We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1細胞培養注：米国農務省農業研究サービス（フォートピアス、フロリダ州、米国）での博士ウェイン·ハンター研究所によって確立Homalodisca vitripennisた細胞株は、初期線維芽細胞及び単層を含む混合細胞の段階で構成されるラボ株式を開始するために使用された。 <ol><li> 25cm 2の培養フラスコを20〜24℃の温度範囲に維持され、無菌の実験室環境では、次の手順を実行します。 </li><li>育成とH2G +ヨコバイ媒体、修正されたWH2ミツバチメディア10（ 表1）を使用して25cm 2の組織培養フラスコに培地を維持する。 </li><li> 〜53％の湿度で24℃で培養フラスコをインキュベートする。 </li><li> 例えば、培養増殖をモニターし、異常な細胞増殖のためにチェックし、潜在的な汚染物質を監視し、CULを越え、成長の進行状況をチェックするために100Xの総合倍率（TM）での倒立顕微鏡を使用してくださいトゥーレ表面。 </li><li>培養表面を乱すことなく10日 - 7日毎完全培地変化（フラスコあたり〜4ミリリットル培養培地）を実行します。 </li><li>培養表面が、細胞を解離するためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む0.25％トリプシンを用いて細胞増殖（コンフルエント）によって覆わ約80％である場合、培養物を通過させる。各培養フラスコにトリプシン3ミリリットルと短期間酵素に培養物（複数可）を公開する - 〜2の追加 - 完全な細胞解離を達成するために、（5〜10分）。 </li><li>酵素活性を停止し、遠心分離コニカルチューブにソリューション全体を転送するために - （3mlの〜2）培養フラスコ（複数可）に新鮮な培地を同量を追加します。 </li><li> 350×gで6分間、4℃で遠心分離により細胞をペレット化。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、各チューブに新鮮な培地〜8ミリリットルを追加します。静かにピペットを用いて細胞をホモジナイズする。 </li><li> 1での分割培養：2比25 cm 2のフラスコ（〜セルsoluti 4mlのフラスコ当たりで）及び新たに渡された文化を残して、懸濁液中の細胞がフラスコの表面にしっかりと付着させ48時間平静。 注：1cm 2の成長表面を有する48ウェル滅菌組織培養プレート中の細胞の培養も可能であり、それらは〜250μlのに培養培地の体積の減少と培養フラスコと同様に維持することができる。 </li></ol> 2全ウイルスの抽出<ol><li>ウイルス陽性のHの体全体を均一化〜10秒間隔ボルテックス0.02％のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（DETCA）とリン酸緩衝液中vitripennis、pH約7.2、ノー存在する組織のより大きな塊がなくなるまで。 4℃または4℃で16時間22000×gで4時間124,500×gで超高速遠心分離を経由してウイルスを抽出します。一番上に沈殿物が形成した場合、滅菌綿棒11でそれを削除してください。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>ペレットを収集し、0.4％のNa-デオキシコール酸および4％のポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ブリジ52）を含む、5ミリリットルの10mMリン酸緩衝液（無DETCA）、pH約7.2で溶解する。 <ol><li>よくペレットを混合するために、チューブの側面からペレットを除去し、必要に応じて、溶液中まで押しつぶす。 </li><li>ペレットは、必要に応じて溶液中に行くと2のチューブ11内に組み合わせる助けるために〜5ミリリットル刻みで、10 mMのリン酸緩衝液を追加します。 </li></ol></li><li>遠心分離し、15分間11、300×gでソリューションを提供します。 </li><li>上清を除去し、0.45μmのフィルターを通して溶液を渡し、大規模なコレクションチューブ11内のろ液を収集します。 </li><li> 3.5 kDの分子量カットオフ（MWCO）を用いて透析膜に転送するろ液、11を必要に応じて何DETCAを含まないリン酸緩衝液（pH7）に10 mMの少量を使用した。 </li><li> 4℃でのddH 2 Oで満たされた大きなビーカーに透析膜を配置します。のddH 2 Oを1時間ごとにFを変更するまたは5から6時間後、膜11中の白色の沈殿物が形成されるまで。 </li><li>膜内から精製されたウイルスを回収し、のddH 2 O を 90μlに溶液10μlを添加することによって、10倍希釈シリーズに、100％のウイルス液を施す：100,000その後1の希釈に達するまでのddH 2 Oをさらに90μlに希釈液10μlを加える。 </li><li> -80℃で保存ウイルス液。 </li></ol> 3。ウイルス複製<ol><li> 48ウェル培養プレートにおける種子細胞と細胞増殖が80％コンフルエント（細胞が平均速度で成長している場合は約72時間後に合格）になるまで、すべての行を育てる。 </li><li>一番上の行を除いて、 等 100希釈、：細胞増殖がコンフルエント、 すなわち、1:10希釈、1つの行の一つの行に達する連続希釈したウイルスを用いてセルの各行に接種する。コントロールとして一番上の行を使用し、ボリュームコントロールなどの各ウェルにのddH 2 O10μlのを追加します。 <ol><li>前ウイルスと培養中のいずれかの井戸の最初の接種に、各行の最初のウェルを、実験的な細胞数と比較するための出発ベースライン細胞濃度を確立解離とカウントするため。 </li></ol></li><li> pH変化を示す培地中のいずれかの色の変化のためと細胞形態の変化のためのウイルス接種後、培養プレートを24時間毎に監視します。 </li><li> 100X TMに倒立顕微鏡を用いて、各時点で試験板の画像つの列。 </li><li> -80℃でRNA抽出とウイルス定量化または長期-20℃でそれぞれ24時間の時点で撮像された列からすべてのメディアを取り外し、短期的に保管してください。 </li><li>再懸 ​​濁細胞ペレに酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、1.9の新鮮な培地〜250μlの-以前のステップ1.6で説明したように培地を除去した後、ウェルから細胞を解離させるトン。 </li><li>一週間にわたって各24時間の期間のための細胞解離後の細胞数を実行するための細胞を含有する各チューブに0.4％トリパンブルー染色液10μlを追加します。汚れが細胞数を実行する前に、10分間静置する。 <ol><li>汚れや生細胞への曝露の1時間以内に細胞数を実行すると、汚れだけでなく、非生存細胞を取り込むために開始されます。 </li></ol></li><li>ゆっくりとマイクロピペットを用いて、標準的な血球計数器の両側に染色された細胞溶液10μlを加える。溶液を、気泡を避けるために、毛管作用によって取り込まれることを可能にする。 </li><li>血球計数器の両側に実行可能な（非染色）細胞（血球計数器16の正方形の4カウントに相当）の数をカウントします。削除された列の各ウェルのために細胞数を実行します。 </li><li>各列からの細胞数を平均し、全細胞カウント数取得するには、次の式を使用します。x希釈係数（セル/ 4の平均数）=セル×10の数を<suP&gt; 4ミリリットル。これは、培養中の細胞密度または生存細胞の数である。 </li></ol>細胞培養から4ウイルスの抽出<ol><li>処理されたHを削除する1.8酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、 -以前のステップ1.6で説明したように培養フラスコから細胞をvitripennis。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 2.8 -以前のステップ2.3で説明したプロトコルに従って、培養細胞からウイルスを抽出します。 </li></ol> 5。RNA抽出<ol><li>製造業者のプロトコルごとの液体サンプル用に設計されたグアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出を使用して、各1週間のウイルス試験中に回収した培地のサンプルからRNAを抽出します。 </li><li>ストアを-80℃でサンプルを抽出した。 </li></ol> 6 RT-PCR <ol><li>使用した伝統的なPCR法を実行して、RT-PCRのためのウイルスの基準を確立ウイルスとのプライマー対HOCV RT-PCRプライマー1（フォワード5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;、5&#39;-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3を逆転&#39;）全身H.から分離するvitripennis。 </li><li>主題PCR産物は、0.1％臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで120 Vで60分間電気泳動をゲル化する。 </li><li>ゲルからのバンドを切り出し、製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キットを用いて精製する。 </li><li>プールは、すべて切除し、ゲル精製し、製品と、さらに基本的なエタノール沈殿により精製し。全体的な試料濃度を増加させるためにトリスEDTA（TE）の約30μlの沈殿生成物を溶出する。 </li><li>核酸検出のための260/230波長設定を使用して分光光度法を介してプールされたサンプル中のcDNAのレベルを定量化する。 </li><li> 57 ngの/ 57 AG /μL（10 -18）μLの範囲までの精製標品の10倍連続希釈系列を実行します。 iを記載したものと同様の連続希釈を行うnの濃度の要件の違いのために作ら調整を2.8。 </li><li>低存在転写産物の信頼性の高い定量化と定量RT-PCRキットを使用して定量RT-PCRを行うことによって希釈系列の検出限界を決定します。 注：5×10 -3コピーよりウイルス濃度は低いが検出されない。 </li><li>ステップ5.1で、前述のように実験試料からRNAを抽出し、分光光度法を使用して定量化する。 </li><li> 5 ngの/ヌクレアーゼを含まない水を使用してμlに抽出されたすべてのサンプルを正規化します。 </li><li>次のように低コピー数を感知する能力を持つワンステップ定量RT-PCRキットを用いて25μlの反応として、二重に、すべての試料について定量RT-PCRを行う：50℃で10分間保持し; 5分間95℃で保持。 10秒、30秒、60°C、95°Cの30サイクル;各ステップでの5秒間99℃ - 50から溶融。 <ol><li>各反応混合物は1倍maste12.5μlのが含まれているように、マスターミックスを作るRミックス、フォワードプライマー1.0μL（0.3μM）、リバースプライマー1.0μL（0.3μM）、逆転写酵素および標準化値に基づいて、テンプレートの可変量の0.25μlの。 </li><li> RNaseを含まない水で25μlの総反応容量を持参してください。 </li><li> 5×10 -10、5×10 -8、5×10 -6、5×10 -4、5×10 -2のコピー：各PCRの5つの標準濃度以下のコピー数を使用して実行を含めます。各実行の開始時に早期取得時のノイズを低減するためにちょうど10倍-2.5の蛍光の下にそれぞれの実行のためのしきい値を設定します。 </li></ol></li></ol> 7。共焦点顕微鏡<ol><li>各ウェルに直径18mmのガラス製カバースリップを含む12ウェルプレートにHomalodisca vitripennis細胞を成長させる。 </li><li>単層が達成された後、四日間の期間プレートに24時間毎に1つの列に接種する。各Cことを確認してくださいolumnがうまくコントロールが含まれている、低ウイルス希釈（1:10）だけでなく、高いウイルス希釈（1：100,000）よく。ステップ2.8から得られたウイルス溶液を使用してください。 </li><li> 5日目にすべてのメディアを取り出して、1×PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。 </li><li> 30分間、4℃での冷4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li><li> 1Xリン酸500μlの細胞に緩衝食塩水（PBS）を追加し、低速でロッカー上、室温で10分間、それらを洗ってください。細胞を3回洗浄する。 </li><li>それらを透過するために、細胞を0.1％トリトンX-100の500を添加する。室温で10分間放置します。 </li><li>先にステップ7.5で説明したように、再び細胞を洗浄する。 </li><li> RTで細胞をブロックするために、5％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液500μlを加える。 2時間放置した後、削除してみましょう。 </li><li> ×PBS中5％BSAを含む250およびF-アクチンのため汚れに各ウェルに希釈液を250μlを追加：在庫ローダミンレッド - 結合ファロイジン（RCP）1に希釈する。 </li><li>アルミFのカバープレート漂白から染料を防止し、4℃のCO / Nで細胞を培養するためのオイル。 </li><li>インキュベーションの12時間後にRCPを除去し、4を250μlと交換して &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（250μg/ ml）を、5％BSAを含む1×PBS中に希釈し、細胞の核を染色する。 </li><li>室温で1時間DAPIを含有する細胞をインキュベートする。 </li><li>先にステップ7.5で説明したように1×PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>静かに井戸からカバースリップを除去し、抗退色試薬とマウントメディアを使用してスライドを顕微鏡にマウントします。 </li><li>共焦点顕微鏡下で観察されるまでスライドを遮光箱に乾燥することができます。 Viewは、できるだけ早く染料が急速にフェードすることができますようにスライドを用意しました。 </li><li> 63X（油）は平面-apochromateレンズを含む顕微鏡を備えた共焦点顕微鏡システムを用いて画像染色された細胞。 <ol><li> 543±10nmの励起及びRhoadmine赤conjucatedファロイジン575±10 nm発光レーザの波長を設定しますDAPI用、および369±10nmの励起及び450±30 nm発光。 </li><li>すべての画像を取得するために、検出器のために、同一のゲインとオフセットの設定を使用します。 </li><li>ソフトウェアを管理イメージに適切な画像処理ソフトウェアおよびソーティングおよびインポート所望の画像を用いて処理画像。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

侵略的な農業の種の流入に関するライジング懸念は、新興害虫や病原体から身を守るための新たな方法論の需要増加につながりました。病気の予防と管理の焦点は、病原体のベクトルの管理を含み、この研究の主な対象となった。経済性、実用的なアプリケーションは、大面積にわたって、低コスト12に大量である必要があるため、農業において、病原ベクトルを管理するためのバイ...

（Homalodisca vitripennisゲルマール1821）ガラス状の翼狙撃兵はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、北米1ブドウ（PD）のピアース病の原因因子の優勢なベクトルとして同定されている。昆虫個体群管理はすぐにカリフォルニアのブドウ栽培産業へと南部米国各地、この破壊的な問題に対処するための研究の焦点となっている。家族Dicistroviridae、Homalodisca coagulataのウイルス01（HOCV-01）に属するプラスセンス一本鎖RNAウイルスは、野生H.で同定されているvitripennis集団および殺虫剤に害虫の抵抗性を低下させながら、それらの集団2-4の死亡率を増加させることが示さ。 効果的にリアH.感染させる手法の開発実験室の設定で成体までvitripennisがあるため困難であった<eM&gt; H。 vitripennisは宿主植物5-8さまざまなを必要とする別のステージ特異的な栄養ニーズを持っている。具体的な施設は、リアライブHに必要とされる米国ではvitripennis;そのため、細胞培養は、より経済的で実行可能な代替だけでなく、HOCV-01の検出およびレプリケーション2,9にとってますます不可欠です。 H.の細胞培養を確立するための基本的な方法は、一方vitripennisが記述され、これらの方法はまだ、このようなウイルス2のような生物的防除剤の商業生産のために利用されていない。 次の手順の全体的な目標は、生物的防除剤としての利用に適しHOCV-01を高濃度で製造することである。ウイルス複製がなぜ成功し、Hを栽培し、最適化された生細胞を必要とし、 vitripennis培養は、ウイルスの収益性の高いレベルを生成するの進展に不可欠です。

<table><tbody><tr><td>Corning cell culture flasks</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Surface area 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, canted neck, cap (plug seal)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Inverted microscope and camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA &amp;bull; 4Na per liter of Hanks&amp;prime; Balanced Salt Solution with phenol red</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR multiwell culture plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 wells (TC treated with lid)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filter system</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &amp;mu;m, membrane area 54.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, filter capacity 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td></tr><tr><td>Phosphate buffer solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>For electrophoresis</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, for molecular biology, powder</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Phosphate buffered saline</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine red-conjugated phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect medium (supplemented, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salts (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>MEM, amino acid mix (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>1 M MgCl solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ glutamine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr></tbody></table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

ガラス状の翼狙撃兵（Homalodisca vitripennis）は米国南西部で発見、非常vagileと雑食昆虫です。これらの昆虫はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、ブドウのピアース病（PD）の病因である木部が制限された細菌の優勢なベクトルである。ピアース病は、経済的に有害である。したがって、H. vitripennisは、病原体管理戦略のターゲットとなっている。 Homalodiscaのcoagulataウイルス-01（HOCV-01）と同定dicistrovirusはHの死亡率の増加と関連していたvitripennis集団 。宿主細胞はHOCV-01の複製に必要とされるため、細胞培養は、ロジスティックや生物農薬生産のための経済的価値がある目標と複製のための均一な環境を提供します。 H.の大規模増殖のために本研究では、システムpを組織培養を介した細胞が開発されたvitripennisウイルス複製のメカニズムをroviding。 HOCV-01は、全身昆虫から抽出され、培養されたH.に接種したさまざまなレベルで細胞をvitripennis。培養培地は168時間、24時間毎に除去し、RNAを抽出し、定量RT-PCRで分析した。細胞は、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いて細胞生存性を定量化するために計数した。全ウイルス粒子は、全細胞培養崩壊が発生する前であると判断した時点であった、感染後96時間までの抽出された。細胞はまた、蛍光染色を施し、F-アクチンの取り付けおよび核完全性に対するウイルス活性を調査するために、共焦点顕微鏡を用いて観察した。この研究の結論は、Hである。 vitripennis細胞を培養し、バイオ農薬の生産を可能にするために適切なレベルでHOCV-01の大量生産のために使用されることが可能である。

細胞の付着および成長が一次培養し、継続的な通路から、小規模および大規模の両方の培養フラスコ中の通路の48時間以内に見られた。線維芽細胞成長および発達にも、この時間枠内で観察された。新たに播種したフラスコは、48時間前に妨害されたとき、そこに、細胞の接着では見え下落したこともある遅い成長している文化や全く付着または成長につながる。細胞は、通過する一週間以内...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。

の伝播<em&gt; Homalodisca coagulataウイルス01</em&gt;経由<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt;細胞培養

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.7K ビュー.  University of Texas at Tyler. ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。 

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

免疫・感染学

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

生物学

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is predominantly transmitted by blood transfusions, inadequate sanitary conditions and contaminated food products. To date the off-label drug ribavirin (RBV) is the treatment of choice for many patients. Nonetheless, a specific HEV treatment remains to be identified. So far, the knowledge about the HEV life cycle and pathogenesis has been severely hampered because of the lack of an efficient HEV cell culture system. A robust cell culture system is essential for the study of the viral life cycle which also includes the viral pathogenesis. With the method described here one can produce viral titers of up to 3 x 106 focus forming unit/mL (FFU/mL) of non-enveloped HEV and up to 5 x 104 FFU/mL of enveloped HEV. Using these particles, it is possible to infect a variety of cells of diverse origins including primary cells and human, as well as animal cell lines. The production of infectious HEV particles from plasmids poses an infinite source, which makes this protocol exceedingly efficient.

Described here is an effective method on how to produce high viral titer stocks of hepatitis E virus (HEV) to efficiently infect hepatoma cells. With the presented method, both non-enveloped, as well as enveloped viral particles can be harvested and used for inoculating various cell lines.

高力子型E型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

野外採集蚊からの蚊関連ウイルスの分離

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Cellular Impedance-Based Survival Kinetics Assay to Assess Virus Survival

Source: Labadie, T. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61133">Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes a cellular impedance-based technique to study the survival kinetics of viruses that induce cytopathic effects. The method measures the electrical impedance of virus-infected adherent cells pre-treated with saline.

ウイルスの生存を評価するための細胞インピーダンスベースの生存速度論アッセイ

Source: Labadie, T. et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021).
This video describes ...

の伝播

要約

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Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホストウイルスの相互作用の解析

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

高力子型E型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル

野外採集蚊からの蚊関連ウイルスの分離

ウイルスの生存を評価するための細胞インピーダンスベースの生存速度論アッセイ

の伝播

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Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

高力子型E型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル

野外採集蚊からの蚊関連ウイルスの分離

ウイルスの生存を評価するための細胞インピーダンスベースの生存速度論アッセイ

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホストウイルスの相互作用の解析