MRC-FAP hibe kodu G1000788-98812 - Yazarlar bu araştırmayı finanse Tıbbi Araştırma Konseyi teşekkür ve kabul etmek istiyorum.

1.Scaffold İmalat ve Sterilizasyon <ol><li> % 10 ağırlık / hacim konsantrasyonu vermek üzere, 1,1,1,3,3,3-heksaflorizopropanol içinde PCL eritin. . Polimer çözeltisi (parametreler: 20 kV, 1 ml / saat olduğu, 20 cm) electrospin Bosworth ve arkadaşları, 9 içinde tarif edildiği gibi, ve dönen bir mandrel (600 rpm) kenarında lifleri hizalanmış toplamak. (Olukları ve döner gemiler için) 3 cm ve uzunlukları (hücre kültürü ekler için) 4 cm - bir neşter ile kısa uzunluklarda kesilmiş sonra toplanan lif şeridi çıkarın ve. </li><li> İnce forseps distile su bireysel şeritleri batığın ve kaldırmak kullanma. </li><li> Başparmak ve işaret parmağı arasında iki ucunu tutan; bu konuyu benzer kadar elle şeridi bükün. </li><li> Kısaca distile su içinde bu ipliksi iskele batığın ve kurulamak için temiz, lifli olmayan kartta yer. </li><li> Kuruduktan sonra, ayrı ayrı temiz mikrosantrifüj tüpleri içine yerleştirildi ve damıtılmış su içinde% 50 h / h etanol 1 ml. Kapakları kapatın ve 2 bırakın4 saat. Not: laminer akış altında aşağıdaki adımları uygulayın: </li><li> Bir düzgün akış kabininde mikrosantrifüj tüpleri ve% 50 hacim / hacim çözeltisi aspire. Damıtılmış su, yakın kapakların 1 ml% 70 h / h etanol ile değiştirin ve 24 saat bırakın. </li><li> % 90 ve damıtılmış su (1 mi hacim) içinde% 100 h / h etanol için tekrarlayın. </li><li> Yıkama fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS), yıkama başına 24 saat (2 x 1 mi) ile iki kez iskeleleri. </li><li> PBS çıkarın ve 1 ml hücre kültür ortamı ile değiştirin. Not: iskeleleri kullanım sonrası 24 saat için hazırdır. </li></ol> 2. İskele Yüzey Alanı ve Hücre Sayısını Belirleme <ol><li> Bir ışık mikroskobu ve görüntü programı kullanarak, bir ortalama değeri tespit etmek uzunluğu boyunca electrospun ipliğin çapı ölçülür. </li><li> Silindirik bir çubuk olması ve kullanarak yüzey alanını yaklaştığı iplik varsayalım: </li><li> Nerede A = Yüzey alanı, r = yarıçap ve h = uzunluk Not: Yüzey alanı 18902 olduğu hesaplandı800 mikron 2. Bundan başka, iplik yüzey alanını arttıracağı ince liflerin, yüzlerce oluşan fiili yüzey alanı Bu hesaplama daha büyük olacağı belirtilmelidir. Bu nedenle daha büyük bir hücre sayısı iskele eklemek gerekir. Bununla birlikte, bu test grupları arasında doğrudan bir karşılaştırma yapılmaktadır etkilemez. </li><li> Tarafından maruz iskele yüzeyine eklemek olabilir hücrelerin sayısını belirleyin: Not: bir ışık mikroskobu ve görüntü yazılımı kullanılarak, insan mezenkimal kök hücrelerin çapı belirlenmiştir 20 um (varsayarak hücreler yuvarlak), bu nedenle bu durumda, hücreler = 60200 sayısı. </li></ol> 3. İskele Ayar - Hücre Kültürü ekler (Şekil 1A) <ol><li> Laminer akış altında steril 6 oyuklu hücre kültürü ekler açık ve geniş bir halkalı gövdelerinden dişleri kısa halkaları ayırın. </li><li> Dişleri yukarı bakacak şekilde halka alın. Birini asmakyapma halkanın merkezi üzerinde 4 cm iskelelerinin emin iki tarafta çakışıyor. Dişli halkası ve iskele üzerinde halkalı vücut ve pozisyon almak ve iskele konumda kalır ve hücre kültürü ucun ortasından yatıyor emin aşağı doğru itin. </li><li> 6-çukurlu, düşük bağlanma plaka oyuğuna iskele hücre kültürü eki yerleştirin. </li><li> Iskele kültür ortamı 10 ml ilave edilir. </li></ol> 4. İskele Set-up - Oluk (Şekil 1B) <ol><li> Laminer akış altında yer poli (tetrafluoroetilen) (PTFE), ayrı ayrı petri çanaklarına oluklara ve çukur kültür ortamı 10 ml ekleyin. </li><li> Emin uzunluğu yaparak, forseps çukur içine 3 cm iskelelerinin birini asmak kullanarak teknenin uzun kenarına paralel yatıyor. </li></ol> 5. İskele Set-up - Biyoreaktör Gemi (Şekil 1C) <ol><li> Laminer akış altında, biyoreaktör gemi en yoluyla 10 ml steril PBS dağıtmakana limanı ve 10 dakika bekletin. </li><li> PBS çıkarın ve 8 ml kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> Forseps kullanarak, ana port üzerinden damar içine 3 cm iskelelerinin birini yerleştirin. </li><li> Ana limanı kapatmak. </li></ol> 6. Hücre Sayım <ol><li> Kadar hasat öncesinde geçit 4 üretici protokolüne göre kemik iliğinden elde edilen kültür, insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC). </li><li> 75 cm kemik iliği (geçit 4,% 80 kaynaşma) türetilen hMSCs içeren 2 şişeyi medya aspire. </li><li> 10 ml steril PBS ve aspirat hücreleri yıkayın. </li><li> 3 mi tripsin ilave edin ve hücreleri, kap yüzeyinden yerinden kadar 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde bir balon içinde inkübe edilir. </li><li> Enzimler inaktive edildi ve bir santrifüj tüpünün bu toplam hacmi (10 mi) aktarmak için 7 ml kültür ortamı eklenir. </li><li> Homojen içinde hücreleri dağıtmak için yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı bu hücre süspansiyonu yeniden süspanseMedya ve sınır hücre topaklar (10 ml pipet). </li><li> Bir haemocytometer hücre süspansiyonu ve transfer 20 ul çıkarın. </li><li> X10 objektif bir ışık mikroskobu ve görüntüsü altında haemositometre yerleştirin. </li><li> Kılavuz çizgilerini Odak ve ızgara her köşesinde 4 x 4 kareler hücrelerin sayısını ve hangi meydanın giren ve sağ elini veya alt sınır çizgisini olanlar. 4 x 4 kareler (ızgara başına 4 sayımları) her set için güvenin. </li><li> Tabanda ve hücre alınma sayısı üç kez (6,6-6,9 adımları) tekrarlayın. </li><li> Ortalama hücre sayısını hesaplayın ve hücre tabanda (200 ul hücre konsantrasyonu 60.200) için gerekli ortamın hacmi belirlemek. Örneğin, hemositometrede ortalama hücre sayısını belirlemek ve daha sonra üç ayrı sayıları hücrelerin genel ortalama sayısını belirlemek. Vermek hücre süspansiyonu, toplam hacmi ile çarpın sonra mi başına hücre sayısı ve elde 1 x 10 4 ile çarpınHücrelerin tal sayısı. Tabanda için gerekli ortamın hacmini belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: </li><li> 5 dakika boyunca 241 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. </li></ol> 7. Hücre Tohumculuk <ol><li> Hücre topaklarını bırakarak santrifüj tüpten ortamı aspire ve hesaplanan ortam hacmi ile değiştirin. </li><li> Hatta karıştırmak bir için hücreleri ve medya yeniden süspanse. </li><li> P200 Gilson pipet kullanarak yavaş yavaş iskele boyunca ve ortam sıvı yüzeyinin altında pipet ucu çalıştırarak her bir yapı iskelesi üzerinde hücre süspansiyonu 200 ul dağıtmak. 20 dakika boyunca rahatsız edilmeden bekleme. </li><li> Biyoreaktör gemileri için, ana bağlantı noktası üzerinden hücre süspansiyonu 200 ul dağıtmak. Şırınga portları üzerinden kontör kalan 2 ml kültür ortamı 10 ml toplam hacim vermek. </li></ol> 8. Deneysel Başlangıç <ol><li> RCCS-4DQ biyoreaktöre biyoreaktör gemileri aktarın ve 9 rpm&#39;de döndürmek için ayarlayın. </li><li> Trançalkalama plakası, hücre kültürü ekler ve çukurları kuyucuğu Sfer ve 30 rpm&#39;de dönmek üzere. </li><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 (statik kültür) ayarlanmış bir hücre kuluçka makinesi içinde rafa hücre kültürü ekler ve çukurları kuyucuğu aktarın. </li></ol> 9. DNA&#39;nın Deneyi <ol><li> Lizis tamponu, 1x TE tampon, DNA standartları ve hücre DNA çalışma çözümü - - üreticinin talimatlarına göre çözüm hazırlayın. </li><li> 4 saat sonra, kuluçka örnekleri çıkarın ve laminer akış altında yerleştirin. </li><li> Tüm örneklerde medya fraksiyonları çıkarın ve ayrı etiketli santrifüj tüpleri yerleştirmek. Tüpleri 241 xg santrifüj. Süpernatantı ve 3 ml lizis tamponu ekleyin. Kırmak üzere hücre pelleti çözeltisi tekrar. </li><li> Forseps biyoreaktör gemiler içinde iskeleleri için 3 ml lizis tamponu içeren (santrifüj tüplerine iskeleleri ve yer kaldırmak kullanarak, önce beni aspire için iskele kaldırmakdia). Hücre kültürü ekler içinde yapılacak iskeleler için, ilk olarak bir neşter kullanılarak geçmenin kenarına yakın iskele keserek iskele ücretsiz. </li><li> Her iskele yuvasına lizis tamponu 3 ml ekleyin ve yüzeyi kazıyın (şiddetle biyoreaktör gemiler için ajitasyon). Liziz tamponunu çıkarın ve ayrı bir şekilde etiketlenmiştir santrifüj tüpleri içinde yer. </li><li> Vorteks yaklaşık olarak 1 dakika boyunca, her santrifüj tüpü hücrelerinin yeterli ajitasyon temin ve tampon ve hücre membranı parçalanma teşvik etmek için. </li><li> Iskele, ortam ve de (çift) - siyah 96 oyuklu bir plaka içerisinde, her bir numune kısmıyla liziz tamponu içinde 100 ul ilave edin. </li><li> Karanlıkta, liziz tamponu içeren bütün yuvalara hücre, DNA çözeltisinin 100 ul ve hafifçe karıştırın. </li><li> Plaka bir negatif ve pozitif kontrol temin etmek üzere herhangi bir DNA, ve hücre, DNA çözeltisi ihtiva eden liziz tamponu ile kuyu içerir. </li><li> Bir floresan plak okuyucu kullanarak, bir çukurun absorbansı ölçmek485 nm uyarma ve 520 nm emisyon ile s. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre DNA standartlarından oluşturulan standart eğri ile veri karşılaştırın. </li></ol> 10. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Sabitleme <ol><li> Laminer akış altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin: 4 saat sonra, yeni bir 6-plaka (ayrı kuyu) içindeki kapların ve yerden tüm iskeleleri kaldırmak. </li><li> PBS ile iki kez iskeleleri yıkayın. </li><li> Açık bankta aşağıdaki adımları uygulayın: Her iyi iskelenin tam kapsama sağlamak için PBS içinde% 1.5 v / v glutaraldehit 2 ml ekleyin. </li><li> Hücre tespiti için, 4 ° C&#39;de en az 30 dakika boyunca plaka bırakın. </li><li> Sabitleştirici çözüm çıkarın ve PBS ile iki kez iskeleleri yıkayın. </li><li> % 70 h / h,% 90 h, ardından% 50 v / v ile başlayan damıtılmış su içinde etanol, artan yoğunluklardaki iskeleleri dihidrat / h. Her bir konsantrasyon için, tamamen eriyik iskeleleri daldırılmasın, (2 mi) ve 3 dakika süre ile bırakın. Çözüm atın ve tekrarlayın. </li><li> Çözelti içinde tamamen iskelesi (2 mi) içine batırmak ve 5 dakika bırakılarak% 100 etanol içinde dehidre olmaktadır. Çözüm atın ve tekrarlayın. </li><li> Kimyasal bir duman dolap içinde heksametildisilazan kullanarak iskeleleri (HMDS) kurutun. HMDS&#39;nin iskeleleri (2 ml) daldırın ve 5 dakika bekletin. HMDS &#39;yi çıkartın ve tekrar. </li><li> HMDS &#39;yi çıkartın ve iskeleler kurumasını bekleyin. (Bu durumda yapışkan karbon sekmeleri ile paslanmaz çelik taslakları olarak) piyasada mevcut SEM taslakları üzerinde iskeleleri monte edin. </li><li> SEM içinde inceleyen kolaylaştırmak için, 2 dakika süreyle bir altın püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak ceket örnekleri ince ve hatta kapsama sağlamak. </li><li> Ve SEM içinde yerleştirin örnekleri 5 KeV elektron ışını kullanarak hücre numaralı seribaşı iskeleleri görselleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells.">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li><li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR's.">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426 (2012).</li><li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2/VEGF-A+signaling+pathway.">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li><li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li><li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds.">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li><li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering.">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li><li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair.">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li><li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds..">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds..</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li><li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular,+aligned,+and+contractile+blood+vessels.">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li><li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering:+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro.">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li><li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface.">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guan,+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase.">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li><li>Grant, D. S., Tashiro, K. -. I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro.">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li><li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+cell+seeding,+cultivation+parameters,+and+tissue+construct+characterization.">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biyopolimerlerden fabrikasyon electrospun elyaf matrisleri düzenli biyomateryali ve / veya doku mühendisliği uygulamaları 11,12 hücre eki ve çoğalmasını desteklemek için kullanılır. Bu durumda, matris kolayca bir hücre kültürü oyuklu plakanın bütün taban kapağı ve bu yüzden, hücre eki artırır tohumlanmış hücreleri ile tam temas halinde olan lif ince levhalar genellikle. Ancak, biyomalzeme iskele tamamen plaka tabanını kapsamaz ise, numaralı seribaşı hücrelerin büyük bir kısmı iskele ile temas halinde kalmak olmaz ve sonuçta eklemek mümkün olmayacak bir yüksek şans var. Bu çalışma, gelecekteki hücre bazlı deneyler için tavsiye edilebilir optimize edilmiş bir teknik belirlemek için, plaka tabanını örtmeyen iskeleler üzerine tohum hücreleri için çeşitli yöntemler araştırılmıştır. Beş farklı set-up (Şekil 1) araştırılmıştır: scaffoLDS (electrospun iplik), düşük bağlanma kuyu plakaları içinde hücre kültürü ekler kullanarak düzenlenen ve ya statik koşullar altında tutulan veya 30 rpm&#39;de çalkalandı; 30 rpm&#39;de dar PTFE olukları içinde yerleştirilir ve statik tutulan ya da sarsılmış iskeleleri; ve iskeleler 9 rpm&#39;de dönen biyoreaktör damarları içinde yer. Tüm tohumlama set-up (Şekil 2) için bağlantı düşük bir oranda bir DNA deneyi ile electrospun iplikler yapıştırılmış etmiş olan hücrelerin sayısı göstermişlerdir belirlenmesi; ve bu daha fazla elektron mikrograflannı (SEM) (Şekil 3) tarama teyit edildi. Greatest hücre eki - 30 veya% ~ 18.060 hücre hücre kültürü ekler içinde tutulan ve sürekli hareket maruz kalan iplikler için gözlenmiştir muydu. İlginç bir şekilde, en düşük hücre eki (% 15) radyal hareket dahil iskele ile temas hücreleri tutmak üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir olur hücre kültürü ekler tarafından tutulan statik şartlar altında tutulmuştur iplikler için elde edilmiştir. Bununla birlikte,bu medyanın akışının sürekli çevreleme SEM görüntüleri gözlenen hücre aglomeralarının sorumlu olabileceği unutulmamalıdır. Shaker plaka en düşük ayarda kuruldu - 30 rpm - Bu set-up bir sınırlama olabilir. Yavaş radyal hareket kullanma önlemek veya hücre aglomerasyonunu azaltmaya yardımcı olabilir ve hücreler daha az kuvvet yaşayacaksınız aynı zamanda hücre eki artırabilirsiniz. Gelecek deneyler gelişmiş hücre eki için ideal bir çalkalayıcı hızı optimize odaklanmalıdır. Her iki senaryolar% 18 eki (~ 10.836 hücreleri) elde olan, benzer bir eğilimin sonucu vermedi olukları içinde tutulan iplikler için hareket birleştirilerek; Bu olukları içinde iskelelerinin kısmi yüzdürme nedeniyle olabilir ama onlar tabanına tutturulmuş değil gibi (çalkalama plaka üzerine yerleştirilen olukları için gözlenen). Malzeme ve yapıştırma ile temas etmesini oluğun altına inmiştir herhangi hücrelerini engeller iskele kısmi dalgalı. TOnun özellikle set-up, çukur bir petri içinde muhafaza edildi ve medyanın toplam 10 ml hacminde ekledi. oluğun küçük boyutları ortam çoğunluğu petri kabı içinde mevcut olan herhangi bir hareketi olması durumunda, hücreler petri uzak çukur kayması ve skafoldun erişemeyeceği tamamen kalabilir anlamına gelir. Bu maruz kalan iskeleleri için kendi yüzmesini ve özellikle hareketi (önleyecek gerektiği gibi, bu sınırlamaları aşmak için, başka deneyler, iskelelerinin uçları steril ince iğneler kullanılarak olukları tabanına tutturulmuş sayede protokol, fazladan bir adım içermelidir sonuçta iskele ekleme hücrelerin sayısında artışa yol açacaktır radyal hareket). Hücrelerin% 16 döner gemiler içinde mevcut ipliklere bağlı etmişti. 3D kültür için iyi kurulmuş bir tekniktir olmasına rağmen, sorunlar gevşek attac sonuçlandı olabilir gemilerin ana limanına iskelelerinin kaldırılması ile ortaya çıkmıştırhed hücreler kaybetmiş olmanın. Tam olarak bu sorunu ortadan kaldıracak açılabilir gemiler; Bu satın almak için kullanılabilir, ancak önemli ölçüde bu çalışmada kullanılan tek damarlarda daha pahalıdır. Bu çalışma, standart hücre kültürü kuyucuğu tüm tabanını örtmeyen iskeleleri tohumlama ile güncel konular göstermektedir. Bilinen bir hücre sayısını Tohumlama bağlı tüm hücreler için izin İskele yüzölçümünün rağmen, iskele üçüncü yapanlar daha az sonuçlandı. Bu gelecekteki potansiyel tıbbi cihaz olarak iskele ile biyouyumluluk ve hücre-malzeme / hücre-hücre davranışlarını ve etkileşimlerini değerlendirmek diğer hücre bazlı tahlillerde zararlı sonuçlar doğurabilir. Çalışmanın başka sınırlamalar 4 saat zaman noktası içerebilir - ilk hücre tohumlama sağlamak için yeterince uzun olmasına rağmen (hücreleri sıkıca otuz dakika 13,14,15 içinde yüzeylere eklemek gösterilmiştir), içeri makul olabilirDaha sonra zaman noktaları, aksi takdirde, başlangıçtaki hücre sayısı eğrilik gibi hücreler, daha uzun bir zaman dilimi boyunca çoğalmazlar temin incelenmelidir. Bu durumda, 10 ml ortam hacminin azaltılması, aynı zamanda da hücre ve iskele arasında teması geliştirmek ve sonuçta hücre eki artırabilir. Gelecekteki çalışmalar hücre hasarını ve / veya hücre ölümüne yol 16 hücre tohum işlemi olarak hücre canlılığı dikkate almalıdır. Böyle bir canlı / ölü tahlil, örneğin, canlılık düzeyini vurgulamak gibi hücre, DNA deneyleri, canlı ve cansız hücreler arasında ayrım yoktur. Bu soruşturma bilinen bir miktar tohumlama rağmen iskele eklemek hücrelerin gerçek sayısı farkındalığı arttırır. Hücrelerin başlangıç ​​sayısının güveniyor çalışmalar için, araştırmacıların bu rakamın birçok gerçeği ilgi substrata yapışır yapmak tam olarak nasıl olduğunu çok önemlidir.

Iskeleleri rutin geliştirilen ve biyomalzeme ve doku mühendisliği uygulamaları için araştırılmaktadır. Bu haliyle, genel olarak, örneğin, hücre proliferasyonu, hücre tespit eden deneyler ile karakterize edilen hücreler ve in vitro davranışı ile tohumlanır. Bu gibi deneyler için, başlangıçtaki hücre sayısı bilinmektedir zorunludur ve araştırmacılar ml veya cm2 başına hücre sayısı açısından tohum konsantrasyonunu belirtmektedir. Bu özellikle ölçek-up amaçlı iyi bir uygulama, iken, o (biyomalzeme yüzeyinin 1 yapışkan özelliklerine bağlıdır) iskele yüzeyine yapışır hücrelerin gerçek sayısı hesaba katmaz. Hücreler yapı uzak düşebilir ve nedeniyle deney genellikle statik doğası, inte malzeme ile temas geri gelmek asla bu hücre kültürü plaka tüm tabanını örtmeyen iskeleleri için özellikle doğrudurdinlenme. Electrospun elyaf iplikler de (Şekil 1A) tabanını kapsamaz bir iskele iyi bir örnektir. Bu durumda, yüzey ile muamele edilmiş olan düşük bir bağlanma yuvalı plakalar plakanın yüzeyine bağlanması ve bu nedenle herhangi bir iyi-bazlı bir tahlilin sonuçlarını bozan hücreleri önlemek için kullanılmalıdır. Peki plakalar kolayca iskeleleri üzerine hücre tohumlama için kullanılır, ancak mevcut tek yöntem değildir. Döner hücre kültürü sistemleri, 1980 sonlarında NASA Yaşam Bilimleri Bölümü tarafından geliştirilen bioreaktörün bir tip, benzer simüle mikrogravite ile üç boyutlu (3D) ortamında iskeleleri tohum kullanılır. Bioreaktörün Bu tür dünya çapında araştırmacılar ile popüler bir seçenek kalır ve hücreleri 4,5 ve doku mühendisliği 6,7 kök hücre 2,3 sinyalizasyon için çalışmalar dahil edilmiştir. Ne de plakaları tercih döner biyoreaktör yapan bakım,genellikle olduğu gibi, dedifferentiating gelen farklılaşmış hücrelerin önlemeye yardımcı olan bir 3D çevre, zaman geleneksel 2D koşulları 8 içinde kültüre. Bu kağıt bir 4 saat süre içinde bu iskeleleri takılarak hücrelerin ilk sayısını maksimize etmek için Bosworth ve ark., 9 fabrikasyon olarak electrospun poli (ε-kaprolakton) lif iplikleri insan mezenkimal kök hücreleri tohumlama için farklı teknikler inceler. 2B kültür için, iplik güvenli bir kuyucuğu veya ısmarlama poli (tetrafluoroetilen) (PTFE) olukları içinde tutulan ve statik koşullar altında tutulur, ya da 30 rpm&#39;de sallanmıştır. 3D kültür için, iplikler ve hücreler 9 rpm&#39;de dönen biyoreaktör damarları içinde yapılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>in-house supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1117271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70013016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-12974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture media</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-28010B</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement mix</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-39810</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimyotic mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59417C</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks (T75)</td>
			<td>Becton Dickinson Ltd</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding 6-well plates</td>
			<td>Costar Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well CellCrowns</td>
			<td>Scaffdex</td>
			<td>C00003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish 50 ml deep</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE troughs</td>
			<td>in-house production</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker plate</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SSM1</td>
			<td>Mini Orbital Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>Digital Bio</td>
			<td>DHC-F01</td>
			<td>Disposable C-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>352096, 429901</td>
			<td>15 ml and 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotafix 32 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 ml</td>
			<td>Shield Medicare Ltd</td>
			<td>3039820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>40305, 47310, 40125</td>
			<td>5, 10 and 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td>
			<td>P2 - P1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>SLS</td>
			<td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro test tube 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoGreen Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>Assay set-up in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate-reader</td>
			<td>BGM Labtech</td>
			<td>FLUOstar Optima</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %</td>
			<td>TAAB Laboratories</td>
			<td>G002</td>
			<td>Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>999-97-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium stubs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon tabs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold sputter coater</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>S150B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom World</td>
			<td>Phenom Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

Biyomalzeme ve doku mühendisliği araştırmalar genellikle başlangıç ​​hücre sayısı ilk bilgi gerektiren hücre bazlı in vitro araştırmalar içerir. Araştırmacılar genellikle kendi ekim yoğunluğu başvuru yaparken bu mutlaka söz konusu malzemeye yapışmış olan hücrelerin gerçek sayısını göstermez. Bu durum, özellikle, standart hücre kültürü kuyucuğu tabanını örtmeyen malzeme ya da yapı iskelesi, için de geçerlidir. Bu çalışma kültüründe 4 saat sonra electrospun poli (ε-kaprolakton) iplik üzerine bilinen bir sayı numaralı seribaşı insan mezenkimal kök hücrelerin ilk eki inceler. Electrospun iplikler 9 rpm, petri çanakları içine yerleştirilmiştir düşük bir bağlanma kuyucuğu ve politetrafloroetilen (PTFE) olukları içinde yer alan hücre kültür ekleri dönen biyoreaktör damarları dahil olmak üzere, pek çok farklı kurulumlar içinde yapıldı. Son iki bir çalkalama plakası üzerinde statik şartlar ya da maruz kalmış veya bir yer (30 37 C &#39;de 4 saat inkübasyon% 5 CO2 sonra ekilmiş hücrelerin bulunduğu yere hücre, DNA testi ile belirlendi. Iskeleleri bunların kaplardan uzaklaştırılmış ve liziz tamponu içine yerleştirildi. Ortam fraksiyonu benzer çıkarıldı ve santrifüj edildi - yüzer madde ayrılır ve topak lisis tamponu ile parçalanır. Liziz tamponu her haznesine eklenir, ya da iyi ve mevcut olabilecek herhangi bir hücre serbest kazınmıştır. Hücre DNA testi iskele içinde bulunan hücreler, medya ve iyi fraksiyonların yüzdesini belirledi. Hücre eki iplikler hücre kültürü ekler içinde tutulan ve hareket sallayarak tabi için büyük eki (% 30) ile, tüm deney seti-up için düşük oldu. Bu çalışma, bağımsız belirtilen hücre tohumlama yoğunluğu iskeleleri takılarak hücrelerin gerçek sayısı farkındalığı arttırır.

Sonuçlar araştırıldı her deneysel set-up için 4 saat sonrası tohumlama aşağıdaki hücrelerin yerini vurgulamak. Şekil 2A, bu süre içinde iskele yüzeye bağlı hücrelerin yüzdesini gösterir. 8.5 pg / hücre, bir dönüşüm faktörü hücre sayısı olarak ölçülen bir DNA içeriği dönüştürmek ve böylece hücrelerin 10 yüzdesini belirlemek için kullanılmıştır. Tüm tohum düzenekleri incelenmiştir için, hücre bağlanma yüzdesi, hücre kültürü ekler içinde tutulan ve 30 rpm&#39;de (yerleştirin Shaker) çalkalandı iskeleleri için büyük hücre uyumunu (% 30) ile nispeten düşüktür. Düşük yapışma (% 15), hücre kültürü ekler içinde tutulan İskele ve statik koşullarda (Ekle Statik) altında tutulur. Hücrelerin büyük bir kısmı ortam fraksiyonu (Şekil 2B) içinde mevcut olan, özellikle% 50 ve% 51 olan düşük bir bağlanma plakası (yerleştirin Statik) ve döner damarların içinde tutulan hücre kültürü parçaları içinsırasıyla. Çukur Shaker için hücrelerin% 48 ve Dip Statik 50% - olukları içinde tutulan iskeleleri tutucu kendisinde mevcut hücrelerin yükseltilmiş sayıda gösterdi. Taramalı elektron mikroskobu hücre numaralı seribaşı iskeleleri görsel değerlendirmeyi (Şekil 3) izin verdi. Temsilcisi görüntüleri bakılmaksızın set-up tohumlu, lifli yüzey hücreleri sınırlı varlığını vurguladı. Bununla birlikte, hücrelerin ve hücre topaklarının daha fazla sayıda hücre kültürü ekler içinde tutulan ve 30 rpm&#39;de (yerleştirin Shaker) çalkalandı iskeleler mevcut değildi. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Electrospun İplik içinde Yapıldı Şekil 1. Deney Seti-up; (A), hücre kültür ekleri ve düşük bir bağlanma yuvalı plaka (B) poli (tetrafluoroetilen) (PTFE) oluğu ve petri kabı; ve (C) biyoreaktör gemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Farklı Tohumculuk Set-up kullanarak PCL electrospun İplikler üzerine Hücreleri 4 saat sonrası tohumlama Şekil 2. Konum. Ortam, (de ve yapı iskelesi, n = 4, veriler olarak sunulur (B) - üç kat içinde hücre konumu yüzdesi yayılmasını vurgular (A) (ortalama ± standart sapma), PCL iskele bağlı hücrelerin yüzdesini gösterir ) değerleri ortalama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Şekil 3. Temsilcisi Taramalı Elektron Mikrograflan İnsan Mezenkimal Kök Hücreler ile PCL electrospun İplik, 4 İlk Tohumculuk Farklı Deney Seti-up kullandıktan sonra saat. Için (1,000X büyütmede tüm görüntüleri, ölçek bar = 130 mikron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÎµ-caprolactone Electrospun Yarns at JoVE.com

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&amp;#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Poli (ε-kaprolakton) electrospun İplik İnsan Mezenkimal Kök Hücre Ek Optimize

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

9.6K Görüntüleme.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Video: Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Biyomühendislik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used techniques for the development of in vivo cancer models have considerable limitations. Therefore, in this study, we aim to implement cell sheet technology to develop an in vivo cancer model. Hepatocellular carcinoma (HCC) is successfully developed in nude rats using cell sheets created from HCC cell line cells. The cancer cell sheets are generated through intracellular adhesion and the formation of a stratified structure, controlled by the extracellular matrix. This allows for the HCC sheet transplantation into the liver and the creation of a tumor-bearing animal model within a month. In addition, the role of mesenchymal stem cells (MSC) in the development of this cancer model is investigated. In addition to the HCC cell line sheet, another two cell sheets are created: a sheet of HCC cells and bone marrow MSCs (BMMSCs) and a sheet of HCC cells and umbilical cord MSCs (UCMSCs). Sheets that have a combination of both HCC cells and MSCs are also capable of producing a tumor-bearing animal. However, the addition of MSCs reduces the size of the formed tumor, and this adverse effect on tumor development varies depending on the used MSCs' source. This indicates that a cell sheet made of certain MSC subtypes could be utilized in tumor management and control.

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Here, we present a protocol to develop an in vivo cancer model using cell sheet technology. Such a model could be very useful for the evaluation of anticancer therapeutics.

Hepatosellüler karsinom Vivo içinde geliştirilmesi üzerinde mezenkimal kök hücre sayfası potansiyelini keşfetmek

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...