Questo lavoro è stato supportato dal BMBF Forschungsinitiative &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; e il Cluster di eccellenza &quot;Combustibili su misura da biomassa&quot;, che è finanziato attraverso l&#39;iniziativa di eccellenza da parte dei governi federali e statali tedesche per promuovere la scienza e di ricerca presso università tedesche.

1. Crescita di Wild Type N. tabacum Piante <ol><li> Per crescere N. tabacum L. cv. Piante Petit Havana SR1 sul suolo, luogo semi del tabacco su pentole adeguate riempiti con normale terriccio per la germinazione. Dopo 2 settimane, il trasferimento piantine ai singoli vasi. Incubare le piante in una serra con costante di 22 ° C (periodo buio) o 25 ° C (periodo di luce) e 70% di umidità relativa dell&#39;aria. Fornire illuminazione in un 16/8 ore di luce / buio ciclo (ad esempio Philips IP65 400 lampade W; 180 micromol · sec -1 · m -2; λ = 400-700 nm) e di acqua al giorno. </li></ol> 2. Espressione transiente di TrCel5A e TrCel5A-mCherry Proteine <ol><li> In condizioni sterili, scegliere singole colonie di Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) contenenti sia pTRAkc-ER-TrCel5A o pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry e trasferimento in una beuta contenente 10 ml di estratto di lievitobrodo (YEB, preparato come da specifiche del costruttore) medio e kanamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), e carbenicillina (100 mg / ml) per la selezione. Incubare per 36-40 ore a 26 ° C e 180 rpm. Nota: Il disegno di costrutti adeguati per l&#39;espressione della proteina è al di fuori del campo di applicazione del presente documento, ma per l&#39;orientamento, i metodi di Maclean et al 13, e Munro e Pellham 14 può essere seguito per la progettazione di costrutto.. </li><li> Prendere 200 ml di ciascuna coltura per inoculare 20 ml di YEB con le concentrazioni antibiotiche menzionati sopra e incubare alle stesse condizioni di prima. </li><li> Dopo 36-40 ore, preinduce culture aggiungendo 2 microlitri acetosyringon (200 mM concentrazione finale), 100 ml 40% (w / v) di glucosio e 200 ml di 1 M MES tampone pH 5.6. Incubare per una notte. </li><li> Preparare 100 ml di un tampone infiltrazione 2x (100 g / L di saccarosio, 3,6 g / L di glucosio, 8,6 g / L Murashige e Skoog sali basali, Aggiustare il pH a 5,6 con idrossido di potassio). </li><li> Misurare OD 600 delle culture con diluizioni 1:5 fino a raggiungere un diametro esterno 600 di 5-6. Calcolare il volume cultura necessaria per 30 ml di mezzo infiltrazione OD a 600. Aggiungere 15 ml di tampone di infiltrazione 2x, quindi aggiungere H 2 O deionizzata per rendere il buffer fino a 30 ml. </li><li> Prendere le piante da serra e utilizzare una punta della pipetta al nick il lato abaxial del 3 ° a 5 ° foglia dalla parte superiore per facilitare l&#39;infiltrazione. </li><li> Utilizzare un puntale al nick il lato abaxial delle foglie per facilitare l&#39;infiltrazione. </li><li> Riempire una siringa con mezzo infiltrazione e metterlo (senza ago) su una delle tacche precedenza. Sostenere siringa con un dito sul lato foglia adaxial. Premere con cautela il mezzo nel tessuto delle zone foglia interveinal. Nota: Dopo l&#39;infiltrazione, coltivare piante in una serra nelle stesse condizioni sopra descritte. Inoltre, mantenere una quota uguale di untreated, piante non transitori di espressione (NTEPs) come controlli, alle stesse condizioni previste per gli impianti infiltrati. </li></ol> 3. Valutazione della TrCel5A-mCherry Expression in fogli vegetali <ol><li> Dopo 4-6 giorni, prendere le piante infiltrati con A. tumefaciens contenenti pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry dalla serra e metterli in una stanza buia per analisi di fluorescenza. </li><li> Per visualizzare la fluorescenza nelle sezioni foglia esprimono TrCel5A-mCherry, impianti luce utilizzando una sorgente di luce portatile che emette luce verde a 515 nm con un filtro rosso (620-750 nm). Nota: In profondità Caratterizzazione dell&#39;espressione proteica nelle foglie delle piante può essere ottenuto da foglie sottili-sezionamento con vibratome e esame sotto luce e microscopia a fluorescenza. Per questo attenersi alla seguente procedura: <ol><li> Tagliare piccole sezioni di circa 5 x 5 mm formato da una foglia infiltrato ed integrarli nel 4% agarosio disciolto in tampone fosfato 50 mM (pH 5,7). </li><li> CutSezione di 80-90 micron dimensioni da foglie embedded utilizzando un vibratome. Sistemarle su un vetrino da microscopio, coprire con tampone o un coprioggetto ed esaminare utilizzando un microscopio a ingrandimento 10X con un rivelatore a fluorescenza, utilizzando la stessa lunghezza d&#39;onda e filtro sopraindicato. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A Estrazione di Foglie di tabacco <ol><li> Tagliare pezzi di foglie di tabacco per un peso di circa 1 g da piante infettate con A. tumefaciens contenenti pTRAkc-ER-TrCel5A e posto in un mortaio preraffreddato con azoto liquido. Aggiungere una quantità appropriata di azoto liquido per i campioni. Grind foglie in polvere con un pestello preraffreddato. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone fosfato (PBS) contenente fluoro phenylmethylsulfonyl 1 mM alla materia foglia terreno e mescolare fino a quando la maggior parte della materia foglia è in sospensione. Estratto centrifugare a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C e prendere proteici supernatante. </li><li> Centrifuge l&#39;estratto a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C e rimessa proteici surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet. Eliminare il pellet. </li><li> Parzialmente purificare TrCel5A incubando il supernatante contenente proteine ​​a 55 ° C per 10 min. Lasciar riposare a temperatura ambiente per altri 10 minuti, quindi si centrifuga a 15.000 xg per 10 minuti a RT. Ripetere parziale processo di purificazione per gli impianti non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Utilizzare questi esempi per tutti i seguenti esperimenti. Nota: Le soluzioni proteiche possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 settimana oa -20 ° C per 3 mesi. </li><li> Ripetere il processo di purificazione parziale per gli impianti non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Utilizzare questi esempi per tutti i seguenti esperimenti. Nota: Le soluzioni proteiche possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 settimana oa -20 ° C per 3 mesi. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blotting, e Azo-CMC zimografia di TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Acquistare o preparare il 12% (p / v) gel SDS-PAGE come da metodi stabiliti 15. </li><li> Sciogliere CMC in acqua fino a (w / v) di 1,5%. Per rendere CMC-gel SDS-PAGE, sostituire 1 ml di 1,5% CMC per 1 ml di acqua in una soluzione di 10 ml di SDS-PAGE mix gel, risultando in un 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE mix gel. Versare il gel normalmente. Nota: Assicurarsi che la CMC nella soluzione originale è completamente sciolto dalla combinazione di agitazione e riscaldamento a 40 ° C (ripetere direttamente prima della preparazione della soluzione di gel). </li><li> Denaturare campioni per ebollizione in presenza di SDS, secondo metodi stabiliti 12. Come controllo positivo, utilizzare una diluizione 1:500 di una cellulasi miscela disponibile commercialmente da T. reesei, come T. reesei ATCC 26921. Come controllo negativo utilizzare una soluzione proteica simile preparati da foglie non infiltrate (NTEPs). </li><li> Eseguire l&#39;elettroforesi secondo normali protocolli 15,ad esempio uso 200 V per ~ 50 min con elettroforesi arrestato una volta che il fronte del colorante raggiunto il fondo del gel. </li><li> Macchiare un gel SDS-PAGE usando 0,1% (w / v) blu brillante Coomassie e Destain utilizzando una miscela di acido glaciale metanolo / acetico. Nota: Rapid colorazione e decolorazione possono essere eseguite con blando riscaldamento la colorazione e decolorazione soluzioni, cioè usando un forno a microonde per ~ 15 sec per scaldare (ma non bollire) prima della colorazione e poi le soluzioni decolorante, cambiando la soluzione decolorante dopo 10 min , o una volta raffreddato, e ripetere con la nuova soluzione decolorante. </li><li> Eseguire Western blotting di un gel SDS-PAGE utilizzando protocolli stabiliti 16,17. Utilizzare i seguenti anticorpi: un anticorpo policlonale di coniglio contro un anticorpo anti-coniglio regione His-tag (primario) e una capra policlonale Fc che è stato coniugato con fosfatasi alcalina (secondario). Nota: anticorpi secondari dovrebbero essere selezionati per consentire la visualizzazione utilizzando nitroblu tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-indolyphosphate sale p-toluidina (NBT / BCIP), come descritto 18. </li><li> Eseguire in-gel proteico ripiegatura sul 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 1.5% (w / v) β-ciclodestrina, tampone fosfato-citrato 20 mM, pH 6,5, a temperatura ambiente con agitando delicatamente per 15 minuti 19. </li><li> Eliminare la soluzione di β-ciclodestrina e lavare rapidamente il gel con H 2 O. Incubare a temperatura ambiente in 50 mM tampone acetato di sodio (pH 4,8) per altri 15 min. Eseguire CMC zimografia usando l&#39;ripiegata 0,15% CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 30 mM acetato di sodio a pH 4,8 per 20 minuti a 50 ° C. </li><li> Eseguire CMC zimografia usando l&#39;ripiegata 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 30 mM tampone sodio acetato (pH 4,8) per 20 min a 50 ° C. </li><li> Macchiare il gel per 10 minuti utilizzando un 0,1% w / v soluzione di rosso Congo e Destain per 30 minuti o fino a bande chiare sono osservati usando 1 M NaCl. Lavare il gel con 0,3% (v / v) di acido acetico per l&#39;imaging più chiara. </li></ol> 6. 4 MUC Activity Assay di TrCel5A <ol><li> Preparare una soluzione stock di 10 mm 4-MUC nel 50% (v / v) di metanolo, e conservarla al buio a temperatura ambiente </li><li> Immediatamente prima del test, preparare una soluzione di lavoro 4-MUC 2x, composto da 1 mM a 4 MUC e 60 mM acetato di sodio, pH 4,8. </li><li> Eseguire il test su campioni contenenti 100 ml di proteina foglia (con o senza TrCel5A inducibile espressa), 100 microlitri di una miscela di cellulasi disponibile in commercio da T. 1:1.000 reesei, e pure H 2 O, rispettivamente. Eseguire ogni campione in triplicato. </li><li> Dispensare 100 ml di soluzione di lavoro di 4 MUC in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 100 ml di ciascun campione. </li><li> Determinare 0 min timepoint di 4-MU fluorescenza mediante spettroscopia a fluorescenza, utilizzando una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li><li> Incubare le piastre per 20min a 50 ° C, coperto con coperchi adesivi per evitare l&#39;evaporazione. Arrestare la reazione mediante congelamento (o combinando 100 ml 0,15 M glicina, pH 10,0, e 100 ml di campione in un piatto a parte). </li><li> Determinare il punto finale di 4-MU fluorescenza mediante spettroscopia a fluorescenza, utilizzando una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. Sottrarre 0 min da endpoint (20 min) timepoint avere la variazione nei valori di fluorescenza. </li></ol> 7. Azo-carbossimetilcellulosa Activity Assay di TrCel5A <ol><li> Preparare uno stock di 1,5% (w / v) Azo-CMC che è conservato a RT, e una soluzione di precipitazione contenente 18 mM acetato di zinco, 0,5 M di acetato di sodio, pH 5 e 80% di etanolo (v / v), conservare a camera temperatura. </li><li> Immediatamente prima del saggio, preparare una soluzione Azo-CMC 2x lavoro composto da 1% (w / v) Azo-CMC (in H 2 O) e 60 mM acetato di sodio, pH 4,8. </li><li> Unire 50 ml di campione e 50 ml di lavoroing soluzione in provette da 1,5 ml. </li><li> I campioni di prova contenenti 50 ml di proteina foglia (con o senza TrCel5A transitoriamente espressa); 100 ml di una cellulasi miscela disponibile commercialmente da T. reesei diluita 1:1000; e puro H 2 O. Eseguire i campioni e gli standard in triplice copia. </li><li> Incubare campioni per 20 min a 50 ° C. Arrestare la reazione aggiungendo 250 ml di soluzione di precipitazione. Vortex ogni campione vigorosamente per 10 sec a garantire soluzioni sono state completamente combinati. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min e poi di nuovo vortice. Centrifugare i campioni a 1.000 xg per 10 min. Prelevare 200 ml di ogni campione di surnatante ad una piastra a 96 pozzetti, facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Dosaggio con spettroscopia assorbanza alla lunghezza d&#39;onda di 590 nm. </li></ol> 8. PAHBAH Tenore di TrCel5A <ol><li> Utilizzare un buco pugno di tagliare un cerchio (~ 5,5 millimetri di diametro), della carta da filtro. Aggiungere 100 microlitri NaAc 60 mM, pH 4,8, 1 e00 ml di campioni, sia contenenti proteine ​​foglia (con o senza TrCel5A inducibile espressa) o T. commerciali miscela cellulasi reesei, diluito 1:1000, e incubare con filtro cerchi di carta per 20 ore a 50 ° C con 300 rpm agitazione. Per ogni campione incubato con carta da filtro, incubare anche una soluzione duplicato senza carta filtro per singoli sample-controlli. </li><li> Preparare una 330 mM p-idrossi idrazide dell&#39;acido benzoico (PAHBAH) Una soluzione sciogliendo PAHBAH in H 2 O con l&#39;aggiunta di 5 ml di HCl conc per un totale di 100 ml di soluzione, e conservare a RT. Nota: I migliori risultati si ottengono aggiungendo l&#39;HCl in un volume più piccolo di PAHBAH slurry, cioè 30 ml, che viene agitata sotto della temperatura per la dissoluzione prima di effettuare il volume a 100 ml con H 2 O. </li><li> Preparare PAHBAH soluzione B, contenente citrato di sodio 50 mM, 10 mM cloruro di calcio, e NaOH 500 mM e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Immediately prima del test, preparare una soluzione di lavoro 1.5x di 1 ml PAHBAH reattivo a 9 ml di soluzione tampone, negozio in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso (da utilizzare entro 4 ore). </li><li> Preparare i campioni in termostabili 0,2 o 0,5 ml provette. Combinare 5 ml di ciascuna soluzione incubati con carta da filtro (passo 8.1) 45 ml di H 2 O e 100 ml di soluzione di lavoro PAHBAH. Controlli a campione (campioni incubati senza filtro di carta) devono essere eseguiti con le stesse concentrazioni (5 microlitri del campione, 45 ml di H 2 O, soluzione di lavoro 100 microlitri PAHBAH). Testare e 5 standard (5 mL) contenenti tra 0 e 0,2 g / L di glucosio, e puro H 2 O. Eseguire i campioni e gli standard in triplice copia. </li><li> Incubare i campioni esattamente per 10 min a 100 ° C, poi raffreddare a temperatura ambiente per esattamente 10 min. Le soluzioni pipetta in una piastra da 96 pozzetti e dosaggio spettroscopiche ad una lunghezza d&#39;onda di 410 nm. Sottrarre i singoli campioni-controlli (incubate senza filtro di carta) da campioni per ottenere finalevalori. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Espressione ricombinante di cellulasi è un campo di grande interesse, a causa del desiderio di più efficienti sistemi di produzione di biocarburanti 1. Le piante offrono molte possibilità per la produzione di cellulasi successo, con caratteristiche come le tecniche di raccolta economica e metodi autohydrolysis essendo proprietà molto desiderabili per la produzione di biocarburanti su larga scala. Inoltre, l&#39;uso di diverse localizzazioni per la produzione di proteine ​​consentire, se necessario, mo...

<html> La degradazione della biomassa lignocellulosica e la sua conversione in combustibile liquido è stato immaginato come un metodo per ridurre la dipendenza dai combustibili fossili. Un ostacolo importante nella realizzazione di sistemi di elaborazione biomassa economicamente realizzabili è nella degradazione enzimatica della cellulosa ed emicellulosa 1. Sistemi di espressione vegetali mostrano un grande potenziale per la produzione di enzimi su scala industriale. Sistemi agricoli ad impianti di raccolta economicamente e di volume sono già stabiliti, come lo sono stati per migliaia di anni. La produzione di cellulasi in piante è desiderabile a causa di fattori come la facilità di autohydrolysis 2, e la possibilità di massimizzare l&#39;uso degli enzimi inferiori aumentando la digeribilità delle pareti cellulari vegetali 1. Infine, sistemi vegetali consentono il targeting di proteine ​​ricombinanti ad aree specifiche di cellule vegetali e sono in grado di modificare posttranslationally enzimi ove richiesto 3. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabacco) è molto comunemente usato come organismo modello per studi di espressione di proteine ​​eterologhe in piante, a causa della sua crescita e biomassa rapidi caratteristiche di accumulo 4. Espressione transiente di proteine ​​ricombinanti è una tecnica che permette la produzione di proteine ​​in brevi periodi di tempo 5, pur mantenendo la flessibilità nella localizzazione e quindi modificazioni post-traduzionali delle proteine ​​selezionate, cioè cellulasi. Ciò consente la produzione di cellulasi (s) per analisi di base, ponendo contemporaneamente le basi per ulteriori strategie di espressione in piante. Utilizzando tale strategia espressione transitoria, un&#39;endoglucanasi da glicosil idrolasi famiglia 5, Cel5A, derivato dal ospitante fungina Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 è prodotta (di seguito denominato TrCel5A). TrCel5A è una proteina di kDa 42 che è nativo glicosilata ed è molto attivo in HYDroylzing catene di cellulosa 7. La tecnica espressione transiente qui descritto è basato su un sistema relativamente comunemente usato, infiltrando la pianta lascia con Agrobacteria porta il gene di interesse in un vettore di espressione appropriato. Per consentire una rapida analisi di successo nell&#39;espressione planta, TrCel5A può anche essere espresso come proteina di fusione con mCherry, una proteina fluorescente monomerica originariamente derivato da Discosoma sp. Proteine ​​DsRed 8, con l&#39;aggiunta di sei residui di istidina (His-tag) fusi a il C-terminale (TrCel5A-mCherry). L&#39;espressione della proteina di fusione eterologa, TrCel5A-mCherry, può quindi essere monitorato all&#39;interno della pianta che cresce utilizzando luce verde per esaminare mCherry dispersione. Se lo si desidera, sezioni sottili di materiale vegetale può essere esaminato sotto luce verde al microscopio per stabilire la localizzazione specifica della proteina. Per questo lavoro, segnale e transit peptidi sono stati incorporati nel costrutto, di localizzare la proteina eterologa esportazione verso il reticolo endoplasmatico 9. Per analizzare l&#39;attività di cellulasi vegetali espresse, compreso TrCel5A, una serie di prove di attività cellulasi può essere eseguito. Dopo l&#39;estrazione del totale delle proteine ​​vegetali solubili, TrCel5A può essere parzialmente purificato utilizzando una tecnica di incubazione termica. Dimensione proteina viene stabilita tramite SDS-PAGE seguita da Western blotting. Zimografia può essere utilizzato per analizzare l&#39;attività contro substrati, ad esempio cellulosa che è stato carbossi-metilato (rendendo carbossimetil cellulosa: CMC) per solubilità 10. Attività cellulasi e glucosidasi può essere monitorato utilizzando il fluoroforo 4-metilumbelliferil (4-MU) associata a β-D-cellobioside (combinato: 4-MUC). Un altro metodo per valutare l&#39;attività di endoglucanasi prevede l&#39;analisi spettrometrica di CMC che è stata associata con un azo-dye (Remazolbrilliant Blu R) 11. Inoltre, l&#39;attività della proteina di entrambi endoglucanasi e una gamma di cellulasi può essere monitorato mediante l&#39;uso di un test di analisi zucchero, come l&#39;idrazide p-idrossi benzoico (PAHBAH) saggio 12. Queste tecniche possono essere utilizzate per chiarire e quantificare l&#39;attività della cellulasi espressa di interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Enzimi degradanti Cellulosa, cellulasi, sono obiettivi sia di ricerca e di interessi industriali. La preponderanza di questi enzimi in-a-cultura difficili organismi, come funghi ife costruzione e batteri anaerobici, ha accelerato l&#39;uso di tecnologie ricombinanti in questo campo. Metodi di espressione pianta sono un sistema desiderabile per la produzione su larga scala di enzimi e altre proteine ​​industrialmente utili. Qui, sono dimostrati metodi per l&#39;espressione transitoria di un endoglucanasi fungina, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum. Espressione della proteina successo è mostrato, monitorato mediante fluorescenza utilizzando una proteina di fusione mCherry-enzima. Inoltre, una serie di test di base sono utilizzati per esaminare l&#39;attività di transitoriamente espresso T. reesei Cel5A, compresi SDS-PAGE, Western blotting, zimografia, nonché fluorescenza e substrato saggi degradazione dye. Il sistema qui descritto può essere usato per produrre una cella attivaulase in un breve periodo di tempo, in modo da valutare il potenziale di ulteriore produzione in impianti attraverso sistemi di espressione costitutiva o inducibile.

TrCel5A e TrCel5A-mCherry sono stati espressi con successo in piante di tabacco usando il sistema di espressione transiente (Figure 1A e 1B). L&#39;esame del modello di espressione della proteina di fusione TrCel5A-mCherry rivelato foglie sane (Figura 1C), che ha mostrato un&#39;ampia espressione proteica sotto luce verde (Figura 1D). Estrazione delle proteine ​​solubili totali è stata eseguita su piante di tabacco che ...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L&#39;espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l&#39;attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In piante di tabacco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.7K Views.  RWTH Aachen University.  Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione. 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ricerca

Ambiente

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Trascrizione e metabolita Profiling per la valutazione del Tabacco Albero e pioppo come materia prima per l&#39;industria con sede a Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

L&#39;uso di ad alta risoluzione termografia a infrarossi (HRIT) per lo studio di ghiaccio nucleazione del ghiaccio e propagazione nelle piante

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Controllo RNAi mediata di aflatossine in arachidi: metodo per analizzare produzione di micotossine e transgene espressione nel Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patosistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

Valorizzazione del tasso di crescita iniziale delle Piante Agrarie mediante l&#39;utilizzo di campi magnetici statici

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

Valutazione di metano e protossido di azoto flussi da risaia per mezzo di statica chiuso Chambers mantenendo piante all'interno dello spazio di testa

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

Protocollo per la produzione di Video tridimensionale a raggi infrarossi di congelamento in piante

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water distribution in plant tissues in combination with freeze fixation techniques using liquid nitrogen (LN2). For woody species, however, preparations for observing the xylem transverse-cut surface involve some difficulties due to the orientation of wood fibers. Additionally, higher tension in the water column in xylem conduits can occasionally cause artifactual changes in water distribution, especially during sample fixation and collection. In this study, we demonstrate an efficient procedure to observe the water distribution within the xylem of woody plants in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM. At first, during sample collection, measuring the xylem water potential should determine whether high tension is present in the xylem conduits. When the xylem water potential is low (&#60; ca. &#8722;0.5 MPa), a tension relaxation procedure is needed to facilitate better preservation of the water status in xylem conduits during sample freeze fixation. Next, a watertight collar is attached around the tree stem and filled with LN2&#160;for freeze fixation of the water status of xylem. After harvesting, care should be taken to ensure that the sample is preserved frozen while completing the procedures of sample preparation for observation. A cryostat is employed to clearly expose the xylem transverse-cut surface. In cryo-SEM observations, time adjustment for freeze-etching is required to remove frost dust and accentuate the edge of the cell walls on the viewing surface. Our results demonstrate the applicability of cryo-SEM techniques for the observation of water distribution within xylem at cellular and subcellular levels. The combination of cryo-SEM with non-destructive in situ observation techniques will profoundly improve the exploration of woody plant water flow dynamics.

Observing the water distribution within the xylem provides significant information regarding water flow dynamics in woody plants. In this study, we demonstrate the practical approach to observe xylem water distribution in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM, which eliminates artifactual changes in the water status during sample preparation.

Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...