Este trabalho foi apoiado pelo BMBF Forschungsinitiative &quot;Bioenergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; eo Cluster de Excelência &quot;Combustíveis sob medida a partir de biomassa&quot;, que é financiado através da Iniciativa de Excelência pelos governos federal e estaduais alemães para promover a ciência e pesquisa em universidades alemãs.

1. Crescimento do tipo selvagem de N. tabacum plantas <ol><li> Para crescer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 no solo, colocar sementes de tabaco em potes adequados cheios de envasamento solo normal para a germinação. Após 2 semanas, a transferência de mudas para vasos individuais. Incubar as plantas em uma estufa com constante de 22 ° C (período escuro) ou 25 ° C (período de luz) e 70% de umidade relativa do ar. Fornecer iluminação em um ciclo claro / escuro 16/8 h luz (por exemplo, Philips IP65 400 lâmpadas W; 180 mol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) e água diariamente. </li></ol> 2. Expressão transiente de TrCel5A e TrCel5A-mCherry Proteínas <ol><li> Sob condições estéreis, escolher colónias isoladas de Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) contendo ou pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry e transferir para um erlenmeyer contendo 10 ml de extrato de leveduracaldo (YEB, preparado de acordo com as especificações dos fabricantes) médio e canamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), e carbenicilina (100 mg / ml) para a selecção. Incubar durante 36-40 horas a 26 ° C e 180 rpm. Nota: A concepção de construções apropriadas para a expressão da proteína está fora do âmbito deste documento, mas a título indicativo, os métodos de Maclean et al 13 e Munro e Pellham 14 pode ser seguido para a construção de criação.. </li><li> Tomar 200 mL de cada cultura para inocular 20 ml de YEB com as concentrações de antibióticos acima mencionados e incubar sob as mesmas condições que anteriormente. </li><li> Após 36-40 horas, as culturas preinduce por adição de 2 ul acetosyringon (200 uM concentração final), 100 ul de 40% (w / v) de uma solução de glucose e 200 ul de 1 M de MES pH 5,6. Incubar durante a noite. </li><li> Preparar 100 ml de um tampão de infiltração 2x (sais basais de 100 g / L de sacarose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige e Skoog, Ajustar o pH para 5,6 utilizando hidróxido de potássio). </li><li> Medida OD600 das culturas com diluições de 1:05 até atingir uma OD 600 de 5-6. Calcular o volume necessário para a cultura de 30 ml de meio de infiltração a OD 600. Adicionar 15 ml de tampão de infiltração 2x, em seguida, adicionar H2O desionizada para tornar o tampão até 30 ml. </li><li> Tome plantas de estufa e usar uma ponteira para nick do lado abaxial da 3 ª a 5 ª folha a partir do topo para facilitar a infiltração. </li><li> Use uma ponteira de nick o lado abaxial das folhas para facilitar a infiltração. </li><li> Encha uma seringa com meio de infiltração e colocá-lo (sem agulha) em um dos nicks feitas anteriormente. Apoio seringa com um dedo no lado inferior das folhas. Pressione o meio com cuidado para o tecido das zonas folha internervais. Nota: Após a infiltração, cultivar plantas em estufa sob as mesmas condições que as descritas acima. Além disso, manter uma proporção igual de untreated, plantas não-transitórios de expressão (NTEPs) como controles, nas mesmas condições que as plantas infiltrada. </li></ol> 3. Avaliação da TrCel5A-mCherry Expressão em folhas de plantas <ol><li> Depois de 4-6 dias, tome plantas infiltrados com A. Agrobacterium contendo pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry do efeito estufa e colocá-los em um quarto escuro por análise de fluorescência. </li><li> Para visualizar a fluorescência em secções foliares expressando TrCel5A-mCherry, as plantas de luz usando uma fonte de luz portátil que emite luz verde a 515 nm com um filtro vermelho (620-750 nm). Nota: Em profundidade caracterização da expressão da proteína nas folhas de plantas pode ser conseguida por folhas finas, corte com um vibratome e exame sob luz e microscopia de fluorescência. Para isso, siga os passos abaixo: <ol><li> Cortar pequenas secções de aproximadamente 5 x 5 mm de tamanho a partir de uma folha infiltrada e incorporá-las em 4% de agarose dissolvido em 50 mM de tampão de fosfato (pH 5,7). </li><li> Cortesecção de 80-90 mM de tamanho das folhas incorporadas utilizando um vibratome. Coloque-as sobre uma lâmina de microscópio, cobrir com um tampão ou uma lamela e examiná-las usando um microscópio no aumento de 10x com um detector de fluorescência, usando o mesmo comprimento de onda e filtro indicado acima. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A extração de folhas de tabaco <ol><li> Cortar pedaços de folhas de tabaco para um peso aproximado de 1 g a partir de plantas infectadas com A. Agrobacterium contendo pTRAkc-ER-TrCel5A e coloque em uma argamassa pré-resfriada com nitrogênio líquido. Adicionar uma quantidade apropriada de azoto líquido para as amostras. Moer deixa de pó usando um pilão pré-resfriada. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão fosfato salino (PBS) contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, para a folha de matéria solo e misturar até que a maior parte da matéria de folha é em suspensão. Extracto de centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C e levar sobrenadante contendo proteína. </li><li> Centrifuge o extracto a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C e levar sobrenadante contendo proteína tendo cuidado para não perturbar o sedimento. Desprezar o pelete. </li><li> Purificar parcialmente TrCel5A por incubação do sobrenadante que continha a proteína, a 55 ° C durante 10 min. Deixa-se repousar à temperatura ambiente durante mais 10 minutos, depois centrifugar a 15000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Repita o processo de purificação parcial para plantas não-infiltrados para obter amostras de controle. Usar estas amostras para todas as experiências seguintes. Nota: As soluções de proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana ou a -20 ° C durante até 3 meses. </li><li> Repetir o processo de purificação parcial por plantas não infiltrada para obter amostras de controlo. Usar estas amostras para todas as experiências seguintes. Nota: As soluções de proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana ou a -20 ° C durante até 3 meses. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blot, e Azo-CMC zimografia de TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Compra ou preparar 12% (p / v) géis SDS-PAGE como por métodos estabelecidos 15. </li><li> Dissolver CMC em água para obter uma solução a 1,5% (w / v). Para fazer géis de CMC-SDS-PAGE, substitui 1 ml de 1,5% de CMC para 1 ml de água em uma solução de 10 ml de mistura de gel de SDS-PAGE, o que resulta em um 0,1% (w / v) de CMC + 12% (w / v ) mistura em gel de SDS-PAGE. Despeje gel normalmente. Nota: certifique-se de que a CMC na solução inicial é completamente dissolvida por uma combinação de agitação e aquecimento para 40 ° C (repetir directamente antes da preparação da solução de gel). </li><li> Desnaturar amostras por ebulição na presença de SDS, de acordo com métodos estabelecidos 12. Como um controlo positivo, usar uma diluição de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. 1:500 reesei, tal como T. reesei ATCC 26921. Como controlo negativo utilizar uma solução de proteínas preparada de modo semelhante a partir de folhas não infiltrados (NTEPs). </li><li> Efectuar a eletroforese conforme protocolos normais 15,por exemplo, utilizar ~ 200 V durante 50 min com a electroforese interrompida uma vez a frente do corante atingir o fundo do gel. </li><li> Manchar um gel de SDS-PAGE utilizando 0,1% (w / v) de azul brilhante de Coomassie e destain usando uma mistura de metanol / ácido acético glacial. Nota: a coloração rápida e de descoloração pode ser realizada por aquecimento suave a coloração e descoloração de soluções, ou seja, usando um forno de microondas para ~ 15 seg para aquecer (mas não ferver) primeiro a coloração e, em seguida, as soluções de descoloração, mudando a solução de descoloração após 10 min ou quando esfriou, e repetir com a nova solução de descoloração. </li><li> Realizar Western blot de um gel de SDS-PAGE utilizando os protocolos estabelecidos 16,17. Usar os seguintes anticorpos: um anticorpo policlonal de coelho contra uma região Fc de His-tag (primário) e um anticorpo policlonal de cabra anti-anticorpo de coelho que foi conjugado com uma fosfatase alcalina (secundário). Nota: Os anticorpos secundários devem ser seleccionados para permitir a visualização utilizando nitroazul tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-p-toluidina indolyphosphate sal (NBT / BCIP), tal como descrito 18. </li><li> Realizar proteína em gel redobramento no 0,15% (w / v) de gel de CMC de SDS-PAGE através da incubação do gel de 1,5% (w / v) β-ciclodextrina, tampão fosfato-citrato 20 mM, pH 6,5, à temperatura ambiente com agitação suave durante 15 min 19. </li><li> Descartar a solução β-ciclodextrina e lavar rapidamente o gel com H 2 O. Incubar à temperatura ambiente em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 4,8) durante mais 15 min. Realizar CMC zimografia utilizando a 0,15% de CMC em gel de SDS-PAGE redobradas por incubação do gel em 30 mM de acetato de sódio tampão pH 4,8, durante 20 min a 50 ° C. </li><li> Realizar CMC zimografia utilizando o redobrado 0,15% (w / v) de gel de CMC de SDS-PAGE através da incubação do gel em tampão de acetato de sódio 30 mM (pH 4,8) durante 20 min a 50 ° C. </li><li> Corar o gel durante 10 min utilizando um 0.1% w / v de solução de vermelho de Congo e destain durante 30 minutos ou até que as bandas claras são observadas utilizando 1 M de NaCl. Lavar o gel com 0,3% (v / v) de ácido acético para melhor visualização. </li></ol> 6. MUC-4 Ensaio da Actividade de TrCel5A <ol><li> Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4-MUC em 50% (v / v) de metanol, e armazená-lo no escuro à temperatura ambiente </li><li> Imediatamente antes do ensaio, preparar uma solução de trabalho de 4-MUC 2x, composto de 1 mM de 4-MUC e 60 mM de acetato de sódio, pH 4,8. </li><li> Realizar este teste em amostras contendo 100 ul de proteína de folha (com ou sem TrCel5A expressa por indução), 100 ul de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. 1:1.000 reesei e puro H2O, respectivamente. Execute cada uma das amostras em triplicata. </li><li> Pipete 100 pi da solução de trabalho de 4-MUC em poços separados de uma placa de 96 poços, em seguida adicionar 100 ul de cada amostra. </li><li> Determinar 0 min ponto temporal de 4-MU fluorescência através de espectroscopia de fluorescência, utilizando um comprimento de onda de excitação de 360 ​​nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. </li><li> Incubar as placas por 20min a 50 ° C, cobertas com tampas de adesivo para evitar a evaporação. Parar a reacção por congelação (ou pela combinação de 100 mL de 0,15 M de glicina, pH 10,0, e 100 ul de amostra de uma placa separada). </li><li> Determinar o ponto final de 4-MU fluorescência através de espectroscopia de fluorescência, usando um comprimento de onda de excitação de 360 ​​nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. Subtrair 0 min a partir do terminal (20 min), ponto de tempo para obter a alteração dos valores de fluorescência. </li></ol> 7. Azo-carboximetil celulose Ensaio da Actividade de TrCel5A <ol><li> Preparar um estoque de 1,5% (w / v) Azo-CMC que é armazenada à TA, e uma solução de precipitação contendo 18 mM de acetato de zinco, 0,5 M de acetato de sódio, pH 5 e 80% de etanol (v / v), na loja quarto temperatura. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, preparar uma solução 2x Azo-CMC a trabalhar, composto por 1% (w / v) Azo-CMC (em H 2 O) e 60 mM de acetato de sódio, pH 4,8. </li><li> Combinar 50 mL de amostra e 50 ul do trabalhoing solução em tubos de 1,5 ml. </li><li> As amostras de ensaio contendo 50 ul de proteína de folhas (com ou sem TrCel5A transitoriamente expressa); 100 ul de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. reesei diluído 1:1.000; pura e H 2 O. Executar amostras e padrões em triplicata. </li><li> Incubar as amostras durante 20 min a 50 ° C. Parar a reacção por adição de 250 ul de solução de precipitação. Vortex cada amostra vigorosamente durante 10 segundos para garantir soluções foram completamente combinados. </li><li> Incubar as amostras a temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, novamente vórtice. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 10 min. Remover 200 ul de cada sobrenadante da amostra para uma placa de 96 poços, tendo cuidado para não perturbar o sedimento. </li><li> Ensaio usando espectroscopia de absorvância a um comprimento de onda de 590 nm. </li></ol> 8. PAHBAH Ensaio de TrCel5A <ol><li> Use um furador para cortar um círculo (~ 5,5 milímetros de diâmetro) de papel de filtro. Adicionar 100 ul de NaAc 60 mM, pH 4,8, e 100 ul de amostras, ou contendo proteína folha (com ou sem TrCel5A por indução expresso) ou um T. comercial mistura de celulase reesei, diluído 1:1000, e incubar com círculos de papel de filtro durante 20 horas a 50 ° C com agitação de 300 rpm. Para cada amostra incubada com papel de filtro, também incubar uma solução duplicata sem papel filtro como amostras-controles individuais. </li><li> Prepara-se uma 330 mM de p-hidroxi-hidrazida do ácido benzóico (PAHBAH) Uma solução por dissolução de PAHBAH em H 2 O, com a adição de 5 ml de HCl concentrado, para um total de 100 ml de solução, e armazenamento à temperatura ambiente. Nota: Os melhores resultados são obtidos pela adição do HCl a um menor volume de lama PAHBAH, isto é, 30 ml, que é agitada sob temperatura para ajudar a dissolução, antes de fazer o volume para 100 ml com H 2 O. </li><li> Prepare PAHBAH solução B, contendo citrato de sódio 50 mM, cloreto de cálcio 10 mM, e 500 mM de NaOH e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> Immediately antes do ensaio, preparar uma solução de trabalho de 1,5 x de reagente PAHBAH 1 ml de 9 ml de solução tampão, de armazenar em gelo até à sua utilização (para ser utilizado dentro de 4 horas). </li><li> Preparar as amostras em termoestáveis ​​0,2 ou tubos de 0,5 ml. Combinar 5 ul de cada solução incubadas com papel de filtro (passo 8.1), 45 ul de H2O e 100 ul de solução de trabalho de PAHBAH. Controles de exemplo (amostras incubadas sem filtro de papel) deve ser executado nas mesmas concentrações (5 mL da amostra, 45 2 O, solução de trabalho de 100 mL PAHBAH mL H). Além disso, teste 5 padrões (5 ul) contendo entre 0 e 0,2 g / L de glicose, e puro H2O Executar amostras e padrões em triplicata. </li><li> Incubar as amostras durante exactamente 10 minutos a 100 ° C, depois arrefecer à temperatura ambiente, durante exactamente 10 min. Soluções de pipeta para uma placa de 96 poços e espectroscopicamente ensaio num comprimento de onda de 410 nm. Subtrair amostra-controles individuais (incubadas sem filtro de papel) a partir de amostras para obter últimavalores. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A expressão recombinante de celulases é um campo de grande interesse, devido ao desejo de sistemas de produção de biocombustíveis mais eficientes 1. As plantas oferecem muitas possibilidades para a produção de celulase de sucesso, com recursos como técnicas de colheita econômica e métodos autohydrolysis sendo propriedades muito desejáveis ​​para a produção de biocombustíveis em larga escala. Além disso, o uso de diferentes localizações para a produção de proteínas de permitir, se neces...

<html> Degradação de biomassa lignocelulósica e sua conversão em combustível líquido foi concebido como um método para reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. Um obstáculo significativo na criação de sistemas de processamento de biomassa é economicamente viáveis ​​na degradação enzimática da celulose e hemicelulose 1. Os sistemas de expressão de plantas apresentam um grande potencial para a produção de enzimas a uma escala industrial. Agricultura, sistemas para instalações de colheita economicamente e em termos de volume já estão estabelecidos, como têm sido há milhares de anos. A produção de celulases em plantas é desejável devido a factores tais como a facilidade de autohydrolysis 2, e o potencial para maximizar o uso de níveis mais baixos de enzima, aumentando a digestibilidade das paredes das células das plantas 1. Finalmente, sistemas de plantas permitir o direccionamento das proteínas recombinantes para áreas específicas de células de plantas e são capazes de modificar posttranslationally enzimas onde requeridas 3. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabaco) é muito comumente utilizado como um organismo modelo para estudos de expressão de proteínas heterólogas em plantas, devido ao seu rápido crescimento e de biomassa de acumulação de recursos 4. A expressão transitória de proteínas recombinantes é uma técnica que permite a produção de proteína em períodos de tempo curtos 5, enquanto mantém a flexibilidade como para a localização e, portanto, as modificações pós-traducionais das proteínas seleccionadas, ou seja, celulases. Isso permite a produção de celulase (s) para a análise básica, ao mesmo tempo, preparando o terreno para novas estratégias de expressão em plantas. Usando essa estratégia expressão transitória, uma endoglucanase de glicosil hidrolases da família 5, Cel5A, derivado do hospedeiro do fungo Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 é produzido (doravante referida como TrCel5A). TrCel5A é uma proteína de 42 kDa, que é nativamente glicosilada e é altamente ativo em hidráulicaroylzing cadeias de celulose 7. A técnica de expressão transitória descrito aqui baseia-se num sistema relativamente comumente utilizado, infiltrando-se as folhas das plantas com a Agrobacterium transportando o gene de interesse num vector de expressão apropriado. Para permitir a análise rápida de expressão bem sucedida em planta, TrCel5A também pode ser expressa como uma proteína de fusão com mCherry, uma proteína fluorescente monomérica originalmente derivada de Discosoma sp. Proteína dsRed 8, com um período adicional de seis resíduos de histidina (His-tag) fundido com a o C-terminal (TrCel5A-mCherry). Expressão da proteína de fusão heteróloga, TrCel5A-mCherry, pode, assim, ser controlada dentro da planta em crescimento usando luz verde para examinar mCherry dispersão. Se desejado, as secções finas de material de planta pode ser examinado sob luz verde ao microscópio para estabelecer a localização específica da proteína. Para este trabalho, sinal e transentar péptidos foram incorporadas na construção para a localização da exportação da proteína heteróloga para o retículo endoplasmático 9. Para analisar a actividade de plantas, incluindo as celulases expressas TrCel5A, uma série de testes de actividade de celulase pode ser executado. Após a extracção do total de proteínas vegetais solúveis, TrCel5A podem ser parcialmente purificadas utilizando uma técnica de incubação térmica. O tamanho da proteína é efectuada por meio de SDS-PAGE seguido por Western blot. Zimografia pode ser utilizado para analisar a actividade contra os substratos, por exemplo, de celulose, que foi carboxi-metilado (fazendo carboximetilcelulose: CMC) para a solubilidade 10. Actividade de celulase e glicosidase pode ser monitorizada utilizando o fluoróforo 4-metilumbeliferilo (4-MU), associada com β-D-celobiósido (combinados: 4-MUC). Outro método para avaliar a actividade de endoglucanase envolve a análise de espectrometria de CMC que tem sido associado com um azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Além disso, a actividade da proteína de ambas as endoglucanases e uma variedade de celulases pode ser monitorizado pela utilização de um teste de análise de açúcar, tais como a hidrazida de p-hidroxi-benzóico (PAHBAH) ensaio de 12. Estas técnicas podem ser utilizados para elucidar e quantificar a actividade da celulase expressa de interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Enzimas degradantes Celulose, celulases, são alvos de pesquisa e interesses industriais. A preponderância destas enzimas in-a-cultura difíceis organismos, tais como fungos de construção de hifas e bactérias anaeróbias, acelerou o uso de tecnologias recombinantes neste campo. Métodos de expressão de plantas são um sistema conveniente para a produção em grande escala de enzimas e outras proteínas industrialmente úteis. Nisto, os métodos para a expressão transiente de uma endoglucanase de fungos, Trichoderma reesei Cel5A, Nicotiana tabacum são demonstradas. A expressão da proteína de sucesso é mostrado, monitorizada por fluorescência utilizando uma proteína de fusão mCherry enzima. Além disso, um conjunto de ensaios de base são usadas para examinar a actividade de T. expresso transitoriamente reesei Cel5A, incluindo SDS-PAGE, Western blot, zimografia, bem como a fluorescência e ensaios de degradação de substrato à base de corantes. O sistema aqui descrito pode ser usado para produzir uma célula activaULASE em um curto período de tempo, de modo a avaliar o potencial de produção em plantas através de sistemas de expressão constitutiva ou induzida.

TrCel5A e TrCel5A-mCherry foram expressos com sucesso em plantas do tabaco usando o sistema de expressão transiente (Figuras 1A e 1B). O exame do modelo da proteína de fusão TrCel5A-mCherry expressão revelado folhas saudáveis ​​(Figura 1C), que mostrou a expressão de proteínas largamente espalhada sob luz verde (Figura 1D). Extracção das proteínas totais foi realizada em plantas de tabaco que tinham folhas que ...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.7K visualizações.  RWTH Aachen University.  As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão. 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ambiente

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcrição e Metabolite Profiling de Avaliação dos Árvore Tabaco e Poplar como matéria-prima para a indústria baseada em Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Controle mediado por RNAi de aflatoxinas em amendoim: método para analisar a produção de micotoxinas e Transgene Expression na Amendoim /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patossistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

Aperfeiçoamento da taxa de crescimento inicial das plantas agrícolas usando campos magnéticos estáticos

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

Avaliação de metano e óxido nitroso fluxos de arrozal por meio estático fechado Chambers manter plantas dentro Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

Protocolo para a produção de vídeo infravermelho tridimensional de congelamento em plantas

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...