Protokol, öğrencilerin bireysel enfeksiyonları net bir şekilde tanımlamasına ve tahlili kolayca yapmasına yardımcı olarak viral titreyi ölçmeyi daha verimli hale getirir. Bu protokol, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir sabitleme ve boyama prosedürü içerir. Bu yöntem, hastalıklara karşı antiviral tedavilerin doğruluğu ve etkinliği hakkında fikir verebilir.
Bu veba protokolünün daha zor engelleri, hücrelerin işlem boyunca aşırı kalabalıklaşmamasını, kurumamasını veya çizilmemesini sağlayan tohumlama plakaları için hücre sayımlarıdır. Bu protokolün genel titiz doğasında da zorluklar yaşanabilir. Bununla birlikte, uygulama bu deneyin başarısının önemli bir katkısıdır.
Başlamak için, bir laboratuvar oturumunda hücrelere virüs ilavesiyle numune seyreltmesini tamamlayın. PBS'de plak bulunan her virüs örneğini seri olarak seyreltin. En hassas izleme için genellikle 10 kat seyreltmeler kullanın.
Bu seyreltilmiş virüs örneklerini hücrelere eklemeye hazır olana kadar tüm viral seyreltmeleri buz üzerinde tutun. Hücre kültürü ortamını bir pipet kullanarak bir veya iki kuyucuktan çıkarın. Seyreltilmiş virüs örneğini, her bir kuyucuğun kenarından damla damla her bir hücre katmanına damla damla dikkatlice ekleyin.
Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar işlemi her bir veya iki kuyucuk için tekrarlayın. Tüm plakayı elle hafifçe sallayın. Daha sonra virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Her 10 dakikada bir, plakayı inkübatörden çıkarın, virüsü her bir kuyucuğa daha eşit bir şekilde yaymak için yavaşça tekrar sallayın ve ardından inkübatöre geri yerleştirin. Emilmemiş inokulumu yanlışlıkla sayma olasılığını azaltmak için, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak virüs örneğini kuyucuklardan çıkarın ve numuneyi bir atık kabına atın. Plakaya 2,5 mililitre metilselüloz kaplama yerleştirin ve inkübatöre geri yerleştirin.
Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak ağartıcı, iyodofor veya benzeri bir virüsit ilavesiyle dezenfekte edin. İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz bindirmeyi bir pipet kullanarak bir seferde bir veya iki kuyucuktan çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin. Her bir oyuğa% 50 etanol içinde yaklaşık iki mililitre% 1 kristal menekşe ekleyin.
Tabağı, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla inkübe edin. Bu noktada, atık kabı daha önce gösterildiği gibi dezenfekte edin. Akış temizlenene kadar plakaları musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın.
Her seyreltme serisindeki plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun. Şekil, plak sayılarında 10 kat azalmayı göstermektedir; burada sayılabilir plak sayısı, her üç kopya için 10'da eksi dört aralığına düşmüştür. Şekildeki ilk üç resim, eksi üç seyreltmeye kadar 10'daki plakları göstermektedir.
Bununla birlikte, alt sıra, bir plak testi iyi yapılmadığında sonuçları gösterir. Vero hücrelerinin substrattan tamamen kalktığı üst kısımdaki görünür alanlarda herhangi bir seyreltmeden görülebilen çok az plak vardır. Benzer şekilde, bu şekil plak testi sırasında hücrelerin kuruması veya yanlış kullanımı ile ilgili sorunları göstermektedir.
Bununla birlikte, bu rakam kritik olarak zayıf Vero hücresi tohumlamasını göstermektedir. Her kuyu, kuyu boyunca iyi yayılmamış ve kümeler halinde üst üste yığılmış hücrelerin göstergesi olan daha koyu mor lekeler gösterir. En iyi sonuçlar için, topaklanmış plakları önlemek için virüsün plaka boyunca eşit şekilde yayıldığından emin olun Plak tahlilleri diğer nicel yöntemlerden daha etkilidir, çünkü sadece canlı virüsü sayar.
Bu şekilde, gerçek antiviral etkinlik oluşturulabilir. Ek olarak, bu teknik, fomitler üzerindeki viral varlığı ölçmemize ve herpes virüsü araştırması sektörümüzdeki yeni tıbbi cihazlardan ilaç dağıtımının etkinliğini keşfetmemize izin vermiştir.
