We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1. Hücre Kültürü Not: USDA Agricultural Research Service (ft. Pierce, FL ABD) Dr Wayne Hunter laboratuvar tarafından Homalodisca vitripennis hücre çizgileri, ilk ve fibroblast hücre mono tabakaları içeren karışık aşamadan oluşan bir laboratuar stok başlatmak için kullanılmıştır. <ol><li> 25 cm2, kültür şişelerinden ile 20-24 ° C&#39;lik bir sıcaklık aralığında muhafaza steril bir laboratuar ortamında, aşağıdaki işlemleri gerçekleştirmek. </li><li> Yetiştirmek ve H2G + yaprak piresi ortamı, bir tadil edilmiş WH2 bal ortam 10 (Tablo 1) ile 25 cm2 doku kültürü şişeleri içinde kültürleri korumak. </li><li> 53 nem oranı% ~ 24 ° C &#39;de kültür şişeleri inkübe edin. </li><li> , Herhangi bir anormal hücre büyümesi kontrol, örneğin kültür büyümesini izlemek, herhangi bir potansiyel kirletici için monitör ve kültürleriyle arasında büyüme ilerlemeyi kontrol etmek için toplam büyütme 100X (TM) bir ters mikroskop kullanınTure yüzey. </li><li> Kültür yüzeyini bozmadan 10 gün - her 7 tam orta değişikliği (şişesi ortalama ~ 4 ml kültür ortamı) gerçekleştirin. </li><li> Kültür yüzey hücreleri ayırmak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden,% 0.25 tripsin kullanılarak hücre büyümesi (konfluent) kapsamındaki yaklaşık% 80 olduğu zaman kültür geçirin. Her kültür şişesine tripsin 3 ml ve kısa bir süre için enzime kültür (ler) maruz - ~ 2 Ekle - tam hücre ayrışmasını sağlamak için (5 10 dk). </li><li> Enzim aktivitesini durdurmak için santrifüj ve konik tüp bütün çözüm aktarmak için - kültür şişesine (lar) (3 mi ~ 2) taze ortamın eşit miktarda ekleyin. </li><li> 350 x g hızında 6 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Hücre topaklarını bozmadan Süpernatantı ve her bir tüpe ~ taze ortam 8 ml ekleyin. Yavaşça bir pipet kullanarak hücreleri homojenize. </li><li> 1 Split kültürler: 2 oranı için 25 cm 2 şişeler (~ hücre soluti 4 mlkap başına üzerinde) ve ayrılmak taze kültür geçirilen süspansiyon halindeki hücreler şişenin yüzeyine sağlam bir şekilde tutunmasını sağlayacak, 48 saat boyunca rahatsız. Not: 1 cm2 &#39;lik bir büyüme yüzeyi ile 48-çukurlu steril doku kültürü plakaları içindeki hücrelerin yetiştirilmesi mümkündür ve ~ 250 ul kültür ortamı hacimde bir azalma ile birlikte kültür şişelerinde aynı şekilde elde edilebilir. </li></ol> 2. Tüm virüs Ekstraksiyon <ol><li> Virüs pozitif H. tüm organları homojenize ~ 10 saniye aralıklarla girdap% 0.02 sodyum dietilditiyokarbamat trihidrat (DETCA) ile fosfat tamponu içinde vitripennis, pH-7.2, mevcut bir dokusunun daha büyük topaklar kalmayana kadar. 4 ° C de 4 saat ya da 4 ° C &#39;de 16 saat süre ile 22.000 x g boyunca 124.500 x g&#39;de santrifüj ile SuperSpeed ​​virüs ekstrakte edin. Üstünde bir çökelti ortaya çıkarsa, steril pamuklu çubuk 11 ile çıkarın. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> Pelet toplayın ve% 0.4 Na-deoksikolik asit ve% 4 polietilen glikol heksadesil eter (Brij 52) ihtiva eden, 5 mi 10 mM fosfat tampon maddesi (yok DETCA), pH değeri, 7.2 ile çözülür. <ol><li> De pelet karıştırmak için, tüpün yanından pelet kaldırmak ve gerekirse çözelti içinde kadar ezmek. </li><li> Topak gerekirse çözelti haline ve 2 tüpler 11 birleştirmek yardımcı olmak için ~ 5 mi artışlarla daha 10 mM fosfat tamponu ilave edin. </li></ol></li><li> 15 dakika için 11 300 x g&#39;de çözümü santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve bir 0.45 um filtre içinden çözeltisinin, ve büyük bir toplama tüpü 11 Süzüntüyü toplamak. </li><li> Bir moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz zarı transfer süzülen madde 10 mM&#39;lik 11 gerekirse herhangi bir DETCA ihtiva eden fosfat tamponu (pH 7), küçük miktarları kullanılarak, 3.5 kD (MWCO) kesilir. </li><li> 4 ° C&#39;de GKD 2 O dolu olan büyük bir beher içinde diyaliz membranı yerleştirin. GKD 2 O her saat f değiştirinveya 5-6 saat sonra, zar 11, beyaz bir çökelti oluşana kadar. </li><li> Zarı içinde saflaştırılmış virüsü toplamak ve GKD 2 O 90 ul solüsyon 10 ul ekleyerek 10-kat seyreltme serisi için% 100 virüs çözeltinin çok 100.000: Daha sonra 1 bir seyreltme ulaşana kadar GKD 2 O başka bir 90 ul seyreltme 10 ul ekleyin. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın virüs çözümü. </li></ol> 3. Viral kopyalama <ol><li> Hücre büyümesi (hücreler ortalama bir oranda artmaktadır, yaklaşık olarak 72 saat post-geçiş)% 80 birleşmeye kadar 48 oyuklu kültür plakaları içinde tohum hücreleri ve tüm satırları büyür. </li><li> Hücre büyümesi konfluansa ulaştığında, seri halinde seyreltilmiş virüs, hücrelerin her satır inoküle, yani, 1:10 seyreltme, bir satır, bir 1 bir sıra: en üst sırasının dışında 100 seyreltme, vb. Bir kontrol olarak üst satırı kullanın ve ses kontrolü olarak her kuyuya GKD 2 O 10 ul ekleyin. <ol><li> Önce virüs kültürlerde herhangi bir kuyu İlk aşıdan her satırın ilk kuyu, deneysel hücre sayımları ile karşılaştırma için bir başlangıç ​​bazal hücre konsantrasyonunu kurmak ayırmak ve saymak için. </li></ol></li><li> Kültür plakaları, pH değişikliği gösteren bir ortam içinde herhangi bir renk değişikliği ve hücre morfolojisinde herhangi bir değişiklik için virüs aşılanmasından sonra her 24 saat izleyin. </li><li> 100X TM bir ters mikroskop kullanılarak her bir zaman noktasında test plakası, görüntü bir sütun. </li><li> Her bir 24 saatlik zaman noktasında görüntülenmiştir kolondan tüm Ortamı çıkarın ve -80 ° C de, viral RNA çıkartması ve miktar tayini ya da uzun bir dönem için -20 ° C &#39;de kısa süreli saklayın. </li><li> Hücre Pelle yeniden suspande edilmesi için enzim aktivitesi ve taze ortam ~ 250 ul durdurma% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.9 - 1.6 aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi orta çıkardıktan sonra kuyulardan hücreleri ayırmakt. </li><li> Bir hafta boyunca her 24 saatlik bir süre boyunca hücre ayrılma sonra hücre sayıları gerçekleştirmek için hücreleri ihtiva eden her tüpe% 0.4 tripan mavi boyası, 10 ul ekle. Leke hücre sayımları yapmadan önce 10 dakika dinlendirin. <ol><li> Leke hem de cansız hücreler alımı başlar leke maruz bırakılarak ya da yaşayan hücrelerin, 1 saat içinde hücre sayar. </li></ol></li><li> Yavaş yavaş bir mikropipet kullanılarak standart bir hemasitometre her iki tarafına da lekeli hücre çözeltisinin 10 ul ekle. Veren çözelti, hava kabarcıklarını önlemek için kılcal hareketi ile yukarı alınır. </li><li> Hemasitometre her iki tarafına uygulanabilir (non-lekeli) hücrelerin sayısını (hemositometrede 16 kareler 4 sayımları eşdeğer) sayılır. Çıkarıldı kolonun her bir oyuk için hücre sayar. </li><li> Her kolondan hücre sayıları ortalama ve toplam hücre sayısı numarasını edinmek için aşağıdaki formülü kullanın: x seyreltme faktörü (hücre / 4 ortalama sayısı) = hücrelerin x 10 sayısını <sup&gt; 4 mi. Bu, kültürdeki hücre yoğunluğu ya da yaşayan hücrelerin sayısıdır. </li></ol> Hücre Kültürü 4. Virüs Ekstraksiyon <ol><li> Tedavi H. Kaldır Enzim aktivitesini durdurmak için% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.8 - Kültür şişelerinden alınan hücreler, vitripennis aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi 1.6. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> 2.8 - 2.3 &#39;te, daha önce adımda tanımlanan protokol ile kültür hücrelerinden ekstrakte virüs. </li></ol> 5. RNA Ekstraksiyon <ol><li> Üreticinin protokolüne göre, sıvı örnekleri için tasarlanmış bir guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak, her bir haftalık deneme sırasında toplanan virüs ortamı örnekleri RNA çıkarmak. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın numuneleri ekstre edilmiştir. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Kullanarak geleneksel PCR çalıştırarak RT-PCR için viral standartlar oluşturulmasıprimer çifti HoCV RT-PCR primeri 1 (ileri 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;-ACGACGGATCTGCGTGCCAA 5&#39;-3, ters&#39;) virüsü ile tüm vücut H. izole vitripennis. </li><li> Konu PCR ürünü,% 0.1 etidyum bromid içeren bir% 2 agaroz jeli içinde, 120 V, 60 dakika boyunca jel elektroforezi için. </li><li> Jelden bantları pulu ve imalatçının protokolüne göre, bir jel ekstre etme kiti kullanılarak saflaştırılması. </li><li> Havuz tüm kesilmiş ve jel ile saflaştırılmıştır ve ürün ayrıca temel etanol presipitasyonu ile saflaştırılması. Genel örnek konsantrasyonunu arttırmak Tris EDTA (TE) içinde yaklaşık 30 ul çökeltme ürünü elute edin. </li><li> Nükleik asit saptama için 260/230 dalga boyu ayarlarını kullanarak spektrofotometre ile toplanmış örneklerin cDNA seviyesini ölçmek. </li><li> 57 ng arasında değişen saflaştırılmış örnekteki bir on-kat daha seri seyreltme serileri sonuçları / 57 ug / ul (10 -18) ul. Benzer seri seyreltme i Me tarif edilen gerçekleştirmen konsantrasyon gereksinimleri farkı için yapılan ayarlamalar 2.8. </li><li> Düşük yoğunluklu transkriptlerin güvenilir bir ölçümü QRT-PCR kiti kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirilerek seyreltme serisinin tespiti sınırlarını belirler. NOT: 5 x 10 -3 kopya daha Viral konsantrasyonları daha düşük tespit değildir. </li><li> Adım 5.1 &#39;de daha önce tarif edildiği gibi deneysel numunelerin RNA ekstrakte ve spektrofotometrisi kullanılarak miktarı belirlenir. </li><li> Nükleaz ücretsiz su kullanarak ul / 5 ng tüm ayıklanır örnekleri normalleştirmek. </li><li> Aşağıdaki gibi 25 ul reaksiyonu, düşük kopya sayısını algılamak için yeteneğine sahip tek aşamalı bir QRT-PCR kiti kullanılarak olarak, iki kopya halinde, tüm numunelerde QRT-PCR uygulaması: 50 ° C&#39;de 10 dakika boyunca tutun; 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de tutma; 10 saniye, 30 saniye için 60 ° C 95 ° C 30 döngü; Her adımda 5 saniye 99 ° C - 50 eritebilir. <ol><li> Her bir reaksiyon karışımı, 1 x ustalar 12.5 ul içerir, böylece ana karışımı yapmakR karışımı, ileri primerin 1.0 ul (0.3 uM), ters primer, 1.0 ul (0.3 uM), ters transkriptaz ve standardizasyon değerlerine göre şablon değişken miktarlarda 0.25 ul. </li><li> RNazsız su ile 25 ul toplam reaksiyon hacmi. </li><li> Her bir PCR&#39;nin beş standart konsantrasyonlar, aşağıdaki kopya numaralarıyla birlikte çalışmasını da kapsaması: 5 x 10 -10, 5 cm x 10 -8, 5 x 5 x 10 -4 -6 10, ve 5 x 10 -2 kopyalar. Her çalışma başında erken alımı sırasında gürültüyü azaltmak için, sadece 10x -2.5 bir floresan altına her çalıştırmak için eşik ayarlayın. </li></ol></li></ol> 7. Konfokal Mikroskopi <ol><li> Her iyi çapı 18 mm boyutlarındaki on iki iyi plaka içeren cam lamelleri içinde Homalodisca vitripennis hücreleri büyümek. </li><li> Bir tek-tabakalı elde edildiği zaman, dört günlük bir süre boyunca levha üzerinde her 24 saatte bir sütun inoküle. Her c emin olunolumn iyi bir denetimi içeren, düşük viral seyreltme (1:10) iyi ve yüksek viral seyreltme (1: 100,000) iyi. Adım 2.8 elde virüs çözümleri kullanın. </li><li> Beşinci gününde tüm ortamları çıkarın ve iki kez 1x PBS (pH 7.4) ile hücreleri yıkayın. </li><li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de soğuk% 4 paraformaldehit ile hücreleri saptamak. </li><li> 1x Fosfat 500 ul hücrelere serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden önce ilave edin ve düşük hızda bir sallama düzeneği üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Bunları permeabilize hücrelerin% 0.1 Triton X-100 500 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. </li><li> Hücreler tekrar yıkama, daha önce tarif edildiği aşama 7.5. </li><li> Oda sıcaklığında hücrelere engellemek için,% 5 sığır serumu albümini (BSA) çözeltisi 500 ul ilave edin. 2 saat boyunca oturup sonra çıkaralım. </li><li> 1x PBS% 5 BSA içeren 250 ve F-aktin leke iyi her seyreltme 250 ul ekleyin: stok Rodamin kırmızı-konjuge Phalloidin (BİP) 1 seyreltin. </li><li> Alüminyum f Kapak plakasıYağ ağartmadan boya önlenmesi ve 4 ° de CO / N inkübe hücreleri. </li><li> 12 saat inkübasyondan sonra, RCP çıkarın ve hücrelerin çekirdekleri leke,% 5 BSA içeren PBS içinde 1x seyreltilmiş 6-diamidino-2-fenilindol 4 250 ul &#39;(DAPI) (250 ug / ml) ile değiştirin . </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında DAPI içeren hücreleri inkübe edin. </li><li> Aşamasında önceden tarif edildiği gibi 7,5 1x PBS hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Yavaşça kuyulardan lamelleri çıkarın ve bir anti-solmaya reaktif ile bir montaj medyayı kullanarak slaytlar mikroskop monte. </li><li> Konfokal mikroskop altında inceledi kadar slaytlar kutulara lightproof kurumasını bekleyin. Boyalar hızla solmaya gibi gör kısa sürede hazırlanan slaytlar. </li><li> 63X (yağ) Plan-apochromate lens içeren bir mikroskop ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanılarak görüntü lekeli hücreler. <ol><li> 543 ± 10 nm uyarma ve Rhoadmine kırmızı-conjucated Phalloidin için 575 ± 10 nm emisyona lazer dalga boylarını ayarlamaDAPI&#39;nin için, ve 369 ± 10 nm uyarma ve 450 ± 30 nm emisyon. </li><li> Tüm görüntüler elde etmek için dedektör için aynı kazanç ve off-set ayarlarını kullanın. </li><li> Görüntü işleme için uygun bir yazılım kullanarak bir görüntü yönetme yazılımı içine sıralama ve ithalat istenen görüntüleri Süreci görüntüler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+(Hemiptera:+Cicadellidae:+Cicadellinae).">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li><li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1,+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter,+Homalodisca+coagulata.">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li><li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1,+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+(Hemiptera:+Cicadellidae).">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li><li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+(HoCV-1).">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li><li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+(Homoptera)+Cicadellidae)+Reared+on+Cowpea.">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li><li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease.">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li><li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage,+Homalodisca+coagulata,+reared+on+single+host+species.">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li><li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers.">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li><li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter,+Homalodisca+coagulata+(Hemiptera:+Cicadellidae).">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li><li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+(Apis+mellifera:+Hymenoptera:+Apidae).">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li><li>Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+whole+extraction+of+Homalodisca+coagulata-virus01.+(HoCV-01)+from+Texas+glassy-winged+sharpshooter+populations.">Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations.</a> , 9-12 (2009).</li><li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economics+of+baculovirus+&#8211;+insect+cell+production.">Economics of baculovirus &#8211; insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li><li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells.">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis.">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li><li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity.">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li><li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture.">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li><li>Coriell, L. L., Fogh, J. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+prevention+of+bacterial,+fungal,+and+other+contaminations.">Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations.</a> Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).</li><li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing.">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li><li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology&#8217;s+new+dimension.">Biology&#8217;s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Istilacı tarımsal türlerin akını ilişkin artan endişeler gelişmekte olan zararlılara ve patojenlere karşı savunmak için yeni metodolojiler için artan bir talep yol var. Hastalık önleme ve yönetim odağı patojen vektörler yönetimini içerir ve bu çalışmanın birincil hedefi oldu. Ekonomi pratik uygulama büyük alanlar üzerinde ancak düşük bir maliyetle 12 de büyük miktarlarda olması gerekiyor, çünkü tarımda karantinası yönetmek için biyolojik zararlı öldürücünün bu t?...

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis Germar 1821), Kuzey Amerika&#39;da 1, Xylella fastidiosa (X fastidiosa) baskın bir vektör olarak asma (PD) Pierce hastalığının nedensel ajanı tespit edilmiştir. Böcek nüfus yönetim hızla Kaliforniya ve güney Amerika Birleşik Devletleri genelinde bağcılık sektöründe bu yıkıcı sorunla mücadele için araştırma odağı haline gelmiştir. Familyasına ait olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA virüsü Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virüs 01 (HoCV-01), vahşi H. saptanmıştır vitripennis popülasyonları ve böcek için böceğin direncini düşürürken, bu toplumlarda 2-4 ölümleri arttırdığı gösterilmiştir. Yöntemlerin geliştirilmesi etkili arka H. enfekte etmek Bir laboratuar ortamında yetişkinliğe vitripennis çünkü zor olmuştur <em&gt; H. vitripennis ana bitkilerin 5-8 çeşitli gerektiren farklı sahne özgü beslenme ihtiyaçları var. Belirli tesisleri arka canlı H. gerekmektedir Amerika Birleşik Devletleri vitripennis; Bu nedenle hücre kültürü daha ekonomik ve etkili bir alternatif, hem de HoCV-01 tespiti ve çoğaltılması 2,9 giderek önem taşımaktadır. H. hücre kültürlerinin kurulması için temel yöntem ise vitripennis, virüsler 2 gibi, bu yöntemler, yine biyolojik kontrol maddelerinin ticari üretimi için normal olarak kullanılmamış olan, tarif edilmektedir. Aşağıdaki prosedürler genel amacı, biyolojik kontrol maddesi olarak kullanım için müsait HoCV-01 gibi yüksek bir konsantrasyonunun üretmektir. Viral replikasyon neden başarılı H. yetiştirilmesi ve optimize bir canlı hücre gerektirir vitripennis kültürler virüs karlı seviyelerini üretme ilerleme için hayati önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>Corning cell culture flasks</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Surface area 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, canted neck, cap (plug seal)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Inverted microscope and camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA &amp;bull; 4Na per liter of Hanks&amp;prime; Balanced Salt Solution with phenol red</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR multiwell culture plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 wells (TC treated with lid)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filter system</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &amp;mu;m, membrane area 54.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, filter capacity 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td></tr><tr><td>Phosphate buffer solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>For electrophoresis</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, for molecular biology, powder</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Phosphate buffered saline</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine red-conjugated phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect medium (supplemented, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salts (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>MEM, amino acid mix (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>1 M MgCl solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ glutamine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr></tbody></table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis) güneybatı Amerika Birleşik Devletleri boyunca bulunan bir çok vagile ve polifag böcek türüdür. Bu böcekler Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) baskın vektörleri, asmanın Pierce hastalığı (PH) nedensel ajan bir ksilem sınırlı bakteri vardır. Pierce&#39;ın hastalığı ekonomik zarar olduğunu; Bu şekilde, H vitripennis patojen yönetimi stratejileri için bir hedef haline gelmiştir. Homalodisca coagulata virüs-01 (HoCV-01) olarak tanımlanan bir dicistrovirus H. mortalite artışı ile ilişkili olduğu vitripennis popülasyonları. Bir konakçı hücre HoCV-01 replikasyonu için gerekli olduğundan, hücre kültürü lojistik ve biyolojik böcek öldürücü soyu üretimi için ekonomik açıdan önemli olan çoğaltma hedef için tek tip bir ortam sağlar. Bu çalışmada, H. büyük ölçekli üretimi için bir sistemde Doku kültürü ile vitripennis hücreleri geliştirildi, sViral replikasyon mekanizması roviding. HoCV-01 tüm vücut böceklerden çıkarılabilir ve kültür H&#39;yi inoküle etmek için kullanıldı çeşitli seviyelerde vitripennis hücreleri. Kültür ortamı 168 saat, RNA ekstre edilmiş ve QRT-PCR ile analiz için her 24 saatte uzaklaştırılmıştır. Hücreler, tripan mavisi ile boyandı ve ışık mikroskopisi kullanılarak hücre hayatta kalma ölçmek için sayıldı. Tüm virüs parçacıkların toplam hücre kültürü çöküşü oluşmadan önce olduğu tespit edilen bir zaman noktasında olduğu enfeksiyondan sonra 96 ​​saat, kadar ekstre edilmiştir. Hücreler aynı zamanda floresan boyama tabi ve F-aktin bağlanma ve çekirdekler bütünlüğü viral aktivitesini araştırmak için konfokal mikroskopi kullanılarak incelendi. Bu çalışmanın sonuç olduğunu H. vitripennis hücreleri kültive edilip, bir biyolojik zararlı öldürücünün üretimine olanak sağlamak üzere müsait bir seviyede HoCV-01 kitle üretimi için kullanılan olma yeteneğine sahiptirler.

Hücre bağlanma ve büyüme primer kültürlerinde ve sürekli geçişlerinden, hem küçük hem de büyük bir kültür şişelerinde geçidinin 48 saat içinde görülmüştür. Fibroblast büyüme ve gelişme de bu süre içinde gözlenmiştir. Yeni seribaşı şişeler 48 saat önce rahatsız edildiğinde, orada, hücre eki görülür bir düşüş oldu, bazen yavaş büyüyen kültürlerde ve tüm hiçbir ek veya büyüme lider. Hücreler geçen bir hafta içinde, yaklaşık% 80 birleşmeye ve 10-14 gün (...

Watch this Scientific Journal Video about Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture at JoVE.com

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.7K Görüntüleme.  University of Texas at Tyler.  Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir. 

Video: Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Biyoloji

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is predominantly transmitted by blood transfusions, inadequate sanitary conditions and contaminated food products. To date the off-label drug ribavirin (RBV) is the treatment of choice for many patients. Nonetheless, a specific HEV treatment remains to be identified. So far, the knowledge about the HEV life cycle and pathogenesis has been severely hampered because of the lack of an efficient HEV cell culture system. A robust cell culture system is essential for the study of the viral life cycle which also includes the viral pathogenesis. With the method described here one can produce viral titers of up to 3 x 106 focus forming unit/mL (FFU/mL) of non-enveloped HEV and up to 5 x 104 FFU/mL of enveloped HEV. Using these particles, it is possible to infect a variety of cells of diverse origins including primary cells and human, as well as animal cell lines. The production of infectious HEV particles from plasmids poses an infinite source, which makes this protocol exceedingly efficient.

Described here is an effective method on how to produce high viral titer stocks of hepatitis E virus (HEV) to efficiently infect hepatoma cells. With the presented method, both non-enveloped, as well as enveloped viral particles can be harvested and used for inoculating various cell lines.

Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Cellular Impedance-Based Survival Kinetics Assay to Assess Virus Survival

Source: Labadie, T. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61133">Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes a cellular impedance-based technique to study the survival kinetics of viruses that induce cytopathic effects. The method measures the electrical impedance of virus-infected adherent cells pre-treated with saline.

Virüs Sağkalımını Değerlendirmek için Hücresel Empedans Tabanlı Sağkalım Kinetik Testi

Source: Labadie, T. et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021).
This video describes ...

Yayılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler