Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

1. CRISPR Tasarım <ol><li> Tasarım sgRNAs elle veya serbestçe kullanılabilir çevrimiçi araçlar 7 kullanıyorsanız. Uzak hedef siteleri (hedef dışı etkileri) den bölünme riskini azaltmak için aynı genomik eşleşmeleri veya yakın maçları minimize kılavuz dizileri belirlemenize yardımcı olması için bu araçları kullanın. Bu rehber sıralar, genomik tanıma yerinde bir &quot;NGG&quot; sekansı (&quot;protospacer bitişik motifi&quot; veya PAM), üst akışında bir 20-mer (&quot;protospacer sırası&quot;) oluşur emin olun. Not: Şekil 1, genler ve kodlayıcı olmayan elemanları için mümkün olan silme stratejileri açıklamaktadır. Bir gen nakavt oluşturmak için, ekson içinde bulunan iki sgRNA fonksiyon kaybı hatta monoallelik silme klonları zenginleştirecektir. Bu mRNA transkripti (Şekil 1B) saçma kaynaklı çürümesine yol kare kaymalı mutasyonlar neden olabileceği silinmemiş alellerin 12 üzerinde oluşturulmuş indellerin, yüksek frekans kaynaklanmaktadır. </li><li> Kullanörnek fare PIM1 silinmek istenen (Tablo 1, Şekil 2A Mus musculus) için yönlendirir. NOT: Bu örnekte, sgRNA-A&#39;nın protospacer dizisi ve PAM sgRNA-B protospacer dizisi ve PAM üst (Watson) iplik (Şekil 2A) üzerine düşerken alt (Crick) iplikçikteki düşmek olur. Bununla birlikte, DSB üst veya alt sarmalına protospacer dizisi / PAM göre yönelimine bağımsız ortaya çıkar. </li><li> Her kılavuz dizisinin ters tamamlayıcısı (RC) belirler. Tablo 1, Tablo 2 de bulunan örnek PIM1 sgRNA tamamlayıcısı dizileri ters. </li><li> Klonlama ve ifade amaçları için ek nükleotidlerin dahil olmak üzere her rehber ve ilişkili ters tamamlayıcı için 24- veya 25-mer oligoları edinin. NOT: Burada pSpCas9 (BB) plazmid (pX330) (Addgene plazmid kimliği 42230) kullanımını tartışmak. Bu plazmid, aynı anda izin verirsgRNA ve SpCas9, ancak ekspresyonu seçimine 7 belirteçleri içermez. Diğer yapılar, örneğin GFP ve puromisin gibi seçilebilir işaretleyiciler, sırasıyla, ya da birden çok sgRNAs tek plasmidden eksprese edilebilir olduğu yapılan içerir pX458 (addgene plazmid İD 48138) ya da pX459 (addgene plazmid numarası 48139) gibi, kullanılabilir. <ol><li> BbsI kısıtlama enzimi (Tablo 3) kullanılarak pX330 vektörü içine klonlamak için rehberin ters tamamlayıcı önce 20-mer kılavuzu dizisi ve &quot;AAAC&quot; önce &quot;OAKK&quot; ekleyin. </li><li> 20-mer birinci pozisyonu OAKK dizisinden sonra bir G nükleotidin dahil edilmesi ile arttırılır pX330 vektörü U6 promoteri değil G. sgRNA sentezleme ise, OAKK dizisi sonra 20-mer önce bir G nükleotidi ekleme . Ters tamamlayıcı oligo 3 &#39;ucunda bir Cı ekleme (örneğin, sgRNA-A Tablo 4&#39;te). Elde edilen oligolar 25-mer oligolar olacaktır. </li><li> Nasıl20-mer (protospacer dizisinin) ilk pozisyonu G eğer hiç, başka bir G katmayan (örn, sgRNA-B Tablo 4&#39;te) ve ters tamamlayıcı oligo son konumuna C eklemeyin. Bu durumda, elde edilen oligolar 24-mer oligolar (Tablo 4) olur. </li></ol></li></ol> 2. Tasarım Silme Eleme Astarlar <ol><li> (&quot;Silme bant&quot;, 1 Rakamlar - 2) dizisi iç primerler Tasarımı bir set (&quot;non-silme bandı&quot;) ve memba ve sgRNA bölünme siteleri mansap primerlerin başka bir dizi silinecek. Silme yokluğunda, &quot;silme bandı&quot; sık sık verimli yükseltmek için çok büyük. Tipik algılama sgRNA hedef yerinde küçük bir Indel etkilenen olmaz sağlamak için tahmin bölünme sitesinden astarları en az 100 bp kullanın. <ol><li> (Skar sgRNA c üretilen küçük indeller analiz için ek primerler dizaynamaçlanan silme olmadan leavage sitesi). Ileri bir çift kullanın ve (150 içinde - 350 bp) her sgRNA hedef site kuşatan primerler ters skar incelemek için sgRNA hedef siteyi yükseltmek için. Bu monoallelik eksiltme klonu, içinde silinmemiş aleli ayırt edilmesi için yararlı olabilir. </li></ol></li><li> Küçük delesyonlar için (&quot;silme grubu&quot; yine amplifiye edilebilir), boyut silme varlığında ya da yokluğunda uygun olup olmadığını belirlemek için bir agaroz jel üzerinde amplikonları gidermek. Bu yaklaşım için, aşama 2.1&#39;de tanımlanan iç primerler ihmal edilebilir. </li></ol> 3. CRISPR Klonlama <ol><li> Tavlanması ve oligolar fosforile. <ol><li> GKD 2 O 100 uM&#39;lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse oligolar </li><li> 24- veya 25-mer tamamlay ters, 1.0 ul sgRNA (bkz: adım 1.4 100 mcM) 1.0 ul sgRNA 24- veya 25-mer, oligo: 10 ul reaksiyon her rehber karışımı ve ters tamamlayıcısı hazırlayınt, oligo, 1.0 ul 10x T4 ligasyon tamponu, 6.5 ul GKD 2 O ve 0.5 ul T4 Polinükleotid Kinazı (PNK) (10,000 U / ml) (100 uM adım 1.4). NOT: fosforillenmiş oligolar yerine sipariş edilebilir. Bu yaklaşım için, T4 PNK kullanımı atlanmıştır. </li><li> Aşağıdaki parametreler kullanılarak bir PCR tavlama: 30 dakika boyunca 37 ° C; 95 ° C 5 dakika süre ile ve daha sonra 5 ° C / dk&#39;da 25 ° C&#39;ye kadar rampa. </li><li> GKD 2 O oligolar 1:10 seyreltin (örneğin, 1.0 ul 1 uM&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için oligolar + 9.0 ul GKD 2 O tavlama). </li></ol></li><li> Golden Gate montaj klonlama stratejisi 26 kullanılarak pX330 içine ligatı tavlı oligolar. <ol><li> 50 ul reaksiyon karışımı hazırlayın: 100 ng dairesel pX330 vektör, 1.0 ul tavlanmış oligolar (1 uM, adım 3.1.4), 5.0 ul sınırlayıcı enzim tamponu (10x), 4.0 ul (20 U) BbsI sınır enzimi (5000 U / mi), 5,0 μL ATP (10 mM), 0.25 ul (5 ug), BSA (20 mg / ml), 0.375 ul (750 U), T4 DNA ligaz (2,000,000 U / ml), ve H2O 50 ul son hacim olması için. Gerekirse bu reaksiyon, daha küçük bir son hacme küçültülmüş olabilir. </li><li> Aşağıdaki parametreler kullanılarak bir PCR çalıştırmak örnekler döngüler, 1-20 (5 dakika için 37 ° C, 5 dakika için 20 ° C); Döngü 21 (20 dakika boyunca 80 ° C). Bu döngü koşulları tek bir reaksiyonda (adım 3.2) meydana sindirim ve bağlanması için izin verir. </li><li> DH5a E. 10 ul Transform (- 3.2.2 3.2.1) reaksiyon 1 ul E. coli hücreleri. </li><li> 100 ug / ml ampisilin içinde büyütülmüş ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe bir lizojeni etsuyu (LB) agar plakası üzerine levha. </li></ol></li><li> 3 koloni ve mini-hazırlık kültürünü aşılamak - 2 seçin. <ol><li> Her numune için mini hazırlık yapın ve bir U6 promotör ileri primer kullanarak her koloniyi sırası: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Bu arepresentative dizileme primeri; Diğer yandan kuşatan primerleri kullanılabilir. </li></ol></li><li> Bir dizi-doğrulanmış koloni seçin ve bir maxi-hazırlık kültürünü aşılamak. Hazırlık boyutu gerekli DNA getiriye dayanan ölçekli olabilir. </li><li> Her CRISPR / Cas9 yapı için maxi-hazırlık yapın. </li></ol> 4. İlgi Hücreleri içine CRISPRs transfecting NOT: Bu protokol elektroporasyon 27 ile CRISPR / Cas9 Plazmidlerin teslim içerir. Bu protokol, murine erythroieukemia (MEL) hücrelerinin, bir süspansiyon, bir hücre hattı için detaylı olarak tarif edilmektedir. her adımda kültür ortamı, MEL hücreleri için kullanılan% 2 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içermektedir. Bununla birlikte, CRISPR / Cas9 plasmidlerin geçici transfeksiyon başarı, her hücre türü için tercih edilen kültür koşulları ve transfeksiyon stratejileri kullanılarak çok sayıda hücre tiplerine adapte edilebilir. MEL hücreleri süspansiyon hücreleri, yapışan hücreler saat talimatlar ikenave de dahil edilmiştir. <ol><li> CRISPR çift başına 2 x 10 6 hücre vardır emin olun. Elektroporasyon çözeltisi 100 ul 2 x 10 6 hücre yeniden süspanse edin ve elektroporasyon küvetine ilave edin. <ol><li> Her CRISPR / Cas9 yapı (10 ug toplam) 5 mikrogram ekleyin. GFP tanımı yapısının 0.5 ug ekleyin. </li></ol></li><li> Bir elektro-sistemi kullanılarak bir 2 mm bir küvete 5 ms 250 volt ile elektroporasyona hücreleri. NOT: Alternatif olarak katyonik lipozom-tabanlı transfeksiyon gibi başka transfeksiyon yöntemi kullanın. Genom düzenleme başlamadan önce sağlam plazmid teslimini sağlamak için bir raportör yapı ile her hücre hattı için transfeksiyon koşullarını optimize. </li><li> Hemen elektroporasyon sonra kültür ortamı, 1 ml olarak küvet çözeltinin aktarın. Hücre canlılığını artırmak için ortama elektroporasyon ve çözüm aktarılması arasındaki süreyi en aza indirmek. </li><li> 72 saat - 24 ila 37 ° C - 30 C&#39;de inkübe edilir. Genomu artırabilir 30 ° Cverim düzenleme, ancak 37 ° C kabul edilebilir. </li></ol> Transfekte edilmiş hücrelerin (FACS) 5. flöresanla aktive edilen hücre <ol><li> FACS tüpü içine, bir 50 um filtre üzerinden filtreleyerek FACS Hücrelerden hazırlayın. </li><li> FACS CRISPR yüksek düzeyde alınan hücrelerin zenginleştirmek için GFP pozitif hücrelerin 3 ~ üst% sıralamak / Cas9 oluşturur. </li><li> Tek tek ayırıcıyla 96 gözlü yuvarlak tabanlı plakalara veya 96 oyuklu yuvarlak dipli levha 30 hücre sınırlayıcı seyreltme kullanılarak plaka kriteri hücreleri. Önce güvenilir bir şekilde 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 30 hücreleri elde etmek için bu işlemi gerçekleştirmek için sınırlayıcı seyreltme kullanılan hücre tipi kaplama duruma getirin. </li><li> Hücre kültür ortamı, oyuk başına 100 ul içerir. </li><li> Kaplama değil kalan sıralanmış hücreler (&quot;toplu&quot;) için, gelecekteki kaplama için hücrelerin yarısı dondurma. Tarama ve astar doğrulama için diğer yarısını Plate (adım 6). NOT: Bu protocol süspansiyon hücreleri için. Tek tek hücre elde edilen klonlar toplanır, düz tabanlı 96 oyuklu plakaya taşınır, böylece yapışık hücreler 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki ya da düşük bir konsantrasyonda 10 cm&#39;lik bir tabak içinde, bireysel hücrelerin büyümesine ya. </li><li> 7 gün klon 7 37 ° C&#39;de inkübe izin - - 14 gün dökme hücreleri 3 ila 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu kez kullanılan hücre hattının iki katına zamana bağlı olarak değişir. NOT: Bu inkübasyon süresi PCR ile amaçlanan silinmesi için genomik DNA (gDNA) tarama için yeterli hücre çoğalması (adımlarını 6.1 ve 7.1) için izin verir. konsantrasyon aştığında toplu hücreler yeteri kadar 100,000 hücre / ml ya da yapışık hücreler için ~ çoğaldı, hücreler,% 80 izdiham ulaşmıştır. klonlar yeterince ~ 2 mm çapında bir kez makroskopik görünür çoğaldı. </li></ol> 6. Primer Doğrulama ve CRISPR için tarama / Cas9-aracılı Silme <ol><li> DNA ekstraksiyon çözeltisi 50 ul ebeveyn ve toplu hücre pelletleri resuspending ebeveyn ve toplu sıralanmış hücrelerden gDNA ayırın. Not: hücre sayıları geniş bir kabul edilebilir olsa da, genel olarak, 100,000 hücre, DNA izolasyonu için kullanılmıştır. toplu sıralanmış hücreler sgRNA-A ve sgRNA-B maruz kalan bir poliklonal nüfusun oluşmaktadır (adım 5). Aşağıdaki PCR amacı primerleri doğrulamak ve amaçlanan genomik silme varlığını doğrulamak için. </li><li> Thermocycler örnek çalıştırın ve aşağıdaki programı çalıştırmak: 65 ° C, 6 dakika için 98 ° C sıcaklıkta 2 dakika boyunca gDNA çıkartma özelliğine sahiptir. DNA konsantrasyonu ölçün. Not: adım 6.1 ve 6.2 DNA ekstraksiyonu için etkili bir yöntem varken, genomik DNA izolasyonu için bir yöntem, adım 6.3 PCR yapabilmek için kullanılabilir. </li><li> 10 _ (10 ul 2x PCR karışımı, 0.5 ul ileri astar: Aşağıdaki bileşenler ile 20 ul PCR birleştirin6 M), 0.5 ul ters primer (10 uM), 50-100 ng gDNA ve 20 ul kadar H2O. Yukarıda adım 2&#39;de tasarlanmış primerleri kullanın. Ayrı reaksiyonlarda &quot;olmayan silme grubu&quot; ve &quot;silme bant&quot; için PCR yürütün. Not: Çok sayıda polimerazlar Aşama 6.3 için de kullanılabilir. <ol><li> 10 dakika boyunca, 15 dakika boyunca 95 ° C (30 saniye, 1 dakika için 60 ° C, 1 dakika için 72 ° C, 95 ° C) 35 döngü ve 72 ° C: aşağıdaki parametreler kullanılarak bir PCR başlat örnekleri . Toplu sıralanmış hücreler test dayalı tasarlanmış her primer çifti için PCR koşulları optimize. </li></ol></li><li> 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu kullanılarak 10 V / cm,% 2 agaroz jeli üzerinde örnekleri çalıştırın. </li><li> Olmayan silinmesi ve silme bantları (Şekil 2) varlığı / yokluğu örnekleri inceleyin. Çoklama &quot;silme&quot; ve &quot;non-silme&quot; tek bir reaksiyonda PCR primer çiftleri düşünün. Çoğullama Optimizebir poliklonal nüfus bireysel klonlar tarama önce (yani, toplu hücreleri sıralanır). Bu silme ve non-silme amplikonlar kolayca çoğullama için bir agaroz jel üzerinde çözülmesi çok önemlidir. </li></ol> 7. Eleme CRISPR / Delesyonlar ve Klon Seçimi Cas9 Klonlar <ol><li> Süspansiyon hücreleri için, daha önce 150 ul bir son hacim için oyuk başına 50 ul hücre kültür ortamı ihtiva eden bir tek 96-yuvalı plakanın tüm klonlar aktarın. Bu, bir çok kanallı pipet adım 7&#39;de adımların geri kalan kısmı için kullanılmak üzere izin vererek tarama kolaylaştırır. <ol><li> Her transfer 50 ul de çok kanallı bir pipet kullanılarak 96 çukurlu bir PCR levhasına (her bir oyuğa 100 ul bırakarak). </li><li> 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de Santrifüj PCR plaka ve bir lavabonun üzerinde PCR plaka hafifçe vurarak süpernatant kaldırmak. Oyuk ve tekrar süspansiyon başına DNA ekstraksiyon çözeltisinin 50 ul ekle. Süspansiyon hücreleri için 7.3 adıma devam edin. </li&gt; </ol></li><li> Yapışık hücreler, aspirat medya için. Bir klon mevcut olan her bir kuyucuğa% 0.05 tripsin-EDTA 20 ul ekle. <ol><li> Medya 200 ul süspanse hücreleri. Pipet hücreleri ayırmak için karıştırın. </li><li> Iki ayrı 96-gözlü düz tabanlı plakalarda her bir ul Levha 100. Klon büyümek ve silme işlemleri için her bir klon taranması için diğer levha kullanmak için izin vermek için, bir plaka tutun. </li><li> 200 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa ilave 100 ul ekle. Hücrelerin büyümesine izin 72 saat - 24 bekleyin. </li><li> Aspire medya. 96-PCR plaka iyi, tekrar süspansiyon ve transfer başına 50 ul DNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. 7.3 adıma devam edin. </li></ol></li><li> Klonlardan gDNA ekstrakte edin. Thermocycler Örnek çalıştırın: 6 dakika boyunca 65 ° C ve 2 dakika gDNA elde etmek için 98 ° C. </li><li> PCR primerleri, ve dökme hücrelerinde optimum reaksiyon koşulları aynı kullanarak her bir klon Ekran (adım 6). </li><li> Klonlar iDEN seçinİstenen silinmesi ile saptandı ve büyüme için daha büyük bir levha ya da şişeye hareket eder. </li></ol> Bialelik Silme Klonların 8. Doğrulama <ol><li> Elde edilen klonlar karakterize başarılı bir nakavt doğrulamak için DNA doğru klonlar aynı zamanda RNA ve / veya protein seviyelerini değerlendirmek. <ol><li> Bir plasmid vektörüne (bir PCR klonlama kiti ile, örneğin,) amplikonları, DNA değerlendirmek, bir düzeltme okuması polimeraz ile bialelik silme klonlarından silme bantları amplifiye ve klonlanması için. DH5a E. plazmidi Dönüşümü İlgili bir antibiyotik ile LB agar kaplan üzerine coli hücreleri ve plaka. Birden koloniler, mini hazırlık her biri seçin ve her silme alel 28 karakterize etmek Sanger dizileme her klonu maruz - 30. Başlangıç ​​ekranında sonra silinmek üzere PCR testi tekrarlamak doğru klon seçilir ve sonuçların tekrarlanabilirliği kalmasını sağlar. </li><li> RNA değerlendirmek için, gen RT-qPCR gerçekleştirmekİlgili gen 30,31 e ifadesi. </li><li> Protein değerlendirmek için, ilgili protein 33 karşı bir antikor kullanılarak bir bağışıklık gerçekleştirir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+(CRISPRi)+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Genomic+Deletion+Efficiency+Mediated+by+CRISPR/Cas9+in+Mammalian+Cells.">Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li><li>Xiao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+deletions+and+inversions+mediated+by+TALENs+and+CRISPR/Cas+in+zebrafish.">Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9+mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. , (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Gene-Modified+Cynomolgus+Monkey+via+Cas9/RNA-Mediated+Gene+Targeting+in+One-Cell+Embryos.">Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Xie, K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR-Cas+system.">RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system.</a> Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).</li><li>Waaijers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).</li><li>Bassett, A. R., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+and+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila.</a> Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+Intestinal+Stem+Cell+Organoids+of+Cystic+Fibrosis+Patients.">Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+Genetic+Disease+in+Mouse+via+Use+of+CRISPR-Cas9.">Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).</li><li>Lappalainen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+genome+sequencing+uncovers+functional+variation+in+humans.">Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans.</a> Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).</li><li>Bauer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Erythroid+Enhancer+of+BCL11A+Subject+to+Genetic+Variation+Determines+Fetal+Hemoglobin+Level.">An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level.</a> Science. 342 (6155), 253-257 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3, e3647 (2008).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+PCR+products.">Molecular cloning of PCR products.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Detection+in+Prostate+Tumors+by+Quantitative+Real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR).</a> J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).</li><li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Human+Vestibular+Schwannomas.">Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas.</a> J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>McVey, M., Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMEJ+repair+of+double-strand+breaks+(director&#8217;s+cut):+deleted+sequences+and+alternative+endings.">MMEJ repair of double-strand breaks (director&#8217;s cut): deleted sequences and alternative endings.</a> Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. , (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).</li><li>Alem&#225;n, L. M., Doench, J., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Comparison+of+siRNA-induced+off-target+RNA+and+protein+effects.">a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects.</a> RNA. 13 (3), 385-395 (2007).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity+Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity.">Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity.</a> RNA. 14, 853-861 (2008).</li><li>Marine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+seed+analysis+to+identify+off-target+effects+in+siRNA+screens.">Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).</li></ol>

We have no conflicts of interest related to this report.

CRISPR / Cas9 sistem çeşitli boyutlarda genomik silme oluşturmak için kullanılabilir. Biz silme sıklığı amaçlanan silme boyutuna göre ters orantılı olarak değişir görülmektedir rağmen, rutin birden bialelik silinmiş klonları elde 100 kb varan 1 Mb silmeler ve silmeleri kurtarmak mümkün olmuştur. Bir hücre hattı, sırasıyla sokulması silmeleri verim kaybı gözlemlenmiştir. Bu strateji, bir çok gen ve elemanlar arasında birleştirici silme oluşturulması için kullanılabilir. bialelik silme klonları elde süreci bialelik silinmesi 12 klonların istenen sayısını elde etmek için silme boyutuna göre ekranlı gereken klonların az sayıda tahmin edilerek hızlandırılmış olabilir. olasılık dağılımına bialelik silinmesi yokluğu ile monoallelik silme elde yeteneği fonksiyonunun tamamen kaybı ile ilişkili hücre öldürücü gösterebilir. Düşük frequency veya yok silmeler zayıf transfeksiyon, verimsiz sgRNAs veya (nedeniyle bir pozitif kontrol eksikliği silinmesi için ekran PCR primerleri doğrulamak için) verimsiz PCR primerleri tarama dahil bir dizi senaryoyu yansıtıyor olabilir. GFP + hücreler transfeksiyon verimliliği (adım 5.2) için bir vekil olarak kullanılabilir, böylece, GFP + hücrelerinde bir azalma muhtemelen zayıf transfeksiyon yansıtır ve husule gelen silme etkinliği azalmıştır. Verimsiz sgRNA için kontrol yardımcı olabilir bağımsız tarama primerleri ile iki farklı sgRNA çiftleri kullanılarak ve PCR primerleri tarama ve bialelik silme klonları elde şansını maksimize. GFP + hücreler için sıralama Hücre silme allelleri için zenginleştirir. Bu adım, ihmal edilebilir olsa da, ihmal muhtemelen monoallelik veya bialelik silme olan tespit etmek daha fazla klonun taranması gerektirecektir. Transfeksiyon verimliliği optimize edilebilir olduğu ölçüde, biz genom düzenleme verimliliği gelişmiş olması beklenir. <p ckız = &quot;jove_content&quot; hedef bölgelerde indellerin çeşitli alellerin bir dizi silme ve yerel onarım sonucunu altında yatan&gt; NHEJ olaylar. 10 bp&#39;lik girmeler ya da daha yaygın olarak sgRNA yönelik bölünme (Şekil 2B) yerinde kromozom anormallikleri - baskın sonuç küçük ~ 1. Genellikle bu aleller microhomology dayalı onarım 34,35 sonucu gibi görünmektedir. Biz tarif PCR bazlı saptama stratejisi daha büyük veya daha karmaşık bir ekleme, delesyon, evirtme ve yeniden düzenlemeler tespit etmeyeceği hususu not edilmelidir. Bu olaylar daha az yaygın olmasına rağmen, biz ne silme ne de olmayan silme amplikonlar tespit edilebileceği klonları gözlenen ve daha fazla araştırma üzerine bu daha karmaşık sonuçlar yansıtmaktadır var. Biz geniş CRISPR / monoallelik ve non-silme klonları olmayan silme allel &quot;yara izi&quot; Cas9-aracılı gözlemledik (Şekil 2B bakınız). Bu &quot;izleri&quot; oluşuristenen silme olmadan sgRNA bölünme yerinde üretilen küçük indeller (yani, sgRNAs A ve B arasındaki müdahalede segmentin silinmesi). Bu yara izleri genellikle sgRNA hedef tanıma kesme. Bu nedenle daha önce aynı sgRNAs kullanarak sgRNAs maruz kalan hücrelerde allellerini yeniden hedefleme dikkatli çağırıyorum. Benzersiz sgRNA kullanmak istiyorum bir daha başarılı yeniden hedefleme stratejisi önce &quot;yaralı&quot; tanıma sitelerinden farklı dizileri. Durumlarda sgRNAs bir çift (Şekil 1B, alt), çerçeve kayması alleller da silme yokluğunda üretilebilir egzonik dizileri algıladığında. Bu nedenle, monoallelik silme klonları nedeniyle alel 12 olmayan silinmiş üzerine frameshift mutasyonların yüksek frekans kaybı fonksiyon-zenginleştirilmiş olabilir. 38 - CRISPR / Cas9 sistemi ile Tek endişe hedef dışı etkileri, yani, istenmeyen sitelere 36 de genomik değişiklik. Recent raporları 17 ile kısa kılavuz RNA&#39;lar ileri sürmüşlerdir - 19 nükleotid CRISPR sıklığını azaltabilir / off-hedef etkilerini 39 Cas9 tabanlı. Buna ek olarak, bir nickase hedef bölge başına iki kılavuz kullanılarak çift-çentikleme stratejisi hedef dışı etkiler 7 en aza DSBs oluşturmak için de kullanılabilir. Seçenek olarak ise, RNAi kullanılan stratejilere benzer biz örtüşmeyen protospacer dizileriyle sgRNAs farklı çiftlerinin hedef dışı bir potansiyele karşı gözlenen fenotipin üzerinde hedef CRISPR / Cas9 modifikasyonu sonucu olduğunu göstermek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir etkisi. Uygun bir yaklaşım, tarama primerler (adım 2), tek bir dizi çoklu sgRNA çifti (Şekil 1A) için de kullanılabilir, böylece en az iki bitişik, fakat örtüşmeyen sgRNA çiftleri tasarım olacaktır. Ayrıca, eksik dizisi ve / veya bozulmuş geni reintroducing bir silme hücre hattı tamamlayan arasında nedensel bir ilişki kanıtlamak olabilirBelirli bir genomik silme ve fenotip. Hücresel model sistemler ile çalışan biyologlar için, RNAi fonksiyonel genomik için güçlü bir araç temsil etmiştir. 42 - Ancak, bu yaklaşımın sınırlamalar hedef mRNA transkript düzeylerinde azalma eksik, aynı geni hedef bağımsız reaktiflerin etkisinin heterojenitesini ve tohum bazlı olmayan tohum etkileri 40 olmak üzere bilinen off-hedef etkilerini dahil ettik. Genom düzenleme stratejileri bu endişelerin çoğu ele veriyorum ve muhtemel genetik pertürbasyon 8,36,37 için heyecan verici, tamamlayıcı bir yaklaşım temsil eder. Ayrıca, genom düzenleme RNAi mümkün geleneksel hedeflemenin zor bir şekilde genetik elemanları kodlayıcı olmayan 25 yaklaşır çalışması için izin verir. Biz üretmek ve zarar fonksiyon-alellerini karakterize için sağlam ve özel bir yöntemi olarak CRISPR / Cas9 tarafından genomik silme nesil teşvik.

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1&#8211;3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate &#8220;nicking&#8221; or transcriptional regulation respectively7&#8211;9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12&#8211;14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17&#8211;21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:388px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pSpCas9(BB) (pX330)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX Solution and 2mm Cuvettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP Plasmid</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq PCR Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zero Blunt PCR Cloning Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2700-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Bu deneyin amacı, MEL hücreleri pim1 silme oldu. Birden örtüşmeyen sgRNA çiftleri (yani, bağımsız protospacer dizileri) kullanılması hedef dışı etkileri (Şekil 1A) kontrol etmek için yararlı olabilir. Tutarlı fenotip birden fazla bağımsız protospacer dizileri tarafından paylaşılan ortak bir off-hedef etkisine karşı bir on-hedef etkisinden kaynaklandığı daha muhtemel olacaktır. Her bir çift benzersiz silme kesme üretimine neden olacaktır. (Yani, n, ~ 150 bp&#39;lik daha az) birbirine yakın olduğunda, aynı tarama primerleri sgRNAs her bir grubu tarafından üretilen silme tespit etmek için kullanılabilir. Genomik silme geninin (Şekil 1B) göre çeşitli konumlarda sgRNA çiftleri kullanılarak genleri bozabilir. Örneğin, sgRNA çifti tüm gen vücudun silinmesi için bir gen kanadına olabilir; çifti frameshift indellerin yaratma potansiyeli olan, iki ekson içinde yer olabilir bile bir veya her iki alleles silinmez değil; veya çift bir özel izoformuna bozulmasını sağlamak için belirli bir ekson kanadına olabilir. PIM1 için kullanılan silme stratejisi, tüm gen vücudu, bir 8 kb silme (Şekil 2) silmek için sgRNAs yan tasarım oldu. Bu strateji, bağlı pim1 geninin nispeten küçük kısmen seçildi. Bu örnek alt (Crick) iplik üzerinde üst (Watson) iplik ve bir PAM üzerindeki bir PAM (yeşil) gösterir; Ancak, DSB üst veya alt sarmalına PAM dizisi yerelleştirme bağımsızdır. sgRNA çifti alt kolundaki üst şeridi üzerinde de hem PAM dizilerine sahip, ya da her biri olabilir. Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, iki sgRNA tasarlanmış pX330 sentezleme vektörü içine klonlanmış ve bir GFP raportör (Şekil 2A) ile birlikte elektroporasyon vasıtasıyla MEL hücreleri teslim edildi. GFP + hücrelerin üst% 3, iki gün sonrası elektroporasyon sıralanır ve sınırlayıcı seyreltme de klonal kaplanmıştır. EkranŞekil 2&#39;de gösterildiği gibi, ing primerleri aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi tasarlanmış ve edildi. PCR koşulları ebeveyn MEL hücreleri ve &quot;dökme&quot; kriteri hücrelerinden izole gDNA kullanılarak optimum hale getirilir. 10 gün sonra kaplama, gDNA tüm klonlar izole edildi ve olmayan silme (ND) ve silme (D) amplikonlar kalıpları göre olmayan silme, monoallelik ve bialelik silme klonları tespit PCR yoluyla silinmesi için taranmıştır (Şekil 3) . Sigara silme klonları olmayan silme amplikon varlığını ve silme amplikonun eksikliğine sahip olarak tanımlanmıştır. Monoallelik klonlar olmayan silinmesi ve silme amplikonlarının hem varlığını sahip olarak tespit edilmiştir. Bialelik klonlar olmayan silme amplikon olmaması ve silme amplikon varlığını sahip olarak tanımlandı. Bu silme için, 400 klon tarandı 126 monoallelik silme klonları ve 32 bialelik silme işleminin tespit hangi<html> iyon klonlar (o silme frekans silme boyutu 12 ile değişir unutmayın önemlidir). Bialelik silme klon seçildi ve ortam 8 ml tüpler taşınmıştır. Genişleme için 5 gün bırakıldıktan sonra, her bir klon bialelik silme ve silme amplikonlar tam silme (Şekil 2B) tespit etmek Sanger dizileme tabi tutuldu onaylamak için gDNA&#39;sından PCR ile yeniden test edildi. Silme amplikonlarının içinde Heterojenite kusurlu Indel oluşturan NHEJ onarım yansıtır. Olguların çoğunluğunda indeller ortaya monoallelelic eksiltme klonu olmayan silme alel dizilenmesi, monoallelik ve bialelik silme klonları her ikisi de gerekli olduğu uygulamalar için önemli olabilir, hatta silinmemiş alel sık CRISPR / Cas9 tarafından düzenlendi olduğunu gösteren . RNA, bialelik bir silme klonları izole edilir ve (Şekil 4) pim1 ifade kaybı teyit etmek için RT-qPCR ile analiz edilmiştir. yolları &quot;&gt; <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52118/52118fig1highres.jpg" /> Olası silme stratejilerinin Şekil 1. şematik. (A) genomik silmeler için iki örnek sgRNA çiftleri (sırasıyla, siyah ve turuncu gösterilmiştir). mavi oklar olmayan silme Amplikon&#39;u tespit primerleri gösterir ve kırmızı oklar silme Amplikon&#39;u tespit primerleri göstermektedir. sgRNA 17 pozisyonları ve 18 kırmızı ve mavi vurgulanır sgRNA Siteleri-A 1 / A 2 ve pozisyonları 17 arasında tahmin Cas9 bölünme gösteren kırmızı bir çizgi ile sgRNA-Siteleri-B 1 / B 2 mor ve turuncu vurgulanır ve 18. (B) CRISPR yönelik bölünmelerin dikey siyah çizgiler olarak gösterilmiştir. mavi oklar olmayan silme Amplikon&#39;u tespit primerleri gösterir ve kırmızı oklar silme Amplikon&#39;u tespit primerleri göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig1large.jpg" target="_blank">görüntülemek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonu. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52118/52118fig2highres.jpg" /> Şekil üretmek ve dizi silme olmayan silme allel de dahil olmak üzere pim1 silinmesini tespit 2. Stratejisi. PCR bazlı tarama stratejisi (A) şematik pim1 silme klonları tanımlamak için. Bir primer çifti silme (mavi oklar) ve bir primer çifti iç bulunduğu silme (kırmızı oklar) dış lokalize. sgRNA dizileri (protospacer dizileri) mor gösterilmiştir. Dikey kırmızı çizgiler pozisyonlarda 17 ve sgRNA dizisinin 18 arasında tahmin Cas9 bölünme gösterir. (B) Sanger dizileme sgRNA tanıma yerinde Indel oluşumunu ortaya koymaktadır. sgRNA dizileri yeşil, mor ve PAM dizileri gösterilmiştir. Silme olaylar shçizgi işaretleri ve eklemeler eşdeğer sayısına göre kendi mavi vurgulanır. Dikey kırmızı çizgiler pozisyonları 17 ve sgRNA ve 18 arasında., Bölünme siteyi tahmin göstermektedir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52118/52118fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Dışı silme, monoallelik ve bialelik klonlar belirlenmesi Temsilcisi jel. Her klon için, sol şeritte olmayan silme amplikon (mavi &quot;ND&quot;) ve sağ şeritte temsil kırmızı silme amplikon (&quot;D&quot; temsil ). Tekli klonlar, noktalı çizgilerle ayrılır. Üç monoallelik silme klonları klonlar 5, 6, ve sıralama verileri de görüldüğü gibi 2. Üç bialelik silme klonları c silme bant klon 15, 17, ve 13 olarak<html> yalnız 13 silme kavşakta büyük silmeleri nedeniyle küçük bir boyutu vardır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52118/52118fig4highres.jpg" /> Bialelik silme klonlarında pim1 ifade Şekil 4. kaybı. Pim1 sentezleme RT-qPCR iki bialelik eksiltme klonu için hesaplanmıştır. ACt yöntemi - Veri 2 kullanarak GAPDH normalize edildi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Protospacer Sekans </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tablo PIM1 silinmesi için iki sgRNA 1. 20-mer protospacer dizileri. 543 &quot;&gt; <tbody><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:101px;"></td><td style="width:443px;"> Protospacer Sekans ters tamamlayıcı </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tablo 1 iki sgRNA için protospacer dizilerinin Tablo 2. Ters tamamlayıcısı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Diziler </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Protospacer sekansları ve bunların tersine &quot;OAKK&quot; ve &quot;AAAC&quot; ile tamamlar BbsI sınırlandırıcı enzim kullanılarak pX330 vektörü içine klonlamak için ilave edildi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Diziler </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> PX330 vektörü U6 promoterinden Tablo 4. sgRNA sentezleme OAKK dizisinden sonra ve daha önce G nükleotidin ilavesi ile arttırılır20-mer., Bir ekstra G nükleotidin eklenmesi ters tamamlayıcı oligo 3 &#39;ucunda (örn sgRNA-A) C nükleotidin eklenmesini gerektirir. 20-mer (protospacer dizisi) birinci pozisyonunda zaten G nükleotidi olduğu, ancak, başka bir G eklemeye gerek yoktur (ör sgRNA-B) ve ters tamamlayıcı son konumuna C eklemeye gerek oligo.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

generation-of-genomic-deletions-in-mammalian-cell-lines-via-crisprcas9

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

94.9K Görüntüleme.  Harvard Medical School. CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Video: Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Biyoloji

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β aracılı Endotelden Mezenkimal Geçişe (EndMT) ve CRISPR/Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak EndMT Efektörlerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9 Teknolojisi Kullanılarak Göçmen Locust'un Homozigot Mutantlarının İnşası

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...