We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

NOT: Tüm deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi Rehberi bağlı kalarak, Ottawa Hayvan Bakım etik kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Ön cerrahi hazırlanması ve Malzeme <ol><li> Plazmid hazırlanması: <ol><li> Üreticinin protokolüne göre Qiagen MegaPrep kullanılarak plazmidler hazırlayın. Yüksek DNA verimi sağlar ve bir gece boyunca inkübe etmek, transforme edilen bakterilerden LB et suyu, en az 400 ml aşılanmasında. </li><li> En az 5 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar, 100-200 ul TE içinde yeniden süspanse plazmid. -20 ° C&#39;de kısım, DNA ve saklayın. Konsantrasyonu çok düşük ise, çökmez ve bu kirlilikleri ekleyebilirsiniz olarak tekrar süspansiyon. Yeni bir hazırlık üzerine başlayın. </li><li> Ameliyat öncesi% 0.1 seyreltilmiş plazma çözeltisi 10 ya da 20 ul başına (ağırlık / hacim) hızlı yeşil boya 1 ul steril su içinde 2 ug / ml tek bir plazmid (örneğin Kre-GFP) seyreltin. GFP EğerGFP ile işaretlenmiş tüm hücreler hem de-elektroporasyona CO ihtimalini en üst düzeye çıkarmak için 4: ve ilgi konusu genin, GFP plazmidi ve 1 arasında bir oranda ilgilenilen geni taşıyan plazmid enjekte ayrı plasmidler üzerindeki birlikte elektropore edilecekse plazmidler. </li></ol></li><li> 62 ° C &#39;de bir tek aşamalı çekme kullanılarak, standart bir iğne çektirmenin - Cam Mikro kapiller tüpler (bundan sonra iğneler olarak adlandırılır 1 mm dış çapında) çekin. </li><li> Aşağıdaki içeren bir cerrahi paketi Otoklav: iğne sahipleri, yara retraktör, forseps, cerrahi makas, iğne için makas, zımba, zımba, gazlı bez, yara örtüleri, cerrahi örtüler (Şekil 1A, B; Malzeme Tablosu). </li><li> Diğer gerekli araçları toplayın: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 veya 7 mm), tuzlu, dikiş, 5 ml şırınga (Malzeme Tablo). </li></ol> 2. Cerrahi Fare hazırlayın <ol><li> Ağrı yönetimi için, bir zamanlanmış-p enjektebir saat ameliyat öncesi Buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) ile regnant fare. E17.5 embriyonik gün 12.5 (E12.5) yerden zamanlanmış farelere bu protokolü uygulayın. </li><li> Arka yük için Microloader pipet ipuçlarını kullanın plazmid çözümü ile iğne çekti. Bu iğne tıkalı hale gelmesine neden olacaktır henüz iğne ucu içine tüm yol doldurmayın. </li><li> 1 L / dk O 2 ile% 2-5 izofluran gaz kullanarak fare uyuşturan. Bir kez hareketsiz, yüz maskesi yerleştirmek ve kurumasını önlemek için gözlere merhem uygulayın. 1 ml tuzlu suda arka (% 0.9 NaCl), deri altından enjekte edilir. NOT: izofluran gaz ile çalışırken, aşırı gaz hatırlamak ve odasına kaçmasını önlemek için gaz süpürücü kullanın. </li><li> Karın Tıraş. , Chlorohexadine fırçalayın ile karın yıkayın su ile durulayın ve chlorohexadine ve% 70 etanol son hazırlık çözümü uygulayın. Steril örtü veya gazlı bez ile kapak fare kürk kapsayacak, ancak karın maruz (Şekil 1C, D) terk etmek. </li></ol>utero Elektroporasyon olarak <ol><li> Alt meme arasındaki karın üzerinde deride bir kesi yapmak. Bağ dokusu yırtılarak alttaki kas tabakasından cilt çekin, sonra linea alba boyunca karın boşluğuna periton kesti. Ayrı yara kenarlarını çekmek için yara ekartörünü yerleştirin. </li><li> Karın boşluğundan rahim çıkarın ve gösterilen (Şekil 1E) olarak ortaya koymak. <ol><li> Farklı yavrular (örneğin, ilgi konusu gen ile GFP genel GFP gibi), farklı plazmitler ile enjekte edilecek ise, her iki tarafta yavrular sayısı ve her bir plasmid ile kaç enjekte hangilerinin ve karar verirler. Geri sıcak ve yağlanmış embriyolar tutmak için karın içine rahim bir tarafını değiştirin. Hemen serum fizyolojik ile maruz rahim (tercihen vücut sıcaklığına ısıtılmış) nemlendirin. </li><li> Aynı plazmid tüm yavrular enjekte Eğer haftaları (örneğin transgenik embriyolar içine Kre-GFP enjekte olduğu gibi)Y aynı anda rahim bir boynuz çıkarın. </li></ol></li><li> Küçük cerrahi makas veya ince forseps bir çift ile ucu kesilmiş dikkatle enjeksiyon değnek kavrama kafasına dolu bir iğne koyun ve. Henüz akışkan bir (Şekil 1Ji-iv) geçmesine izin verirken, iğne sürece mümkün kalması ucu kesilir. <ol><li> Ayak kürek basıldığında 0.1-0.2 ul küçük ama kolayca görülebilir damlacık iğne ucu görünür şekilde mikropüskürtücü (saniye cinsinden) enjeksiyonu uzunluğunu ve enjeksiyon basıncını ayarlayın. Farklı iğneler arasında mümkün olduğunca tutarlı Bu damlacık hacmini tutun. NOT: Bu adım, embriyo hayatta (tartışma) için önemlidir. </li><li> FemtoJet için aşağıdaki enjeksiyon parametrelerini kullanın: basınç enjekte (pi) = 250-300 hPa; Enjeksiyon süresi (ti) = 0.8-1.2 sn; tazminat basıncı = 10-50 hPa. Gerekirse, iğneler arasında bir farklılaşmanın düzeltileceği bu parametreleri ayarlamak. </li></ol></li><li> SBir embriyo seçme ve yavaşça arka, yukarı eğimli kafa (Şekil 1F) üzerine yerleştirin. NOT: Bu dönüm veya embriyo değişen gerektirebilir; Çok fazla baskı uygulamak ve embriyo manipüle ederken amniyon kesesinin yırtılması önlemek için dikkatli olun. </li><li> Embriyo yerleştirildikten sonra, sagital sinüs bir hilal şeklinde gölge paralel olarak sunuyor ventrikül bulun. Hafif bir açıyla ventrikül üzerindeki rahim iğne ucu dokunun ve rahim duvarından iğne rehberlik. Gerekli basmç miktarı iğne netlik bağlıdır. Ventrikül içine korteks ile iğne itin. NOT: nadiren herhangi bir ek saptanabilir direnç olmasına rağmen, embriyonun kafası genellikle biraz uzağa itti ve sonra iğne ventrikül içine korteks geçerken geri teper. </li><li> Plazmid çözüm enjekte etmek için ayak raket Pompa. Yeşil alan görünen ve uygun kadar pompalamaya devamventrikül (Şekil 1G) ark şekli. Genç embriyoların (E14.5 E12.5 için) boya genellikle karşı ventrikül içine nüfuz edecek. Not: pompa sayısı iğne ucu çapına bağlıdır, embriyo (ve karıncığın elde edilen boyutu) ve istenilen enjeksiyon hacmi yaşı. Hacmi tutun embriyolar arasında mümkün olduğunca tutarlı enjekte. </li><li> Üç ya da dört embriyolar enjekte edilir. Prosedür boyunca tuzlu su ile nemli tüm maruz embriyolar tutun. </li><li> Geri enjekte ilk embriyoların gidin ve pozitif elektrot beynin (Şekil 1 H) istenen bölgeye plazmid çekecektir böyle kürekler yerleştirin. Açı negatif elektrot için elektrotlar arasındaki en kısa yol elektroporasyon için hedef yapı (Şekil 2) içinden geçer. </li><li> Kürekler yerdesiniz kez, şok uygulanır. Embriyoların yaş ve boyutuna bağlı olarak, 35-50 V 5 bakliyat kullanın (T bkzmümkün 1). Aşağıdaki elektroporasyon parametreleri kullanın: 5 msn darbe uzunluğu 950 msn darbe aralığı ile. Tüm enjekte embriyolar ile tekrarlayın. </li><li> Geçen iğne olasılıkla kurutulmuş ve adım 3.9 sırasında tıkanmış gibi adım 3.3 gibi yeni ön-yüklenmiş iğne ucu kesin. Aynı plasmid ya da farklı bir plazmid ya da üç ya da dört embriyo sonraki resim enjekte edilir ve daha sonra adım 3.9 olarak darbe uygulanır. Rahim bir tarafında tüm yavrular enjekte edildiğinde, dişinin karın rahim ikinci tarafını kaldırın ve daha sonra sıcak tutmak için tamamlanmış tarafı değiştirin. </li><li> Amnion kesesi travma önlemek için çok fazla baskı uygulamak için tuzlu su ile değil, nemli yüzey tutmak için dikkatli olmak kadın rahim her iki tarafını dön. Basit bir sürekli dikiş kullanılarak kapatıldı kas tabakası dikin. Zımba cilt kapattı. Zımba mevcut değilse, basit bir kesintiye dikiş ile cilt sütür. (Şekil 1 H) </li><li> Suturi dang, giderek hamile dişinin anestezi hafifletmek için izin izofluran aşağı çevirin. NOT: Ameliyat tamamlandıktan sonra bu barajın uyarılma hızlandırmak olacaktır; embriyo yaşam artıracak mümkün olduğunca kısa bir süre için anestezi kadın tutmak. Toplam ameliyat süresi, kadın ilk kez anestezi ne zaman başlayarak, yaklaşık 30 dakika olmalıdır. </li></ol> 4. Sonrası Bakım <ol><li> Bir inkübatör veya anestezi kurtarmak için bir ısıtma pedi üzerinde dikildi kadın yerleştirin. Temiz yatak onu yatak ve kafes içinde standart bir toparlanma jel hidrasyon korumak yerleştirin. Cerrahi sonrası ağrı tedavisi için, daha sonra ameliyat sonrası 8 saat aralıklarla, 12 saat aralıklarla dört ek dozlar en Buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) bir kadın üç doz vermek. </li></ol> 5. Hasat Brain NOT: Brain yetişkinliğe herhangi bir yaş kadar hasat edilebilir. şu geçerlidirdoğumdan önce beyinleri toplamak için. Yavrular dünyaya bir kez, rahim içinde sipariş çöp her yavru ya aynı plazmid ile enjekte edilmelidir, böylece kaybolur, ya da kontrol ve deney hayvanlar arasındaki farklılaşma başka bir yöntem icat gerektiğini unutmayın. <ol><li> Soğuk (4 ° C) Hazırlama kadın ötenazi önce% 4 paraformaldehid (PFA) filtre edilmiştir. </li><li> Sodyum pentobarbital (100 mg / kg vücut ağırlığı) öldürücü bir dozda intraperitonal enjeksiyonu ile dişi öldürülür ve açık karın kesti. Rahim iki tarafını çekin ve yavrular başlangıçta enjekte edildiğinde olarak yatıyordu. <ol><li> Tüm yavrular gibi bir transgenik çöp içine Cre enjekte ederken aynı plazmid, alınan durumunda, embriyo sırası nedenle PBS içinde kadın ve yersiz rahim kesmek, önemli değil. </li><li> Yavrular farklı plazmid ile enjekte olsaydı, herhangi bir ölü yavrular belirterek, her yavru bulmak için emin olun, kontrol ve experimen enjekte edildi hangilerinin belirlemekkadın rahim çıkarmadan önce tal plazmidler. Yavru uterus PBS içinde hangi grup daha sonra ait olduğu izlemek için dikkatli olun. </li></ol></li><li> Her biri tek tek yavru çıkarın keskin bir makas veya bir tıraş bıçağı ile başını kesmek ve PBS içinde kafa yerleştirin. Transgenik farelerin durumunda, genotipleme için doku numuneleri toplamak ve bir 12-çukurlu plaka içindeki gibi, ayrı ayrı her bir kafayı tutun. </li><li> Diseksiyon kapsamında, değil nick dikkatli olmak, kafatası korteks beyin kaldırmak veya orta hat gözyaşı. Bir floresan mikroskop kullanarak, başarılı elektropore belirten, beyinleri bir GFP + yama olup olmadığını görmek için kontrol edin. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de PFA içine daldırma ile beyin sabitleyin. NOT: PFA sık sık sinyal doyurur çünkü önce tespite GFP ifade beyinlerini kontrol edin. </li><li> Dondurulmadan önce en az üç gün boyunca% 20 sukroz içinde daldırma yoluyla cryoprotect beyinleri. T sükroz% 10 gradyan,% 15 ve% 20 (her bir çözelti içinde, 24 saat) kullanarakO ozmotik basınca bağlı doku hasarı önlemek. -80 ° C&#39;de dondurulmuş beyinleri saklayın ve 10-14 mikron kalınlığında kesitler bir kriyostat üzerinde kesti. </li></ol> Anti-GFP ile 6. Ortak boyama Not: antijen geri alma ko-leke anti-GFP ile gerekli ise, GFP sinyali ödün vermeyen hafif bir antijen geri alma protokolü kullanılması önemlidir. Bazı antijen alma protokolleri (hatta GFP karşı bir antikor ile) GFP boyama ile birlikte kullanmak için çok sert. Önce birincil antikor uygulaması temel sitrik asit ön-işlem, en epitoplar 24 için başarılı olur. <ol><li> GKD 2 O. sitrik asit 0.01 M bir solüsyon yapmak bir kalibre edilmiş pH metre kullanılarak 6 pH değerine sahiptir. </li><li> Sitrik asit kadar mikrodalga ya da su banyosu içinde boyanması odasındaki ısı sitrik asit, 75-80 ° C&#39;ye ulaştı. 10-15 dakika boyama odasında slaytlar koyun. Mümkün olduğunca istikrarlı olarak sıcaklığını muhafaza. </li><li> PBS slaytlar yıkayın3x, oda sıcaklığında 3 dakika daha karıştırıldı. Primer antikor uygulayın ve bir standart protokole göre immün devam edin. </li><li> (Şekil 3A) yıkmak onaylamak için GFP eş-etiketleme ve ilgi gen tarafından Cre aracılı eksizyon doğrulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration.">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+neuronal+migration.">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li><li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+requirement+for+Rb/E2F3+in+neuronal+migration:+evidence+for+cell+cycle-independent+functions.">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li><li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li><li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis.">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex.">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse.">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors.">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li><li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2.">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li><li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression.">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation.">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li><li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro.">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells.">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .</li><li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express.">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeting+in+mice:+a+review.">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li><li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein,+Rb,+in+neuronal+migration.">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li><li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis.">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li><li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons.">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li><li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression.">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .</li><li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Utero electroporations performans birincil sorunlar iki embriyo öldürücü ve 2) electroporations arasındaki değişkenliği azaltarak engelliyor) 1 bulunmaktadır. Künt iğne embriyo daha fazla hasar gibi öldürücü önlemede en önemli faktörlerden biri, iğne kalitesidir. İğneyi keserken hala ayak kürek (Şekil 1J) bir pompa aşağıdaki görünmesini sıvı 0.1-0.2 ul görünür damlacık izin verirken, mümkün olduğunca uzun ucu tutun. İğne çok sıkıcı ya da şaft...

Radyal göç erken kortikal gelişim merkezi bir süreçtir. Bu tür doğru mitotik çıkış ve nöronal farklılaşması, hücre polarite, sitoskeletal dinamikleri ve zar-ötesi reseptörlerin ekspresyonunun düzenlenmesini, hem de bu tür bir radyal glial iskele oluşumu olmayan hücre otonom faktörleri ve hücre otonom faktörler, çeşitli bağlıdır göçmen rehberlik salgılanması 1-3 molekülleri. Bu mekanizmaların herhangi birinin bozulması beri karmaşık ve zor bir süreç olabilir göç bir kusur yatan nedenini belirlemek, bir transgenik fare modelinde 4-8 nöronal göç bozabilir. Utero elektroporasyon (İEÜ) olarak tamamlayacak ve basitleştirmek için kullanılabilir böylece genetik knock-out model fenotip ve yorumlanması radyal göç 7,9-11 için gerekli önemli mekanizmaları aydınlatmak. Utero elektroporasyon (İEÜ) süreci olan bir plazmid carryi tarafından<html> İlgili bir geni ve bir raportör hem ng bir fare veya sıçan embriyo beyninde ventrikül içine enjekte edilir ve daha sonra bir elektrik akımı 12-14 kullanımı ile ventrikül astar hücreleri içine çekilir. Bu araştırmacı yukarı veya geliştirme ya da Electroporated nöronların fonksiyonu ilgi bir gen düzenlenmesi aşağı etkisini analiz etmeyi sağlar. İEÜ sonra, beyinleri immunohistokimyasal 7,9-11, elektrofizyoloji 15 ya da hücre kültürü 16,17 için işlenebilir. İEÜ büyük avantajı, bu gen ekspresyonunun yüksek oranda spesifik müdahale edilebilmesini sağlar olmasıdır. Ayrıca, İUE yönlendirilmiş bir akım (Şekil 2) boyunca gelişen beynin belirli bir bölgeyi hedef için kullanılabilir. İUE çeşitli promotörler ya da plazmid tahrik sistemleri kontrolü altındaki genleri taşıyan plazmid enjeksiyonu yoluyla, belirli bir hücre türü hedef için kullanılabilir 10,18-21 (tetrasiklin ile uyarılan gen ifadesi bir örnektir). &gt; İUE Cre Lox aracılığıyla gen eksizyon sistemi 7-9,11,22 ile bağlantılı olarak kullanılabilir jove_content &quot;. Cre proteini için mesaj kodlayan bir gen içeren bir plazmid floxed alel için bir embriyo homozigot (elektroporasyona edilebilir olup, burada gen veya belirli DNA bölgeleri Cre aracılı DNA rekombinasyon, iki loxP sitelerinin) tarafından kuşatılmıştır. Cre daha sonra, spesifik elektroporasyona sinir ön ilgi konusu genin rekombinasyona neden olacaktır, ve floxed allele.The etkisinin bir knock-out üretilmesi sinir göç ve bireysel nöronlar içinde gelişimine demonte protein daha sonra incelenebilir. Cre Elektroporasyon sağlam destek ortamı terk etkilenen hücrelerin sadece küçük bir popülasyonda rekombinasyonu neden olur. Bunun tersine, belirli bir hücre tipinin kontrol altında Cre dokuya özgü sentezleme promotör, tüm dokusu boyunca meydana hem göç Nöroblastlar ve çevresini etkilenmiş olabileceğini. Böylece, Jux böyleceBu iki yaklaşımın taposition verilen göç kusur özerk ya da hücre dışı özerk mekanizmaları hücre bağlı olup olmadığını belirleyebilir. Her iki deneysel sistemlerde Arızalı göç anlaşılacağı bir hücre özerk mekanizması gözlemlenen fenotip sonuçları olduğunu; bir doku-spesifik Cre modelinde kusurlu göç Cre elektroporasyonu, aşağıdaki normal bir göç ilgi konusu gen, bir hücre olmayan bağımsız bir mekanizma yoluyla etki olduğunu gösterir. İEÜ da nakavt hayvanlar 7,9,10 içine potansiyel etkileşim genleri electroporating kurtarma deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir araştırmacı bir alt hedef electroporating ve göç kusur Electroporated nöronlar giderilmiştir ise belirleyerek bir transgenik modelinde bir göç fenotip kurtarmak için çalışabilir. Bu başarılı bir kurtarma normal bir göç SPE protein ifadesini manipüle tarafından restore edilebileceğini belirtir ek yararı vardır, spesifik nöron, çevredeki ortam hala hedeflenen gen için eksik olsa. Yine, bu yaklaşım daha fazla zaman ve kusurlu mekanizma hücre özerk olup olmadığını belirlemek yararı, transgenik çizgiler kapısı veya oluştururken daha maliyetli olduğunu. İUE nakavt embriyolar (Şekil 4C) bir haberci plazmid elektroporasyonu yoluyla nöronlar göç izlemek için kullanılabilir. Ameliyat sırasında ventrikül astar sadece nöronlar 17 elektropore olarak, İEÜ in vivo morfolojisi görselleştirme avantajı ile belirli bir zamanda doğmuş nöronlar takip etmek için kullanılabilir. Son olarak, bu tür orta veya dorsal telencephalon, hipokamp veya ganglionik eminensinden (Şekil 2) gibi beyin bölgeleri hedef IUE kullanmak mümkündür. Bu araştırmacılara komplikasyon sonuç belirli bir alanda bağımsız gen fonksiyonunu araştırmak için güç verirkomşu yapılarda demonte proteinden ing. Retinoblastoma proteini (pRb), p107 ve p130 cep protein ailesini oluşturan ve iyi hücre döngüsü çıkış regülatörleri kurulmuştur. Bununla birlikte, bu proteinler, aynı zamanda, nöral gelişimi, hücre döngüsü bağımsız yönlerini düzenleyen dair artan kanıtlar vardır. Daha önce görüldüğü gibi, pRb ve p107 hem teğet 4,23 ve radyal göç 6 önemli bir rol oynamaktadır. Burada, biz bir transgenik modeli Cre utero elektroporasyon kullanımını örneklendirmek için sinir göç 6 cep protein aile üyeleri pRb ve P107 rolünü göstermektedir. Özetle, İEÜ gen silme (veya aşırı ekspresyonu) hücre özerk etkilerini analiz güçlü bir yol sağlar. Modelleri nakavt özel dokusu ile kombine edildiğinde, İEÜ nöral göçü kontrol mekanizmaları ile ilgili ek bilgi sağlayabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Transgenik fare hatları Cre-Lox sistemini kullanarak Genetik silme protein fonksiyonunu incelemek için kullanılan güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çok özel Cre modellerinde dışında, bir doku veya hücre popülasyonu içinde bir proteinin silme genellikle birden fazla etkileşim mekanizmalardan kaynaklanan karmaşık fenotiplere yol açar. Söz konusu, ya da hücrenin çevre düşüklüğü kaynaklanabilecek olmayan bir hücre özerk bir mekanizma, gelen hücreye özgü bir hücre özerk mekanizmasının bozulması bir fenotip sonuçları, ayırt etmek zor olabilir olup olmadığını belirleme. Utero elektroporasyon, bir in vivo bağlamda protein işlevi anlamak için (İUE), gelişmekte olan korteks ya da seçilen diğer beyin bölgesi içindeki hücrelerin küçük bir alt grubu içerisinde, gen silme sağlar. İUE sırt telencephalon medial telencephalon, hipokampus veya ganglionik eminensinden da dahil olmak üzere spesifik beyin alanları, hedef için kullanılabilir. Bu gözlem o kolaylaştırırsağlıklı bir çevrede bağlamında hücre özerk gen silme sonuçları f. Bu protokolün amacı, İEÜ protein silme hücre özerk olmayan hücre özerk etkileri ayırt üzerinde durularak, floxed transgenik fare doğrultusunda radyal göç bir kusur analiz etmek nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Beyin gelişiminde proteinin işlevi sınırlı hücre popülasyonunda İUE aracılı gen silme karşı tüm korteks içinde gen silme kaynaklanan fenotip, daha iyi bir fikir karşılaştırarak izolasyonu ya tekniği kullanılarak daha yüksek verim elde edilebilir.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K Görüntüleme.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Video: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Gelişim Biyolojisi

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...