C. toplam alımı değişiklikleri makrofaj hücre hatları ve birincil makrofajlar tarafından albicans glikozilasyon ve morfonogenezi mutantlar hücre-hücre teması kez hedef hücre veya yutulma oranı doğru makrofaj migrasyon değişiklikleri 7 kurulan ya bir sonucu olabilir. Bu deneyler sırasında önlemek için tuzaklar bir vardır. İlk olarak, bu deney prosedürü boyunca sabit çevre koşulları sağlamak için çok önemlidirDure. Bu, en iyi şekilde bir kaç saat deney başlamadan önce deneysel koşullar için ayarlanmış bir çevresel bölme içinde elde edilir. Video kalite z-pozisyonu ne olursa olsun, böylece manuel odaklama düzeltmeler için ihtiyacı ortadan kaldırarak mekanik veya termal değişikliklerin otomatik numune korumak için kızılötesi lazer kullanır gelişmiş modülleri büyük ölçüde bağımlıdır. Deneylerin genişletilmiş doğası göz önüne alındığında, düşük pozlama süreleri kolaylaştıracak yüksek floresan belirteçleri, kullanılarak minimize edilebilir lazer ışığına maruz kalınmasına ve ilişkili photobleaching ve photoconversion etkileri sınırlamak için önemlidir. Burada anlatılan FITC boyama protokolü, hızlı ve güvenilir. FITC olduğu gibi çok parlak ve istikrarlı bir leke, düşük pozlama süreleri gereklidir ve bu uzun zaman atlamalı filmleri için FITC idealdir vardır. Bununla birlikte, rutin Calcofluor beyaz PKH ve boyalar gibi etiketlenmiş organizmalar da dahil olmak üzere çeşitli hedef lekeleri çeşitli kullanın. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bizim yayınlanan çalışmaların çoğu geniş bir alan mikroskobu kullanılarak yapılır, ancak pozlama ayrıca bir iplik disk konfokal mikroskop kullanarak ve bizim elimizde bu time-lapse 3D video mikroskopi için esastır minimize edilebilir. Bu çalışma sırasında, görüntüleri 6 saat fagositoz tahlil fazla 1 dakika aralıklarla ele geçirildi. Görüntüler arasındaki aralığı soruşturma sürecine bağlı olarak ayarlanabilir. Bu tür veziküler ticareti gibi hızlı süreçlerin araştırılmasına Örneğin, aralık azaltılabilir. Minimum zaman aralığı mikroskop ve kamera özellikleri ile sınırlı olacaktır. Zamanlamaları ayarlarken akılda tutulması gereken bazı hususlar vardır. İlk olarak, anlık arasındaki süreyi azaltarak daha az puan imaged olabilir ve dosya boyutunu önemli ölçüde artmış olacak anlamına gelecektir. Tersine, çok fazla sayıda görüntü aralığını uzatan film süreklilik kaybettirirler. Bu yaklaşım uygulanabilirilke olarak, diğer patojenler ve konak hücreleri ölüyor alımını çalışma. Örneğin, son zamanlarda sialoadhesin-eksik farelerde kemik iliği kaynaklı makrofajlar büyük sialylated Campylobacter jejuni 8 bağlayıcı ve fagositoz azalır sergilenirken göstermiştir. Görüntü analizi hedef hücre boyutu bir azalma ile giderek zorlaşır Ancak, hedef boyutu, fizibilite için önemli bir belirleyicisidir. Sofistike görüntü analiz yazılımı hızlı Video mikroskop analizi için önemlidir ve bu 7 ayrı hücreleri ve tüm hücre göçlere çalışma algoritmaları nesil kolaylaştırmak için uygun biyoinformatik desteği ile birlikte olmalıdır. Göç ve bireysel makrofaj-C.albicans etkileşimlerin dakika-by dakika analizi için gelişmiş görüntü analizi yazılımı ile birlikte canlı hücre Video mikroskobu, C. karmaşıklığı içine benzersiz bir fikir verir macrophag tarafından albicans fagositozues. Diğer patojenler ve fagositler (dendritik hücreler, nötrofiller) incelemek ve daha detaylı ya da epitel ve endotel hücre katmanları gibi daha fizyolojik yüzeylerde görüntü hücre-hücre etkileşimleri 3B video mikroskobu geliştirmek için bu yöntemleri genişletmek için büyük bir potansiyel var. Bu teknik, konak-patojen etkileşimleri çalışma araçları yeni nesil bir parçasıdır ve dinamik süreçleri geniş bir yelpazede üzerinde ayrıntılı mekansal ve zamansal bilgi üretmek yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Amino asitler olmadan maya azot baz </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Adenin hemisulphate tuz </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar teknik (no. 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura terk </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Çamaşır suyu </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker Kırmızı DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm cam yemekler </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

Fungal patojenler, ve daha genel olarak mikroorganizmaların Fagositik klirensi, dört ayrı aşamadan oluşur kabul edilebilir: patojenler bulunduğu siteye fagositler (i) göç; desen ile patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPs) (ii) tanıma tanıyan reseptör (PRR); fagosit hücre zarı bağlı mikroorganizmalar (iii) yutulma ve olgunlaşan phagosomes ve yutulur parçacığın sindirimi içinde yuttu hücrelerin (iv) işleme. Kendi bütünlüğü içerisinde fagositoz değerlendirmek çalışmalar, 1, 2, 3, 4, 5, bilgilendirici olmakla birlikte, normal olarak farklı şekilde etkilenebilir göçü, yutulma ve phagosome olgunlaşma, içine işlem bozulmazlar ki içinde sınırlıdır. Ayrıca, bu tür çalışmaların tek bir olay olarak değil, sürekli bir dinamik bir süreç olarak alımını değerlendirmek. Biz son zamanlarda gelişmiş canlı hücre görüntüleme teknolojileri geliştirmiş, hem genetik fonksiyonel analizi ile bu kombine varpatojen ve konak hücreleri doğuştan gelen bağışıklık hücre fonksiyonu ve fungal patogenezi analizi için disiplinler arası bir platform oluşturmak. Bu çalışmalar sadece insan fagositler ve fungal patojenler ve daha genel olarak bulaşıcı mikroorganizmaların arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri sistematik zamansal analizi kullanılarak gözlenebilir fagositoz romanı yönlerini ortaya koymuştur. Örneğin, aşağıdaki tanımlamak başladı: (a) hücre yüzeyinde bileşenleri tanınması, yutulma ve mantar hücreleri 1, 6, 7, 8 ve öldürme işleminin her bir aşama için gereken, (b) kadar yüzey geometrisini makrofaj alımını ve maya hücreleri ve hifal 7 öldürme etkinliği etkiler, ve (c) yutulma hücre döngüsü ve makrofajlar 9, 10, davranış değişikliği yol açar nasıl. Tek bir zaman noktasında anlık aksine, canlı hücre görüntü mikroskopi eş olarak incelenmesi için konakçı hücreler ve patojenlerin geniş bir yelpazede sağlarhücre migrasyonu, replikasyonu ve veziküler kaçakçılığı da dahil olmak üzere dinamik süreçleri, geniş bir yelpazede üzerinde mekansal ve zamansal bilgi sağlayarak uzun süreler boyunca ntinuous dizileri. Burada ana ve mantar hücreleri hazırlamak ve video mikroskopi deneyler için nasıl ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu yöntemler diğer fagositler ve mikroorganizmalar ile ileride yapılacak çalışmalar için bir kullanıcı kılavuzu sağlayabilir.

Burada C. için temsili sonuçlar 6 saat canlı hücre Video mikroskobu deney sırasında murin makrofaj hücre hattı J774.1 tarafından albicans alımını. Şekil 1 C fagositozu gösteren temsili bir canlı hücre videosu mikroskopi film murin J774.1 makrofajlar tarafından albicans. Canlı hücre Video mikroskopi C. içselleştirilmesini sağlar dış Candida leke gerek kalmadan Görüntülenecek albicans. Bununla birlikte, bu deneyler sırasında, C. albicans makrofaj phagosome asitleştirilmesi sırasında soğutulur pH-duyarlı boya FITC (yeşil) kullanılarak lekelenmektedir, ve Candida (Şekil 1) dahili olarak yürütülür ki teyit kolaylaştırır edildi. Yutulan C. fazla yardım görselleştirme için albicans, makrofajlar kırmızı floresan boya LysoTracker kırmızı DND-99, lekeler asidik bölmeleri ve phagosome olgunlaşma özgül olmayan bir göstergesi olarak hizmet vermektedir kullanılarak boyandı.Şekil 2, bir canlı hücre görüntü mikroskopi deney bir hareketsiz resim ve C sayıda varyasyon gösterilmektedir albicans bireysel J774.1 makrofajlar tarafından yutulur. Bu deneyde, J774.1 makrofajlar% 82 oranında en az bir C yutan 6 saat fagositoz testin sonunda albicans hücre. Şekil 3, içsel C. sayıdaki makrofaj başına albicans hücreleri bildirilmiştir. C. ortalama sayısı makrofaj başına ele albicans 3.4 olduğunu, ancak ilginçtir makrofajlar 16 mantar hücreleri kadar yutmayın olabilir. Şekil 4 makrofaj phagocytosing C. gösteren temsili bir canlı hücre videoyu mikroskopi deney hareketsiz görüntüleri bir dizidir albicans hücreleri, makrofajlar ve sonuçta makrofaj erimesi ile hif büyümesi. Şekil 4, bu video mikroskopi hedef hücrelerin yutulma aşağıdaki olayların analizi sağlayan göstermektedir, yani veri ki için oluşturulabilirC. makrofajların lling Yutulan hedef hücrelerin sayısı ve morfojenezi ile ilgili olarak albicans hif, ve ne kadar makrofaj öldürme gerçek zamanlı olarak ele alınabilir phagosome olgunlaşma ile ilgilidir. Şekil 1. C. fagositozu gösteren canlı hücre videosu mikroskopi film murin J774.1 makrofajlar tarafından albicans. Makrofajlar kırmızı floresan boya LysoTracker kırmızı DND-99 ve C kullanılarak boyanmış albicans FITC (yeşil) ile lekeli. Makrofajlar ve C. albicans 2-bağımsız orta tam CO içinde 37 ° C &#39;de 6 saat arasında bir süre için birlikte kültüre edildi. Görüntüler 6 saat için 1 dakika aralıklarla ele geçirildi. Makrofajlar, C ile hücre-hücre temas kurarak görülebilir sonra C. alımını tarafından takip edilir albicans, makrofaj phagosomes içine albicans. Oklar C. işaret albicans önceden J774.1 makrofajlar tarafından yutulma için. Bu video da bu FITC floresans QuEnc olduğunu gösterirC. Aşağıdaki hed yutulma albicans. Ölçek çubuğu, 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Bireysel makrofajlar tarafından saran C. albicans&#39;ın sayı Şekil 2. Örnek canlı hücre görüntü mikroskopi hareketsiz görüntü gösteren varyasyonu. Makrofajlar (lekeli LysoTracker kırmızı kullanarak DND-99) FITC-lekeli C. ile birlikte kültüre edildi albicans (yeşil). Varyasyon C. sayısında var albicans (bir ok ile bir sonraki numara C. albicans sayısını belirtir içine aldı) saran, ve C. albicans morfolojisi (yani maya ayetler hif). Ölçek çubuğu, 20 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Şekil 3. C. sayısını gösteren grafik albicans 6 saat fagositoz testlerinin sonunda J774.1 murin makrofaj başına yutulur. Veri 2 bağımsız deneyin temsil eder. 100 makrofaj toplam 600 bireysel makrofaj bir toplam vererek, her bir deney 3 alanlardan sayıldı. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Şekil 4. Temsili bir canlı hücre videoyu mikroskobisi bir makrofaj gösteren deney (M) ve C. görüntüleri bir dizi albicans, (C) önce ve tanıma (A, B) ve, (C, D). C. sırasında ve alımından sonra albicans hifler makrofaj lizis (G) neden olabilir makrofaj (E, F), içerisinde büyümeye devam ediyor. Diğer makrofajlar yırtılması ve serbest C. sindirme girişimi siteye alınırlar albicans (H). Makrofajlar kırmızı floresan boya LysoTrac kullanılarak boyanmışker kırmızı DND-99, ve C. albicans FITC (yeşil) ile lekeli. FITC boyama C. Aşağıdaki söndürülür unutmayın J774.1 makrofajlar (C) tarafından albicans alımını. Ölçek çubuğu, 10 mikron.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis at JoVE.com

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri açıklamak<em&gt; Candida albicans</emMakrofajlar tarafından&gt; fagositoz. Bu yöntemler makrofaj migrasyon, tanıma, yutulma ve phagosome olgunlaşma aşamasına özgü analizine imkan ve fagositoz romanı yönlerden ortaya koymuştur.

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.9K Görüntüleme.  University of Aberdeen. Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri açıklamak Candida albicans fagositoz. Bu yöntemler makrofaj migrasyon, tanıma, yutulma ve phagosome olgunlaşma aşamasına özgü analizine imkan ve fagositoz romanı yönlerden ortaya koymuştur.

Video: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...