이 작품은 BMBF Forschungsinitiative에 의해 지원되었다 &quot;BioEnergie 2021 - Forschung 모피 Nutzung 폰 Biomasse 다이&quot;과학을 촉진하기 위해 독일 연방 정부 및 주 정부의 우수 이니셔티브 재정 지원을 통해 우수 &quot;바이오 매스에서 맞춤형 연료&quot;의 클러스터 독일 대학의 연구.

야생형 N.의 tabacum 식물 1. 성장 <ol><li> N. 성장 tabacum L. 이력서. 토양에 쁘띠 하바나 SR1 식물, 발아 일반 화분 용 흙으로 가득 적절한 냄비에 담배 씨앗을 배치합니다. 이주 후, 각각의 화분에 모종을 전송합니다. 상수 22 ° C (어두운 기간) 또는 25 ° C (빛 기간)과 온실에서 식물과 70 %의 상대 습도를 품어. 8분의 16 시간 빛 / 어둠주기에 조명을 제공합니다 (예 : 필립스 IP65 400 W 램프, 180 μmol · 초 -1 · m -2, λ = 400 ~ 700 nm의) 매일 물. </li></ol> TrCel5A 및 TrCel5A - mCherry 단백질의 2. 일시적 발현 <ol><li> 멸균 조건에서 Agarobacterium 튜메 파시 엔스의 단일 콜로니 (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) pTRAkc-ER-TrCel5A 또는 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry 10 ㎖의 효모 추출물을 함유하는 삼각 플라스크로 전송 중 하나를 포함을 선택선택을위한 국물 (YEB, 제조업체의 사양에 따라 준비) 중간 및 카나마이신 (50 ㎎ / ㎖), 리팜피신 (50 ㎎ / ㎖) 및 카르 베니 실린 (100 ㎎ / ㎖). 26 ° C에서 36 ~ 40 시간, 180 rpm으로 배양한다. 참고 : 단백질 발현에 적합한 구조의 디자인은이 글의 범위를 벗어나지 만, 지침, 맥클레인 등 13 먼로와 Pellham (14)의 방법은 구조 설계에 따라 할 수있다.. </li><li> 위에서 언급 한 항생제 농도 YEB 20 ㎖를 접종하고 이전과 같은 조건에서 배양 각 문화의 200 μl를 가져 가라. </li><li> 36-40 시간 후, 2 μL의 acetosyringon (200 μM 최종 농도), 100 ㎕의 40 % (w / v)의 포도당 용액 1 M MES 버퍼 산도 5.6의 200 μL.을 추가하여 문화를 preinduce 밤새 품어. </li><li> 배 침투 버퍼 (100g / L의 자당, 3.6 g / L의 포도당, 8.6 g / L 무라 시게와 스쿡 기초 염 100 ㎖를 준비,)의 수산화 칼륨을 사용하여 pH를 5.6로 조정합니다. </li><li> 이 OD 5-6의 (600)에 도달 할 때까지 1시 5분 희석와 문화의 OD 600을 측정합니다. OD 600에서 30 ㎖의 침투 매체에 필요한 문화의 볼륨을 계산합니다. 배 침투 버퍼의 15 ML을 추가하고 30 ㎖까지 버퍼를 만들기 위해 탈 H 2 O를 추가합니다. </li><li> 온실에서 식물을 타고 침투를 용이하게하기 위해 정상에서 5 번째 잎에 닉에 제 3의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 침투를 용이하게하기 위해 대화명에 잎의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 침투 매체와 주사기를 입력하고 이전에 만든 닉 중 하나에 (바늘없이)에 넣어. 향축 잎면에 손가락으로 주사기를 지원합니다. interveinal 잎 영역의 조직으로주의 깊게 매체를 누릅니다. 참고 : 침윤 후, 상술 한 바와 동일한 조건 하에서 식물을 온실에서 재배. 또한, untr의 동일한 비율을 유지침투 식물과 같은 조건에서 컨트롤로들 어갈, 비 일시적 발현 식물 (NTEPs). </li></ol> 식물 잎의 TrCel5A - mCherry 식 3. 평가 <ol><li> 4-6일 후, A. 침투와 식물을 온실에서 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry을 포함하는 형광 분석을위한 어두운 방에 배치 튜메 파시 엔스. </li><li> 빨간색 필터 (620-750 nm의)와 515 nm에서 녹색 빛을 방출 휴대용 광원을 사용 TrCel5A - mCherry, 빛 식물을 표현 잎 부분에서 형광을 시각화합니다. 참고 : 깊이에서 식물의 잎에서 단백질 발현의 특성은 빛과 형광 현미경 아래 vibratome 및 검사에 얇은 절편 잎에 의해 달성 될 수있다. 이를 위해 아래의 단계를 따릅니다 : <ol><li> 침투 잎에서 약 5 × 5 ㎜ 크기의 작은 부분을 잘라 아가로 오스 50 mM의 인산염 완충액 (pH 5.7)에 녹인 4 %에이를 포함 할 수 있습니다. </li><li> 절단vibratome를 사용하여 임베디드 잎에서 80 ~ 90 ㎛의 크기의 섹션. 버퍼 또는 커버 슬립 커버와 상기 한 바와 같은 파장 필터를 사용하여 형광 검출기로 10 배 배율의 현미경을 사용하여 검사, 현미경 슬라이드에 배치합니다. </li></ol></li></ol> 담배 잎에서 4. TrCel5A 추출 <ol><li> A. 감염된 식물에서 1g의 대략적인 무게에 담배 잎에서 조각을 잘라 pTRAkc-ER-TrCel5A 및 액체 질소로 미리 냉각 박격포 위치를 포함하는 튜메 파시 엔스. 샘플에 액체 질소의 적절한 금액을 추가합니다. 갈기는 예비 냉각 유를 사용하여 분말로 떠난다. </li><li> 지상 잎 물질에 1mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 추가하고 잎 물질의 대부분은 현탁액이 될 때까지 혼합한다. 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 단백질 함유 상층 액을 원심 분리기 추출물. </li><li> 원심FUGE 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 추출하고 펠렛을 방해하지 않도록주의하고 단백질 함유 상층 액을. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 부분적으로 10 분 동안 55 ° C에서 단백질 함유 상층 액을 배양하여 TrCel5A을 정화. RT에서 10 분 동안 15,000 XG에서 원심 분리 한 후, 추가로 실온에서 10 분 동안 휴식을 허용한다. 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물에 대한 부분 정제 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물의 부분적인 정화 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅 및 TrCel5A - mCherry &lt;의 아조-CMC Zymography/ P&gt; <ol><li> 구매 또는 설치 방법 15에 따라 (W / V) SDS-PAGE 젤 12 %를 준비합니다. </li><li> 1.5 % (w / v) 용액을 수득 물에 녹여 CMC. CMC-SDS-PAGE 젤을 만들려면 (w / v) CMC + 12 % (W / V 0.1 %의 결과로, 10 ㎖ SDS-PAGE 젤 혼합 용액에 물 1 ㎖에 1.5 % CMC 1 ㎖를 대체 ) SDS-PAGE 젤 혼합. 일반적으로 젤을 붓는다. 주 : (직접 사전 겔 용액을 제조하는 과정을 반복) 기존의 해결에서 CMC가 완전히 40 ° C로 교반 및 가열의 조합에 의해 용해되는 것을 확신합니다. </li><li> 설치 방법 (12)에 따라, SDS의 존재에 끓여 샘플을 변성. 양성 대조군으로서, T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 1:500 희석을 사용 이러한 T.로 reesei, reesei ATCC 26921. 음성 대조군으로 비 침투 잎 (NTEPs)에서 유사하게 제조 단백질 용액을 사용합니다. </li><li> 일반 프로토콜 15에 따라 전기 영동을 수행,염료 전면 겔의 하단에 도달하면 예를 들면 정지 전기로 50 분 ~ 200 V를 사용합니다. </li><li> 0.1 %를 사용한 한 SDS-PAGE 겔을 염색 (w / v) 쿠마시 브릴리언트 블루 및 메탄올 / 빙초산 혼합물을 사용한 destain. 참고 : 빠른 염색과 destaining 부드럽게 염색을 가열하고 10 분 후 destaining 솔루션을 변경, 따뜻하게 (그러나 비등) 먼저 염색을하고 destaining 솔루션 15 초 ~를위한 전자 레인지를 사용하여 즉, 솔루션을 destaining하여 수행 할 수 있습니다 또는 냉각하고, 새로운 destaining 용액으로 반복하면. </li><li> 설립 프로토콜 (16, 17)를 사용하여 하나의 SDS-PAGE 젤 웨스턴 블로 팅을 수행합니다. (보조), 알칼리 인산 분해 효소에 접합 된 그의 태그 (주) 및 폴리 클로 날 염소 항 - 토끼 항체 Fc 영역에 대한 다 클론 토끼 항체 : 다음과 같은 항체를 사용합니다. 참고 : 2 차 항체는 nitroblue의 테트라를 사용하여 시각화를 가능하게 선택해야윰 chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;- indolyphosphate의 P-톨루이딘 소금 (NBT / BCIP), 18 설명한대로. </li><li> 0.15 %에 접힘에 젤 단백질 (W / V) 실온에서 β-사이클로 덱스트린, 20 mM의 인산 구연산 버퍼, 산도 6.5, 1.5 %에 젤을 배양하여 (w / v) CMC SDS-PAGE 젤을 수행 부드러운 15 분 19 진탕. </li><li> β-사이클로 덱스트린 솔루션을 취소하고 잠시 H 2 O와 젤을 씻어 추가로 15 분 동안 50mM의 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에서 RT에서 배양한다. 50 ℃에서 20 분 동안 30 mM의 아세트산 나트륨 완충액 pH를 4.8에서 젤을 배양하여 접힘 0.15 % CMC SDS-PAGE 젤을 사용하여 CMC의 zymography를 수행 </li><li> (w / v) CMC SDS-PAGE 겔 50 ℃에서 20 분 동안 30 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에 젤을 배양하여 접힘 0.15 %를 사용하여 CMC의 zymography를 수행 </li><li> 0.1 %를 사용하여 10 분 동안 젤을 얼룩 W / 30 분 콩고 레드 솔루션 destain V 또는 명확한 밴드가 1 M 나를 사용하여 관찰 될 때까지CL. 선명한 영상을위한 0.3 % (V / V) 아세트산 젤을 씻으십시오. </li></ol> TrCel5A 6. 4 MUC 활동 분석 <ol><li> 50 %에서 10 mM의 4-MUC (v / v) 메탄올의 스톡 용액을 준비하고, 그것을 실온에서 어두운 곳에서 보관 </li><li> 직전에 분석을, 4-MUC 배 일 1 ㎜ 4-MUC로 구성된 솔루션, 60 MM의 아세트산 나트륨, 산도 4.8을 준비하고 있습니다. </li><li> (inducibly 표현 또는 TrCel5A없이) 잎 단백질의 100 μL, T. 100 ㎕를 시판 셀룰라아제의 혼합물을 포함하는 샘플에서이 테스트를 수행 reesei의 1:1,000, 및 순수한 H 2 O였다. 세중의 각 샘플을 실행합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 4 MUC 작업 솔루션의 피펫 100 μL는, 각 샘플의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통해 4-MU 형광 0 분 평가시기를 결정한다. </li><li> 20 접시를 품어50 ° C에서 분, 증발을 방지하기 위해 접착제 뚜껑으로 덮여있다. 냉동 (또는 ㎕의 0.15 M 글리신, pH가 10.0, 별도의 플레이트에 샘플 100 μl를 (100)를 결합하여)에 의해 반응을 중지합니다. </li><li> 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통한 4-MU 형광의 종점을 결정한다. 형광 값의 변화를 얻기 위해 엔드 포인트 (20 분) 평가시기에서 0 분을 뺍니다. </li></ol> TrCel5A 7. 아조-카르복시 메틸 셀룰로오스 활동 분석 <ol><li> 1.5 %의 재고를 준비 (w / v) RT에서 저장되고, 아조 - CMC 18 mM의 아연 아세테이트, 0.5 M 아세트산 나트륨, pH를 5 ~ 80 % 에탄올 (v / v), 룸에서 상점을 함유 침전 용액 온도. </li><li> 직전에 분석에 1 %로 구성 아조-CMC 배 작업 솔루션, (W / V) 아조-CMC (H 2 O의)와 60 mM의 나트륨 아세테이트, 산도 4.8을 준비하고 있습니다. </li><li> 샘플의 50 μL와 작품의 50 μl를 결합1.5 ML 튜브에 용액을 주입. </li><li> (일시적으로 표현하거나 TrCel5A없이) 잎 단백질의 50 μl를 포함하는 테스트 샘플; T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 100 μL reesei는 1:1,000 희석; 순수한 H 2 O 세중 실행 시료와 표준. </li><li> 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 품어 침전 용액 250 μl를 첨가하여 반응을 정지. 소용돌이 적극적으로 10 초 동안 각각의 샘플 솔루션이 완전히 결합 된 보장합니다. </li><li> 다시 10 분 후 소용돌이 RT에서 샘플을 품어. 10 분 1,000 XG에 원심 분리기 샘플. 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 96 - 웰 플레이트에 각 시료의 상층 액 200 μl를 제거합니다. </li><li> 590 ㎚의 파장에서 흡수 분광법을 이용하여 분석. </li></ol> TrCel5A 8. PAHBAH 분석 <ol><li> 여과지의 원형 (~ 5.5 mm 직경)을 잘라 구멍 펀치를 사용합니다. 100 ㎕의 60 mM의 NaAc, 산도 4.8, 1 추가샘플 (inducibly 표현하거나 TrCel5A없이) 잎의 단백질을 포함하는 하나 또는 상업적 T. 00 μL reesei 셀룰라아제 혼합물, 1:1,000 희석하고, 300 rpm으로 흔들어으로 50 ° C에서 20 시간 동안 필터 종이 서클 품어. 종이 필터와 함께 배양 각 샘플의 경우, 개별 샘플 - 컨트롤과 같은 종이 필터없이 중복 솔루션을 품어. </li><li> RT에서 5 100 ㎖의 용액의 총 염산 집중 ML 및 저장소의 추가와 H 2 O에 PAHBAH을 용해하여 330 밀리미터 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 지드 (PAHBAH) 솔루션을 준비합니다. 참고 : 최상의 결과를 H 2 O 100 ml의 볼륨을하기 전에 해산을하는 데 도움이 온도에서 교반 PAHBAH 슬러리, 즉 30 ㎖의 작은 부피에 염산을 추가하여 달성된다 </li><li> RT에서 50 mM의 시트르산 나트륨, 10mM의 염화칼슘 및 500 mM의 수산화 나트륨 및 판매자를 함유 PAHBAH 용액 B를 준비한다. </li><li> IMMEDiately 전에 분석에 사용할 때까지 (4 시간 내에서 사용되는) 얼음에 10 ㎖의 완충 용액, 상점에 1 ㎖의 PAHBAH 시약의 1.5 배의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 내열성 0.2 또는 0.5 ML 튜브에 샘플을 준비합니다. 종이 필터 (단계 8.1) H 2 O 45 μL와 PAHBAH 작업 용액 100 μL와 함께 배양 각 솔루션의 5 μL를 결합합니다. 샘플 컨트롤 (종이 필터없이 배양하는 샘플)는 같은 농도 (5 ㎕의 샘플, 45 μL의 H 2 O, 100 μL의 PAHBAH 작업 용액)에서 실행해야합니다. 또한 0과 포도당 0.2 g / L를 포함하는 5 기준 (5 μL), 순수한 H 2 O를 테스트 세중 실행 시료와 표준. </li><li> 100 ° C에서 정확히 10 분 동안 샘플을 품어 후 정확히 10 분 동안 실온에서 냉각. 410 nm의 파장에서 96 웰 플레이트와 분석 광학적 피펫 솔루션을 제공합니다. 최종 얻기 위해 샘플에서 (종이 필터없이 배양) 개별 샘플 컨트롤을 빼기값. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function:+Insights+from+sequence+analysis,+biophysical+measurements,+and+molecular+simulation.">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica.">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

셀룰라아제의 재조합 발현으로 인해보다 효율적인 바이오 연료 생산 시스템 1에 대한 욕구에 큰 관심 분야입니다. 식물은 경제 수확 기술과 대규모 바이오 연료 생산을위한 매우 바람직한 특성 인자가 가수 분해 방법 등의 기능과 함께, 성공 셀룰라아제 생산을위한 많은 가능성을 제공합니다. 또한, 단백질을 제조하기위한 다른 언어 버전의 사용이 필요한 경우, 번역 후 변형 (20)에게<...

<html> 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스 액체 연료로의 전환의 저하는 화석 연료에 대한 의존도를 줄일 수있는 방법으로 구상하고있다. 경제성 매스 처리 시스템을 확립 한 가지 중요한 장애물은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 (1)의 효소 적 분해에있다. 식물 발현 시스템은 산업 규모에 효소의 생산을위한 큰 잠재력을 보여줍니다. 그들은 수천 년 동안왔다으로 수확 식물 경제적 볼륨에 농업 시스템이 이미 설치되어 있습니다. 식물에서 셀룰라아제의자가 가수 분해에 의한 생산은 2의 용이성 및 식물 세포벽 하나의 소화성을 증가시켜 하부 효소 수준의 사용을 최대화하기위한 전위와 같은 요인들에 바람직하다. 마지막으로, 식물 시스템은 식물 세포의 특정 영역에 대한 재조합 단백질의 타겟팅을 허용하고 세 posttranslationally 필요한 효소를 수정할 수있다. &quot;ve_content&gt; 된 담배 (담배)은 매우 일반적으로 인해 빠른 성장과 바이오 매스 축적 기능 4, 식물의 이종 단백질 발현 연구를위한 모델 생물로 사용됩니다. 재조합 단백질의 일시적 발현은 현지화으로 유연성을 유지하고, 따라서 선택된 단백질, 즉 셀룰라아제의 번역 후 변형 동안에, 짧은 시간 기간 5에서 단백질 생산을 가능하게하는 기술이다. 또한 식물에서 더 표현 전략을위한 기반을 마련하면서는 기본적인 분석을위한 셀룰라아제 (들)의 생산을 가능하게한다. 이러한 일시적 발현 전략을 사용하여, 진균 숙주 트리코더마 reesei (Hypocrea의 jecorina)로부터 유도 된 글리코 하이드 롤라 가족 05 Cel5A, 6 endoglucanase은 (이하 TrCel5A라고 함) 제조된다. TrCel5A는 기본적으로 당화 된 42 kDa의 단백질과 유압에 매우 활성화되어셀룰로오스 사슬 7을 roylzing. 여기에 설명 된 일시적 발현 기술은 식물 아그로 박테리아는 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 운반 남긴다 침윤, 비교적 널리 사용되는 시스템에 기초한다. 란타 식 성공의 신속한 분석을 허용하기 위해 TrCel5A 또한 mCherry 원래 Discosoma SP에 유래 모노머 형광 단백질과 융합 단백질로서 발현 될 수있다. 단백질에 융합 된 추가적인 여섯 히스티딘 (그의 태그)와, 8 DsRed를 C-말단 (TrCel5A - mCherry). 이종 융합 단백질, TrCel5A - mCherry의 표현 따라서 mCherry 분산을 검토하는 녹색 빛을 사용하여 식물 성장에서 모니터링 할 수 있습니다. 원하는 경우, 식물 재료의 얇은 부분은 단백질의 특정 지역화를 확립 녹색광 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 작품, 신호 전송 용앉아 펩티드는 소포체 9 이종 단백질의 수출을 집중하기 위해, 구조에 통합되었다. 셀룰라아제 활성 시험의 수가 실행될 수 TrCel5A 포함한 식물 발현 셀룰라아제의 활성을 분석한다. 전체 수용성 식물 단백질 추출 후 TrCel5A 부분적 열 배양 기술을 이용하여 정제 할 수있다. 단백질의 크기는 웨스턴 블로 팅 다음 SDS-PAGE를 사용하여 설정됩니다. 용해도 10 : (CMC 카르복시 메틸 셀룰로오스를 만드는) Zymography는 기판, 카르복시 메틸화왔다 예 셀룰로오스 대 활성을 분석하기 위해 사용될 수있다. 셀룰라아제 및 글루코시다 활동 (: 4-MUC 결합) β-D-cellobioside과 관련된 형광 물질 4 - 메틸 움 (4-MU)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. endoglucanase 활동을 평가하는 또 다른 방법은 아조-D와 연결되었습니다 CMC의 분광 분석을 포함너희 (Remazolbrilliant 블루 R) 11. 또, endoglucanases 및 셀룰라아제의 범위 모두의 단백질 활성은 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 자이드 (PAHBAH) 분석으로서 12 설탕 분석 시험의 사용에 의해 모니터링 될 수있다. 이러한 기술은 또한 표현 셀룰라아제의 활성을 규명하고 정량화 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

셀룰로오스 분해 효소, 셀룰라아제는 연구와 산업의 이익 모두 대상입니다. 그러한 균사 구축 진균류 및 혐기성 세균과 같은 어려운 배양 생물, 이러한 효소의 우세는,이 분야에서 재조합 기술의 사용을 재촉하고있다. 식물 발현 방법은 효소 및 기타 산업적으로 유용한 단백질의 대규모 생산을위한 바람직한 시스템이다. 여기서,는 담배 tabacum에서 곰팡이 endoglucanase, 트리코더마 reesei Cel5A의 일시적 발현을위한 방법이 설명되어 있습니다. 성공적인 단백질 발현은 mCherry 효소 융합 단백질을 사용하여 형광 모니터링 도시된다. 또한 기본적인 테스트 세트는 일시적 발현 T.의 활성을 조사하는 데 사용 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, zymography뿐만 아니라 형광 염료 계 기질 분해 분석법 등 reesei Cel5A. 여기에 설명 된 시스템은 활성 세포를 생산하는 데 사용될 수있다짧은 시간주기에서 ulase, 구성 적 또는 유도 성 발현 시스템을 통해 식물에 추가 생산 잠재력을 평가하도록.

TrCel5A 및 TrCel5A-mCherry는 일시적 발현 시스템 (도 1a 및도 1b)를 사용하여 담배 식물에서 성공적으로 발현되었다. TrCel5A - mCherry 융합 단백질의 발현 패턴의 시험은 건강한 나뭇잎 녹색 빛 (그림 1D)에서 널리 단백질 발현을 보였다 (그림 1C)를 공개했다. 총 수용성 단백질의 추출이 포함 된 잎을 가지고 담배 공장에서 수행 된 일시적 TrCel5A 단?...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.8K 조회수.  RWTH Aachen University.  담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다. 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

연구

환경과학

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

식물의 얼음 핵 얼음 전파의 연구에 대한 고해상도 적외선 체열 (HRIT)의 사용

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

땅콩에서 아플라톡신의 RNAi를 매개 제어 : 방법은 땅콩에 곰팡이 독소 생산 및 형질 전환 유전자 발현을 분석 /<em&gt; 아스 페르 길 루스</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

정적 자기장을 사용하여 농업 식물의 초기 성장 속도의 향상

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

메탄과 아산화 질소 용 정전기에 의하여 벼 분야에서의 평가 폐쇄 챔버 Headspace 내 식물 유지

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

식물에 동결의 3 차원 적외선 비디오를 제작 하기 위한 프로토콜

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water distribution in plant tissues in combination with freeze fixation techniques using liquid nitrogen (LN2). For woody species, however, preparations for observing the xylem transverse-cut surface involve some difficulties due to the orientation of wood fibers. Additionally, higher tension in the water column in xylem conduits can occasionally cause artifactual changes in water distribution, especially during sample fixation and collection. In this study, we demonstrate an efficient procedure to observe the water distribution within the xylem of woody plants in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM. At first, during sample collection, measuring the xylem water potential should determine whether high tension is present in the xylem conduits. When the xylem water potential is low (&#60; ca. &#8722;0.5 MPa), a tension relaxation procedure is needed to facilitate better preservation of the water status in xylem conduits during sample freeze fixation. Next, a watertight collar is attached around the tree stem and filled with LN2&#160;for freeze fixation of the water status of xylem. After harvesting, care should be taken to ensure that the sample is preserved frozen while completing the procedures of sample preparation for observation. A cryostat is employed to clearly expose the xylem transverse-cut surface. In cryo-SEM observations, time adjustment for freeze-etching is required to remove frost dust and accentuate the edge of the cell walls on the viewing surface. Our results demonstrate the applicability of cryo-SEM techniques for the observation of water distribution within xylem at cellular and subcellular levels. The combination of cryo-SEM with non-destructive in situ observation techniques will profoundly improve the exploration of woody plant water flow dynamics.

Observing the water distribution within the xylem provides significant information regarding water flow dynamics in woody plants. In this study, we demonstrate the practical approach to observe xylem water distribution in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM, which eliminates artifactual changes in the water status during sample preparation.

극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...