この作品は、BMBF Forschungsinitiativeによってサポートされていました」BioEnergie 2021 - Forschung毛皮はNutzungフォンBiomasseダイ」と科学を推進するため、ドイツ連邦政府と州政府によってエクセレンス·イニシアチブを通じて資金を供給されている優秀「バイオマスからのオーダーメイド燃料」、のクラスターをとドイツの大学での研究。

野生型のN.タバコ植物の 1。成長<ol><li> Nを成長させるタバコ L. CV。土壌へのプチハバナSR1植物は、発芽のための通常のポッティング土壌を充填適切なポットにタバコ種子を置く。 2週間後、個々のポットに苗を移す。定数22℃（暗期）または25℃（明期）および70％の相対湿度で温室で植物を培養する。 8分の16時間明/暗サイクルで照明を提供（ 例えばフィリップスIP65 400Wのランプ、180マイクロモル·秒-1·メートル-2;λ= 400〜700 nm）で毎日水。 </li></ol> TrCel5AとTrCel5A-mCherryタンパク質の2。一過性発現<ol><li>無菌条件下で、pTRAkc-ER-TrCel5AまたはpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryのいずれかを含むAgarobacterium tumefaciensの単一のコロニー（GV3101 :: pMP90RK GMR、KMR、RifR）をピックアップし、10ミリリットルの酵母抽出物を含有する三角フラスコに移すブロス（YEB、製造業者の仕様書に従って調製）培地およびカナマイシン（50 mg / ml）を、リファンピシン（50 mg / ml）を、および選択のためのカルベニシリン（100 mg / mlで）。 26℃、180rpmで36〜40時間インキュベートする。注意：タンパク質発現のための適切な構築体のデザインは、本稿の範囲外ですが、指導のため、マクリーンら 13とマンローとPellham 14の方法には、構造物の設計のために続けることができます。 </li><li>上記の抗生物質濃度をYEBの20ミリリットルを接種し、前と同じ条件でインキュベートする各培養液200μlを取る。 </li><li> 36-40時間後、2μlのアセトシリンゴン（200μM最終濃度）、100μLの40％（w / v）のグルコース溶液と1 M MES緩衝液（pH5.6）を200μl。を添加することによって培養物をpreinduce一晩インキュベートする。 </li><li> 2×浸潤緩衝液（100 g / Lのスクロース、3.6グラム/ Lのグルコース、8.6グラム/ Lムラシゲ·スクーグ基本塩を100mlを調製、）、水酸化カリウムを使用して5.6にpHを調整する。 </li><li>それは、OD 5-6の600に到達するまで1時05希釈液との文化のOD 600を測定します。 OD 600で30ミリリットル浸潤培地に必要な培養液量を計算します。 2X浸潤バッファの15ミリリットルを追加し、30ミリリットルまでのバッファを作るために、脱イオンH 2 Oを加える。 </li><li>温室から植物を取り出し、浸透を容易にするために、上から5 番目の葉に、ニックに3 回目の背軸側をピペットチップを使用しています。 </li><li>侵入を容易にするために、ニックに葉の背軸側をピペットチップを使用してください。 </li><li>浸透培地で注射器を記入し、以前に作らニックの1に（針なしで）それを置く。向軸、葉側の指で注射器をサポートしています。 interveinal葉ゾーンの組織の中に慎重に培地を押してください。注意：浸透後、上記と同様の条件で、温室内の植物を栽培しています。また、untrの同じ割合を維持浸透させた植物と同じ条件下で、コントロールとしてeated、非一過性発現植物（NTEPs）。 </li></ol>植物の葉におけるTrCel5A-mCherry発現の3。評価<ol><li> 4-6日後、Aに浸透させた植物を取る温室からpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryを含有し、蛍光分析のために、暗い部屋の中に置いツメファシエンス 。 </li><li>赤色フィルター（620から750ナノメートル）と515 nmの緑色の光を発する携帯用光源を用いTrCel5A-mCherry、光の植物を表す葉の切片の蛍光を可視化した。注：深さは、植物の葉におけるタンパク質発現の特徴付けは、光及び蛍光顕微鏡下で検査し、ビブラトームで薄切片の葉によって達成することができる。このために、以下の手順に従います。 <ol><li>浸潤葉から約5×5mmの大きさの小さな部分をカットし、アガロース50 mMリン酸緩衝液（pH 5.7）に溶解し、4％に埋め込む。 </li><li>カットビブラトームを使用して埋め込まれた葉から、80〜90ミクロンの大きさの部分。バッファまたはカバースリップで覆い、上述と同じ波長フィルタを用いて、蛍光検出器を用いて10倍の倍率で顕微鏡を使用して調べ、顕微鏡スライド上に置きます。 </li></ol></li></ol>タバコ葉から4。TrCel5A抽出<ol><li> A.に感染した植物から1グラムのおおよそのウェイトにタバコの葉から作品をカット液体窒素で予冷し乳鉢でpTRAkc-ER-TrCel5Aと場所を含むツメファシエンス 。サンプルに液体窒素を適量入れる。グラインドは予備冷却乳棒を使用して粉末に残します。 </li><li>接地葉印刷物に1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mlを加え、葉状物質の大部分が懸濁液中になるまで混合する。 4℃で20分間15,000 xgで遠心抽出物およびタンパク質を含む上清を取る。 </li><li>セントリフーガ4℃で20分間15,000×gでの抽出物とは、ペレットを破壊しないように注意しながら、タンパク質を含む上清を取る。ペレットを捨てます。 </li><li>部分的に10分間55℃でタンパク質含有上清をインキュベートすることによってTrCel5Aを精製する。 RTで10分間15,000 xgで遠心分離し、次いで、さらに10分間室温で休息できるようにする。対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。 </li><li>対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。 </li></ol> 5。、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびTrCel5A-mCherry &lt;アゾ-CMCザイモ/ pの&gt; <ol><li>購入または確立された方法15に従って（w / v）のSDS-PAGEゲル12％を準備。 </li><li> 1.5％（w / v）の溶液を得、水にCMCを溶解する。 CMC-SDS-PAGEゲルを作るために、0.1％（w / v）のCMC + 12％（重量/体積をもたらすを10mlのSDS-PAGEゲル混合液に1mlの水1.5％CMC 1mlの置き換え）SDS-PAGEゲルミックス。通常のゲルを注ぐ。注意：元の溶液中のCMCが完全に40℃（前ゲル溶液を調製する直接繰り返す）に攪拌および加熱の組み合わせにより溶解していることを確認してください。 </li><li>確立された方法12に従って、SDSの存在下で沸騰させることにより、サンプルを変性させる。陽性対照として、T.から市販のセルラーゼ混合物の1:500希釈を使用このようなTとしてデルマレー 、 デルマレー ATCC 26921。ネガティブコントロールとして非浸潤葉（NTEPs）から同様に調製したタンパク質溶液を使用しています。 </li><li>通常のプロトコル15に従って電気泳動を行って、例えば色素の先端がゲルの底に達すると停止し、電気泳動で〜50分間、200Vを使用しています。 </li><li> 0.1％を用いたものSDS-PAGEゲルを染色（w / v）のクーマシーブリリアントブルー、メタノール/氷酢酸混合物を用いて脱色。注：ラピッド染色及び脱色を穏やかな染色を加熱し、10分後、脱色液を変え、温め（ただし沸騰）第染色をした後、脱色溶液で15秒〜マイクロ波を用いて、すなわち溶液を脱色することにより行うことができるとき、または冷却し、新たな脱色液を繰り返します。 </li><li>確立されたプロトコル16,17を使用して1 SDS-PAGEゲルのウェスタンブロッティングを行う。 （二）アルカリホスファターゼに結合されたHisタグ（プライマリ）とポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体Fc領域に対するポリクローナルウサギ抗体：以下の抗体を使用してください。注：二次抗体は、ニトロブルーテトラゾールを用いて可視化を可能にするために選択されるべきであるイウムchloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39; - indolyphosphateのp-トルイジン塩（NBT / BCIP）、18に記載されているよう。 </li><li> 1.5％ゲルをインキュベートすることによって0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲル上でリフォールディングゲル内のタンパク質を用いて室温でβ-シクロデキストリン、20mMのリン酸 - クエン酸緩衝液、pH 6.5（w / v）の実行穏やかな15分19振とう。 </li><li> β-シクロデキストリンのソリューションを捨て、簡単に、H 2 Oでゲルを洗うさらに15分間50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中で、室温でインキュベートする。 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.8の中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディング0.15％CMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う</li><li> 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディングし、0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う</li><li> 30分間、またはクリアバンドが1 MのNaを使用して観察されるまで、0.1％w / vコンゴーレッド溶液及び脱染を用いて10分間ゲルを染色CL。明確に画像化のための0.3％（v / v）の酢酸でゲルを洗浄する。 </li></ol> TrCel5Aの6。4-MUC活性アッセイ<ol><li> 50％（v / v）メタノール中の10mM 4-MUCのストック溶液を調製し、RTで暗所に保管して</li><li>アッセイの直前に、1 mMの4-MUCさ60mm酢酸ナトリウム、pH 4.8で構成される4-MUC 2X作業溶液を、準備します。 </li><li> （誘導的に発現の有無TrCel5Aなし）葉タンパク質100μlを、Tから100μlの市販のセルラーゼ混合物を含む試料に、このテストを実行するレセイ 1:1,000、および純粋なH 2 Oであった。三重に各サンプルを実行します。 </li><li>ピペット96ウェルプレートの各ウェルに4-MUC作業溶液100μlを、各試料100μlを加える。 </li><li> 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光の0分の時点を決定します。 </li><li> 20プレートをインキュベート50℃分間、蒸発を防ぐために接着剤の蓋で覆った。凍結（またはμlの0.15 Mグリシン、pHは10.0と、別々のプレートの試料100μlを100とを組み合わせることにより）により反応を停止します。 </li><li> 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光のエンドポイントを決定します。蛍光値の変化を得るために、エンドポイント（20分）の時点から0分を差し引く。 </li></ol> TrCel5Aの7。アゾキシメチルセルロース活性アッセイ<ol><li> 0.5 M、RTで保存する1.5％のストック（w / v）のアゾ-CMC、および18mMの酢酸亜鉛を含有する沈殿溶液を調製酢酸ナトリウム、pH 5〜80％エタノール（v / v）で、室温で保存温度。 </li><li>アッセイの直前に、1％（H 2 O中）（w / v）のアゾ-CMCおよび60mMの酢酸ナトリウム、pH 4.8からなるアゾ-CMC倍ワーキング溶液を調製。 </li><li> 50μlのサンプルと仕事の50μLを組み合わせる1.5ミリリットルのチューブでソリューションをING。 </li><li> （一時的に発現したかTrCel5Aなし）葉タンパク質の50μLを含有する試験サンプル; T.から市販のセルラーゼ混合物100μl デルマレーは 1:1,000に希釈した。そして、純粋なH 2 O三重でサンプルおよび標準を実行します。 </li><li> 50℃で20分間、サンプルをインキュベート沈殿溶液を250μlを添加して反応を停止させます。溶液が完全に混合したことを確認するために10秒間激しくボルテックス各サンプルを。 </li><li>室温で10分間サンプルをインキュベートし、再度ボルテックスする。 10分間1,000×gでの遠心分離のサンプル。ペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェルプレートに各サンプルの上清を200μlを削除します。 </li><li> 590nmの波長で吸光度分光法を用いてアッセイ。 </li></ol> TrCel5Aの8。PAHBAHアッセイ<ol><li>ろ紙円（〜5.5ミリメートル径）をカットして穴パンチを使用してください。 100μlの60 mMののNaAc、pHは4.8、および1を追加サンプル（誘導的に発現の有無TrCel5Aなしで）の葉のタンパク質を含むいずれか、または商業Tの00μL リーゼイのセルラーゼ混合物は、1:1,000に希釈し、300rpmで振盪しながら50℃で20時間濾紙丸でインキュベートする。濾紙とインキュベートし、各試料について、個々のサンプルを対照として濾紙なし重複溶液をインキュベートする。 </li><li> RTで5 100mlの溶液を、合計濃HCl溶液、およびストアを添加してH 2 Oに溶解することによってPAHBAH 330 mMのパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）溶液Aを調製。注：最良の結果は、H 2 Oで100mlとする量を加える前に、溶解を助けるために温度下で撹拌PAHBAHスラリー、 すなわち 30ミリリットル、より小さな体積にHClを添加することによって達成される</li><li> RTでの50 mMクエン酸ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、および500mM NaOHおよびストアを含む、PAHBAH溶液Bを調製する。 </li><li> IMMEDiatelyアッセイの前に、使用するまで（4時間以内に使用する）氷上9ミリリットルの緩衝溶液、ストアに1ミリリットルのPAHBAH試薬の1.5倍の作業溶液を調製する。 </li><li>耐熱性0.2または0.5 mlチューブ内のサンプルを準備します。フィルターペーパー（ステップ8.1）、H 2 Oを45μLとPAHBAH作業溶液100μlとインキュベートし、各溶液5μlを兼ね備えています。サンプルコントロール（フィルターペーパーなしでインキュベートしたサンプル）は、同じ濃度（5μlのサンプル、45μlのH 2 O、100μlのPAHBAH使用液）の下で実行する必要があります。また、0〜0.2gのグルコース/ Lを含有する5規格（5μl）を、純H 2 Oをテストする三重でサンプルおよび標準を実行します。 </li><li>正確に10分間RTで冷却し、次いで、100℃で正確に10分間、サンプルをインキュベートする。波長410nmで96ウェルプレートおよびアッセイ分光ピペットソリューションを提供しています。最終的な取得するためのサンプルから（フィルターペーパーなしでインキュベート）個々のサンプル·コントロールを引く値。 </li></ol>

<ol>
	<li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+for+biomass+degradation:+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms.">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li><li>Klose, H., G&#252;nl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development.">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li><li>Klose, H., R&#246;der, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion.">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li><li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plants+as+bioreactors:+recent+developments+and+emerging+opportunities.">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li><li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco,+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins.">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li><li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A.">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li><li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGIII,+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei:+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme.">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li><li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+fluorescent+proteins:+innovations+and+applications.">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li><li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum.">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li><li>B&#233;guin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas.">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li><li>J&#248;rgensen, H., M&#248;rkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides.">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li><li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates.">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li><li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+(HPV-16)+L1+expression+in+plants:+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization.">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li><li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins.">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#8220;Western+Blotting&#8221;:+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">&#8220;Western Blotting&#8221;: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications.">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots.">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li><li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+&#946;-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate&#8211;polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Effect of &#946;-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate&#8211;polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li><li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+molecular+farming+in+the+future:+transient+protein+expression+in+plants.">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li><li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function:+Insights+from+sequence+analysis,+biophysical+measurements,+and+molecular+simulation.">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica.">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム1のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを?...

<html>リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース1の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁1の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後3を必要な酵素を変更することができる。 &quot;ve_content&gt; ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能4に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間5におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー5、CEL5A、6からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖7を roylzing。 ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から9異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。 TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 - メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（RemazolbrilliantブルーR）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ12などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferyl &amp;beta;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon (concentrated)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - kanamycin</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - rifampicin</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - carbenicillin</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxymethyl cellulose</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase from &lt;em&gt;Trichoderma reesei&lt;/em&gt; ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Congo red</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie brilliant blue G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper - Rotilabo blotting paper</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylsulfate</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Soil, Einheitserde classic&amp;nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy benzhydrazide&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV light source - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。

TrCel5AとTrCel5A-mCherryを、一過性発現系（ 図1Aおよび1B）を用いてタバコ植物において首尾よく発現された。 TrCel5A-mCherry融合タンパク質の発現パターンの検査は、健康な葉の緑色光（ 図1D）の下で広範なタンパク質の発現を示した（ 図1C）を 、明らかにした。 総可溶性タンパク質の抽出を一過TrCel5Aタンパク質を発現させ?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants at JoVE.com

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.8K ビュー.  RWTH Aachen University. タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。 

ビデオ: Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

遺伝学

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

環境学

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

生化学

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

生物工学

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

化学

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

生物学

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

組換えセルラーゼCEL5Aの式から

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

最適化と利用の

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

組換えセルラーゼCEL5Aの式から

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

最適化と利用の

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。