Authors have nothing to disclose.

protokol hayvan deneyleri, gerekçesini ve araştırma hedeflerini gerçekleştirmek için, Güney Kaliforniya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından sunulan ve kabul edildi. de tanımlanan insan özefajektomi örneklerinden birincil kültürlerin kurulması için protokol Güney Kaliforniya Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Fare ya da İnsan özefagus elde <ol><li> Fare özefagus edinin: <ol><li> Servikal dislokasyon ardından% 2 izofluran uçucu doz aşımı ile 8-12 gün eski fare Euthanize. </li><li> Aşağı yukarı bakacak şekilde göbek ile hayvan pin ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi ıslak. Forseps ile yakala ve forseps ile üretral açılış cilt anterior yukarı kaldırın. Çene üretral açılış ventral orta hat boyunca kesmek için standart düz cerrahi makas kullanın. Sadece cildi kesmek için dikkatli olun. &lt;/ Li&gt; <li> &quot;Y&quot; aşağı ters oluşturan, hayvanın her iki tarafta diz aşağı açılış üretral bir kesi yapmak. Göğüs kafesi boyunca hayvanın her iki tarafında bir kesi olun. </li><li> Dikkatle yatan periton ve göğüs kafesinin kapalı, her iki tarafta cilt soyma ve yanlara yatıyordu. Göğüs boşluğu ve karın boşluğunu örten periton örten göğüs kafesini inceleyin. <ol><li> Karın içeriğine zarar görmesini önlemek için yukarı makas işaret, forseps ile periton kaldırın ve diyafram ve göğüs kafesine içinden yukarı kesti. Yavaşça, karaciğer sol lobunu yukarı kaldırın yatan mide, özofagus-mide kavşak ve yemek borusu karın kısmını açığa. </li></ol></li><li> Servikal kuşak kadar orta hat boyunca sternum ve göğüs kafesi üzerinden kesmek için otoklava cerrahi makas kullanın. Nokta makas yukarı göğüs içeriğine zarar görmesini önlemek için. Tam içeriğini açığayanlara göğüs kafesi çekerek göğüs boşluğu. </li><li> Yavaşça kalp ve akciğerlerin her iki lobu kaldırmak. Q-ipuçları aşırı kan emer. Torasik özofagus torakal vertebra trakea ve anterior dar, esnek tüp yalan posterior. NOT: Özofagus kemirgen yenidoğanlarda tespit etmek zor olabilir. Özofagus-mide birleşme lokalizasyonu özofagus kimlik basit hale getirir. </li><li> Dikkatle çevreleyen damar, yağ diseksiyon, mideden yemek borusu takip ve servikal boşluğunda özofagus kökenli kadar tüm yol mezenterinde. Künt uçlu Cerrahi makaslar, bu amaç için en iyi çalışır. </li><li> Aşağıda tarif edilen ileri işlemler için Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde yemek borusu ve yeri tüm uzunluğu rezeke. İsterseniz yönlendirme amaçlı midenin bir kısmını çıkarın. NOT: Küçük doku boyutu nedeniyle, kas gelen muskularis propria ayrılmasımukoza kemirgen yenidoğan yemek borusundaki ulaşılabilir değildir ve tüm özofagus aşağıda açıklanan işlenirken tabi olmasıdır. </li></ol></li><li> İnsan özefagus edinin: <ol><li> HBSS ile özofagus rezeksiyonu örnekleri (genellikle 5 cm veya daha az) yıkayın ve herhangi bir bağlı bağ dokusu, yağ, ya da damarsal çıkarın. </li><li> Numunenin bir kısmını rezeke ve istenirse ileride histolojik inceleme için formalin yerleştirin. </li><li> Keskin diseksiyon ile altta yatan muskularis propria kalan mukoza ayırın. </li><li> Aşağıda açıklanan protokole alt santimetre parçalara mukoza ve konuyu kesin. Not: İnsan özofagus rezeksiyon aşağıda tarif edilen işlemden önce en fazla 6 saat süre ile, PBS içinde saklanabilir. Özefajektomi örneklerinin kaynağı örnek boyutunu belirleyecektir ve laboratuvar bağımlı olacaktır. </li></ol></li></ol> 2. İzolat Kemirgen ve İnsan Özofagus Stromal Hücreleri <ol><li> F özofagus stromal hücreleri izolemekanik ve enzimatik sindirme bir kombinasyonu ile ROM kemirgen ve insan dokusudur. <ol><li> Mekanik HBSS ile makas ve çoklu yıkama ile doku kıyma ile sindirmek. Enzimatik mi, 300 U / kolajenaz XI ve 0.1 mg / 25 dakika (sıçan dokusu) için mi dispaz ile veya en fazla 6 saat (insan dokusu) için doku inkübe edilerek özet. Kıyma haline gelme kullanılan aletler otoklava ve sterilize edilmiş olduğundan emin olun. NOT: Kolajenaz kollajen, birlikte hayvan dokusunu tutan sorumlu bir hücre dışı matriks proteini parçalayan enzimler vardır. Kollajenaz XI yüksek kollajenaz aktivitesine sahiptir ve bu izolasyon protokolü başarı gördü. Dispase hücre membran etkinliğini koruyan ve bir ikinci enzim olarak kolajenaz ile bir arada kullanılan, hafif proteolitik ayrışma etkinliği olan bakteriyel bir enzimdir. </li><li> HBSS içeren, sırasıyla, 1.7 ml mikro-santrifüj ya da 5 ml tüpler içinde, fare veya insan dokusundan elde edilen mukoza fragmanları, yerleştirin. Kıyma yumuşak kağıt olup,İlgili tüpler içine uyacak bir açık uç genişliği ile makas kullanarak 2-3 mm&#39;lik parçalar halinde. Özofagus mukoza parçaları tüpün dibine çöktürmek için yeterli zaman izin ver. </li><li> Yavaş yavaş yanlışlıkla doku atmak için dikkatli olmak, HBSS süzün. Taze HBSS nazik sallayarak aşağıdaki ile değiştirin. Seçenek olarak ise, 1 ml pipet ile HBSS çıkarın. </li><li> Yumuşak özofagus fragmanları, her bir yıkama arasında çöktürmek için süre bıraktıktan yıkamalar arasında çalkalanarak bu şekilde 8 kez olmak üzere toplam doku yıkayın. NOT: İnsan dokusu bu yeni doğan fare doku kıyma daha gerektirecektir. </li></ol></li><li> Mi, 300 U / kolajenaz XI ve oda sıcaklığında yavaş bir hıza ayarlanmış bir sallanan karıştırma cihazı üzerinde, 25 dakika boyunca 0.1 mg / ml dispaz sahip fare doku inkübe edin. <ol><li> Oda sıcaklığında yavaş bir hızda ayarlanan bir sallanan bir karıştırıcı üzerinde, en fazla 6 saat süre ile, 300 U / ml kolajenaz XI ve 0.1 mg / mL dispase insan dokusu inkübe edin. NOT: İnsan özofajit kullanılabilirliğiGus değişkendir. İnsan özofagus mukoza primer kültürlerinde başarılı nesil kadar 6 saat sonuçlar için enzimler ile inkübe. </li></ol></li><li> Enzimatik sindirimden sonra 10 dakika süreyle 200 x g&#39;de makas ve santrifüj ile daha da kıyma dokusudur. </li><li> Süpernatantı atın. Cansız hücreler ile döküntüleri gidermek için% 2 sorbitol ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 5 kez 5 ml&#39;lik bir tüpe, bir karma hücre süspansiyonu oluşan pelet aktarın ve yıkayın. </li><li> % 10 cenin sığır serumu ile DMEM içinde 6 oyuklu plakalar ve kültür (FBS), 10 mg / ml insülin, 10 ug tohum hücre / ml transferin, 10 ug / ml gentamisin ve 2 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) . Vakum filtre (0.22 um) süzülerek sonra ilave edilebilir EGF hariç tüm bileşenler. Rezeksiyon boyutuna bağlı olarak, birden çok 6-yuvalı plakalar içinde insan reseksiyon örneklerinden elde edilen hücreler dağıtın. </li><li> Kuyular% 80 konfluent sonra, T25 için geçiş yapışan hücreler bize şişeleriing% 0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA). 400 x g&#39;de medya ve spin ile nötralize edin. <ol><li> Bir T25 şişesi bir 6 yuvalı geçişi için, bir 1 pasaj hücreleri: 1 oranında. 2 ya da 1: 3 oranında konfluent T25 şişesi 1 ile geçişli olabilir. 1 oranı: T75 şişeye bir T25 şişesi geçit, 1 kullanın. 2-3 günde olursa olsun geminin Değişim medya. </li><li> Yukarıda tarif edilen miyofibroblast ortam içinde, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe ve kültür 37 ° C&#39;de hücreler büyür. NOT: Epitel hücreleri, bu kültür veya geçit koşullarında hayatta yoktur. Karakterizasyonu için ve aşağıda tarif edilen çalışmalarda kullanılan hücreler geçitlerin 5 ile 15 arasında bulunmaktadır. </li><li> Miyofibroblast ortam,% 10 dimetil sülfoksid ekleyerek sıvı N 2 hücreleri Kriyo-koruma. </li></ol></li></ol> 3. karakterize Kemirgen ve İnsan Özofagus Stromal Hücreleri <ol><li> Bir ters mikroskop ile, hücrelerin morfolojisi inceleyin. Mili-şekilli gözlemlemekYapışık hücrelerin morfolojisi (Şekil 1). </li><li> Α-SMA, vimentin, desmin ve sitokeratin: Aşağıdaki hücre iskeleti belirteçlerin değerlendirilmesi ile kültür hücreleri karakterize etmektedir. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler α-SMA ve vimentin (Şekil 2) sitosköletal miyofibroblast belirteçler. <ol><li> Daha fazla desmin için immunostain kas hücreleri, kültürlü stromal hücreler ayırt etmek. Kültürlenmiş hücreler imüno gerçekleştirmek için, 4-çukurlu oda slaytlar 1.5 x 10 4 hücrelerini plaka ve 24 saat süre ile miyofibroblast ortamında büyür. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler zayıf ya da hiç desmin ifadeye sahip olacak. Stromal hücreler epitel işaretleyici pan-sitokeratin ifadesini eksikliği (veriler gösterilmemiştir). NOT: kültürlerin Değerlendirme akış sitometri immünsitokimya ve hücre yüzey belirteçleri ile hücre iskeleti belirteçlerin değerlendirilmesini içerir. İmmünositokimya ex olarak karakterizasyonu birincil yöntem olarak kullanılmaktadırhücre iskeleti proteinleri sıkıştırma profili fibroblast, miyofibroblastm veya kas hücre için benzersizdir. Akış sitometrisi, epitel, endotelyal ve hematopoietik hücreler belirteçlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu değerlendirmek kültür saflığı kurar. CD90 insan fibroblast ve miyofibroblastlar hem de ifade insan stromal hücreler belirleme yardımcı bir yöntem olarak yararlıdır. Aynı zamanda fare T hücreleri tarafından ifade edilen CD90 kemirgen stromal hücrelerin karakterizasyonu yararlı değildir. </li></ol></li><li> Hücreler% 60 kaynaşmaya eriştikten sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile slaytlar yıkayın ve metanol ile sabitleyin. -20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca metanol içinde hücreleri inkübe edilmiş, sonra kullanılana kadar 4 ° C de PBS içinde depolar. </li><li> Standart immünoboyama protokolünü izleyin. </li><li> Kısaca, birincil antikor tatbik edilmesinden önce, PBS içinde% 5 goatserum ile sabitleştirilmiş hücreler bloke eder. Yanı% 5 keçi serumu içinde birincil ve ikincil antikorlar ile seyreltilir. <ol><li> Α-SMA ve vimentin tespiti için kullanımıAşağıdaki antikorlar ve konsantrasyonları: Fare mAK α-SMA 1 de: 500 seyreltme: 1 de vimentin 250 seyreltme ve Tavşan PAB. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında primer antikor ile inkübe 3 defa PBS ile yıkayın ve 1 arasında bir seyreltme Rodamin konjuge keçi anti-fare sekonder antikor ekleyin: 1 saat süre ile 1000: 1 arasında bir seyreltme 200 ve Cy2&#39;nin konjuge keçi anti-tavşan oda sıcaklığında karıştırılmıştır. </li><li> Counterstain çekirdekler 4 ile &#39;, 1 dakika boyunca 1 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) ve daha sonra, PBS ile yıkayın. Bir ters mikroskop ile slaytlar analiz. </li></ol></li><li> Hematopoietik için, sıçan ve insan yemek borusu hücre elde edilmesi (CD45) ve akış sitometrisi ile endotelyal (CD31) hücre yüzey markörlerinin (Şekil 3) kültürler saflığını oluşturulması. Stromal hücre yüzey işaretleyici CD90 ekspresyonu ile ayrıca insan hücreleri karakterize eder. Not: CD90 fare T cel murin stromal hücreleri tanımlamak için kullanılamazls da CD90 ifade eder. <ol><li> , Iki kez FACS tamponu ile yıkandı, sayıldı ve ilgili izotop kontrol FITC-CD45 ve APC-CD31 ile lekelenmiştir, 10 dakika için 37 ° C &#39;de enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ile muamele etmek suretiyle, kültür şişelerinden kültürlenmiş fare özofagus stromal hücreleri ayırmak göre Standart boyama işlemlerine. </li><li> FACS Calibur kullanarak hücreleri toplamak ve FlowJo yazılımı ile verileri analiz. Lekeleme yapan hücrelerin önce, antikorları en iyi duruma getirmek ve izotip kontrolleri, normal fare dalak ve kemik iliği hücreleri kullanılarak konsantrasyonlarda titre edilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

Bu çalışma Gut Fizyoloji ve Sağlık (AS) ve Wright Vakfı Pilot Ödülü (AS) NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), Sağlık AGA-General Mills Bell Enstitüsü ve Beslenme Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir.

doku boyutu için uyarlanmış kıyma ve sindirim kez sıçangil ya da insan doku kullanıldığında, birincil kültür oluşturulması için teknikler genellikle benzerdir. Sıçangil doku ile olan deneyim, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak sürekli olarak primer kültürlerinde başarılı bir şekilde kurulmasının neden olduğunu göstermektedir. Protokol kapsamında Kritik adımlar cerrahi ekipman sterilizasyon ve doku kültürü standart steril teknikler şunlardır. farelerin yaş da önemli bir ad?...

Epitel-stromal etkileşimleri mukozal rejenerasyon, onarım, fibrozis, ve karsinogenezinde 1,2 olmak üzere gastrointestinal sistem fonksiyonları çeşitli düzenlenmesinde rol oynar. Bu etkileşimler en küçük bağırsak ve kolon incelenmiş ve benzer özofagus mukoza bozuklukları 3 rol oynayabilir. Bağırsak ve kolon stromal hücreler olarak adlandırılan rolü in bir alt popülasyonu, doku yaralanması, iltihaplanma aracı katılmak ve 4,5 onarmak için gösterilmiştir. Distal GI, bu iğ biçimli hücreler epiteli ve lamina propria arasındaki arayüzde bazal membran bitişik bulunan ve α-SMA ve vimentin olarak tanımlanan olumlu,-pan sitokeratin negatif ve zayıf pozitif veya negatif desmin 5. özofagus stroma sıkı bir hücresel ya da moleküler düzeyde olmamıştır. Kemirgen özofagusta Çalışmalarımız de ettimonstrated α-SMA yassı epitel 6 bazen alttaki özofagus stromada ve vimentin hücreleri. Epitel-stromal etkileşimler gibi gastro-özofageal aracılı yaralanma 6 ve eozinofilik özofajit 3 gibi özofagus mukoza bozuklukları suçlanmıştır. Fibrotik darlıklar gastrointestinal fibrozis patogenezinde suçlanmıştır özofagus yaralanması ve stromal hücrelerin bilinen bir komplikasyonudur. Bu hücrelerin izolasyonu dengesiz sinyal yolları araştırmak için gerekli çalışmaları gerçekleştirmek yardımcı olacaktır. Bu başvuru, bu etkileşimlerin aracılık sinyal yollar ile ilgili bilgi mevcut boşluklar ele alınabilir şekilde α-SMA pozitif, vimentin pozitif miyofibroblastlar birincil kültürleri kurmak için gerekli teknikleri sağlar. açıklanan teknik başarıyla birincil kemirgen kolon miyofibroblastlar 7 ve furthe kurmak için yazarlar tarafından kullanılmıştırr murin 6 ve insan miyofibroblast gibi özofagus stromal hücrelerin kurulması için uyarlanmış. Bu yazıda kurmak ve fare veya gelecekteki fonksiyonel çalışmalarda kullanmak için önce insan özofagus kurulan bu kültürleri karakterize için gerekli koşulları açıklar. Kültürler büyütülür ve yukarı 15 geçişleri için kullanılabilir. Aşağıda gösterilen yöntemler aracılığıyla izole edilmesi ve primer kültürlerin kurulması miyofibroblast fenotip ile stromal hücreler oluşturur; , vimentin pozitif ve zayıf pozitif veya negatif desmin ve sitokeratin negatif-SMA α. Bu fenotip, ağırlıklı olarak vimentin pozitif olan özofagus fibroblast fenotipi, negatif α-SMA 3 veya müsküler mukozanın 6 α-SMA pozitif, vimentin negatif fenotipi ayrıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:549px;">Name</td>
			<td style="width:549px;"></td>
			<td style="width:549px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dispase&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen</td>
			<td>&#160;17105-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9407&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma)</td>
			<td>F42442</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transferrin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-652-202-001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents for immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse mAB to &#945;-SMA&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7817</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit pAB to vimentin&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab45939</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy2 conjugated Goat anti Rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-225-144</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI&#160;</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD31 conjugated to eFluor 450&#160;</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>48-0319-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD90 conjugated to APC&#160;</td>
			<td>ebiosciences&#160;</td>
			<td>17-0909-41&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V and 7AAD&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>559763</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Fc block for CD16/CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>2136662</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml tube&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-well chamber slides&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus Vacuum-Driven Filter System&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-227</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T25 Flasks&#160;</td>
			<td>TRP&#160;</td>
			<td>90026</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Tipped Q-Tips&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>540500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph software (Molecular Devices)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSCAlibur&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSVerse</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

Mürin ve insan özofagus miyofibroblastlar enzimatik sindirme ile oluşturulur. Yenidoğan (8-12 günlük) sıçangil yemek borusu, hasat kıyılmış, yıkandı ve 25 dakika boyunca kolajenaz ve dispaz ile enzimatik sindirme tabi tutulur. İnsan özofagus rezeksiyonu örnekleri muskularis propria ve adventisyanın elimden ve kalan mukoza kıyılmış edilir ve en fazla 6 saat kollajenaz ve dispase ile enzimatik sindirim tabi. Kültürlü hücreler α-SMA ve vimentinin ve ekspres desmin zayıf veya hiç ifade eder. Kültür şartları, epitel, hematopoietik, veya endotel hücrelerinin büyümesi için elverişli değildir. Kültür saflığı daha fazla potansiyel tehlike hematopoietik ve endotel hücrelerinin hücre yüzeyi işaretleyicisi ifade akış sitometrik değerlendirilmesi ile doğrulanır. Kullanılan teknik, basit ve non-hematopoetik olmayan endotel stromal hücrelerin sürekli üretimi ile sonuçlanır. Bu tekniğin Sınırlamalar kullanımına doğasında vardıryani moleküler biyoloji çalışmalarında, birincil kültürleri, kaçınılmaz değişkenliği farklı fareler ve insanlarda arasında kurulan kültürler arasında karşılaştı. Birincil kültürler, ancak hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında in vivo olarak durumunun daha iyi temsil yansımasıdır. Bu yöntemler ayrıca, araştırmacılar, gruplar arasındaki karşılaştırmalar sağlayan izole yeteneği, farklı klinik ve deneysel koşullardan elde edilen kültür stromal hücreler, sağlar. Özelliği özofagus stromal hücreleri, özofagus hastalıklarda epitelyal, stromal etkileşimlerinin araştırılması fonksiyonel çalışmalarda da kullanılabilir.

Mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak izole özofagus stromal hücreler ilk olarak kaplama ve 6 yuvalı plakalar içinde kültürlendi. Kaplama birkaç saat içinde, bir inverted mikroskop ile hücrelerin incelenmesi plaka tabanı (Şekil 1A) gevşek bir biçimde, bir karma hücre süspansiyonu gösterir. Bir sonraki 24 saat içinde, plaka alt kısmında sıkıca yapışık iğ şeklinde hücreler karma hücre süspansiyonu çimlenme hücreler, 5 gün içinde tüm alanını kaplar ve şekil tutma ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus at JoVE.com

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Video: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biyoloji

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...