Bu çalışma Iacocca Aile Vakfı, Rosalind Franklin Üniversitesi start-up fonları ve Sağlık Grant DK092721 Ulusal Enstitüsü (RVI için) bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar makalenin hazırlanmasında yardımı için Nikki Intine teşekkür etmek istiyorum.

Tüm işlemler &quot;Laboratuar Hayvan Bakımı İlkeleri&quot; konusunda açıklanan kuralları (Sağlık yayının National Institutes hayır. 85-23, 1985 revize) ve onaylanmış Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım sonrasında gerçekleştirilen ve Komite hayvan protokolü 08-19 kullanın edilir. Bu yazıda kullanılan 2 önemli kısaltmalar vardır. 1) DM: akut (300 mg / dl) hiperglisemik hal içinde olan ve en azından 3 hafta olmuştur balık anlamına gelir. 2) MM: (bkz protokolü) DM balık 21 gün vardı ve pankreatik rejenerasyonu ile glisemik kontrolün yeniden izin verilen balık anlamına gelir. Bu ilaç çıkarma (14) gün sonra elde edilir. Balık bu noktadan itibaren MM balık olarak kabul edilir. Kontrol olarak adlandırılan bu balık dikkat etmek de önemlidir DM veya MM enjeksiyon sayısı açısından balık (sadece tuzlu su), çeşitli sıcaklıklarda inkübasyon süreleri ve sayı ve zamanlama gibi aynı şekilde muamele edilmiştirKuyruk yüzgecinin amputasyonların. 1. Diabetes mellitus, DM Balığı Zebra balığı üretimi <ol><li> Kurtarma ve anestezik su tankları hem hazırlayın. Kurtarma su normal balık sudur. 2-fenoksietanol yüzden normal balık su içinde bir 1:1,000 seyreltme elde edilir yeterli eklemek anestezik su için. </li><li> % 0.09 sodyum klorür 2 ml STZ 6 mg eklenmesi ve hemen buz üzerinde çözüm yerleştirin tarafından streptozosin (STZ) bir% 0.3 solüsyonu (bir davlumbaz) hazırlayın. Bu, 20 dakika içinde yaklaşık 20 balık enjeksiyon için yeterli enjeksiyon solüsyonu sağlayacaktır. Eğer 20 dakika işareti aşarsa, durdurmak ve devam etmeden önce yeni bir STZ çözüm olun. Kontrol balık için ayrı bir tüp kısım yeterince tuz çözeltisi içinde. STZ çözündüğünü sonra tüm sonraki adımları davlumbaz kullanılması gerekmez. </li><li> Hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat sağlayarak STZ veya kontrol çözümleri ile 27 1/2 gauge iğne ile donatılmış bir ½ cc şırınga doldurun. </li><li> Anestezianestezik suda balık yerleştirerek, her bir balık Tize ve onların yüzme hareketi (1-2 dk) geçene kadar bekleyin. </li><li> Bir kez anestezi kısaca herhangi bir aşırı su emmek için bir kağıt havlu üzerine balık yer, tekne ağırlığında balık yerleştirin ve balık kütlesi ölçer. </li><li> Enjeksiyon için bir sert yüzey (Petri çanağı kapak) üzerinde balık yerleştirin. </li><li> Ventral peritonun posterior yönü içine konik geçmişte iğne sokarak balık periton boşluğuna STZ veya kontrol solüsyonu enjekte edilir. </li><li> 0.35 mg / g arasında STZ ile (350 mg / kg) her biri balık ve aşağıdaki şekilde hesaplanabilir gereken% 0.3 çözelti hacmine göre teslim edilmelidir. <ol class="lalpha"><li> Gerekli mg STZ miktarını elde etmek için 0.35 ile balık kütlesi (g) çarpar. </li><li> ul enjeksiyon için gerekli olan% 0.3 çözelti hacmi elde etmek için 3 ile oluşturulan yukarıdaki ürün bölün. Örnek: 0.5 gr balık için: a) 0.5 x 0.35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0.058 ml= 58 ul. STZ olmadan aynı hacimde bir kontrol balıklar için enjekte edilecektir. Balık kütlesi başına enjekte hacimleri için sac oluşturulan ve hızlı başvuru için kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> Aşağıdaki enjeksiyon kurtarma su tankındaki balık yerleştirin ve normal yüzme aktivitesi için onları izlemek. Bir kez bu balık elde edilmiştir 22, indirgenmiş sıcaklık aralığında muhafaza edilir, normal bir yaşam tankına transfer edilir ° C - 24 ° C. Bu azaltılmış sıcaklık hiperglisemi verimli indüksiyonu (diabetes mellitus, DM) için önemlidir. </li><li> Hiperglisemi çok yüksek bir hiperglisemi uzatılmış durumuna neden olmak amacıyla, ilk enjeksiyondan 24 saat içinde tespit olmasına rağmen zebrabalığı aşağıda gösterildiği gibi bir sık ​​enjeksiyon indüksiyon fazı haftalık bakım enjeksiyonlar izledi gerektirir. </li></ol> 1. Hafta: 3 enjeksiyon (Gün 1, 3, 5), Hafta 2: 1 enjeksiyon (Gün 12), 3. Hafta: 1 enjeksiyon (Gün 19) 4. Hafta: (Gün 21) gerçekleştirinilgi tahlil. Bu noktada zebrafish hiperglisemi uzun bir devlet olmuştur sayılır ve retinopati, nefropati ve ayrıca engelli fin rejenerasyon diyabetik komplikasyonların sergilerler. Bunlar, DM balık olarak adlandırılır. Ek olarak arzu edilirse balık haftalık bakım enjeksiyonu ile hiperglisemik hal içinde muhafaza edilebilir. Bu işlem sırasında yaklaşık olarak% 5 oranında ölüm olması beklenmektedir. 2. Kan Toplama ve Açlık Kan Şekeri Seviyesi (FBGL) Belirlenmesi <ol><li> DM ve kontrol balık Her grup Bu deneyde, bu balık feda edilmesi için gerekli olduğu gibi tam olarak grubunun ortalama FBGL belirlemek için yeterli balık içermelidir. </li><li> Steril serum fizyolojik 5 ul içeren her kan örneği için bir etiketli PCR tüpü hazırlayın. </li><li> Kan toplama için, yukarıdaki gibi balık uyutmak, tüm su kaldırmak bir mikroskop lamı üzerine balık yerleştirin ve bir neşter kullanılarak, balık kafası kaldırmaoperculum&#39;un dibinde. </li><li> Slayt üzerine balık serbest ve hızlı kan yapışmasına etmediğinden emin olmak için yukarı ve aşağı pipetleme steril normal salin 5 ul bunu ekleyin kanı (en fazla 2 ul) toplayın. Hemen buz üzerinde örneği yerleştirin. </li><li> Sıvı toplam hacmi ölçülerek kan numune hacmi (tuzlu + kan) belirlenmesi ve daha sonra tuzlu su 5 ul dışarı çıkartılması. </li><li> 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp içine her PCR tüp seyreltilmiş kan 5 ul aktarın ve QuantiChrome Glukoz Testi Kiti kullanarak kan glukoz konsantrasyonunu belirlemek. Bu istisnasız üreticinin protokolü takip ederek gerçekleştirilir. Beklenen sonuçlar: Normal / kontrol balık 60 mg / dl ve DM balık 310 mg / dl. </li></ol> 3. Kuyruk Yenileme Çalışmaları <ol><li> 1,0-1,4 tarif edildiği gibi balık anestetize. </li><li> Steril bir boyutu kullanarak Place bir Petri kabı kapağının üzerinde balık ve düz bir çizgi kuyruk yüzgeci organını10 bir diseksiyon mikroskobu ile fin izlerken ilk lepidotrichia dallanma noktasına proksimal neşter. </li><li> Balık 1.10 olarak kurtarabilirsiniz ancak testin rejeneratif büyüme fazı için 33 ° C&#39;de balık yerleştirmek için izin ver. Bu hızlandırılmış yüzgeç yenilenmesi analizi için kurulmuş bir sıcaklıktır. </li><li> Yüzgeçleri ancak biz rutin ötesi bölümünden sonra 24, 28 ve 72 saatte rejeneratif büyümenin incelenmesi sonrası herhangi amputasyon de görüntülenebilir. </li><li> (1,0-1,4 bakınız) daha önce olduğu gibi balık uyuştur, bir kamera (biz bir Q-görüntüleme Kamera ile donatılmış Nikon SMZ-1500 kullanımı) ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu altında balık yer ve NIS elemanlar yazılımı ile 1X büyütme tüm fin görüntüler toplamak . Yüzgeç tamamen doku germe veya zarar vermeden genişletilmiş ve herhangi bir su damlacıklarının arındırılmış olmalıdır, böylece görüntüleme için yayılmış olmalıdır. Tutarlılık için her zaman sağ dorsal tarafına yerleştirin. </li><li> Görüntüler yazdırın ve rejeneratif Gro ölçmekwth alanı Görüntü J yazılım ve çizim pedi kullanımı kullanarak. Yeni büyüme tüm çevresi izleme ve alanı belirler. Her ölçüm beş kez yapılan ve izleme doğruluğunu sağlamak için ortalama edilmelidir. O bu akıbet alanda ölçüm hataları katkıda olarak kullanılan görüntüleri gölgeler veya su damlacıkları yok olması önemlidir. </li><li> Dorsal karın eksen boyunca kesilmesi site uzunluğu ölçülür ve bu ölçüm ile 3.6 olarak tespit edilen alan bölün. Bu, farklı boyutlarda balık doğrudan mukayese edilmesi verir. </li></ol> 4. Metabolik Bellek (MM) Zebra balığı üretimi <ol><li> DM balık ve Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi bunların uygun bir kontrol grubu başlatın. </li><li> 21 günün sonunda grubun bir alt kümesi için FBGL belirlemek ve 2 alt gruba DM balık bölün. Deney süresi için DM kontrol olarak gruplardan biri için haftalık STZ enjeksiyonu devam edin. Ikinci grup ve incubat için STZ enjeksiyonu kesE normal sıcaklıkta balık. 14 gün içinde bu zebrafish normal kan insülin ve glukoz pankreas rejenerasyon yoluyla kontrolü geri yüklenir. Bu balıklar artık MM (metabolik bellek balık) denir. </li><li> Günde 30 mesaja uzaklaştırılan ilaç 3.2 &#39;de açıklanan yöntemle balık DM ve MM kontrol kaudal yüzgeçler, organını. </li><li> 30 gün boyunca yüzgeç yenilenmesi için normal su koşullarına balık dönün. Bu ne terim, metabolik bellek doku büyümesini sağlar. </li><li> Günde 60 30-60 gün dönemde rejenere edilmiş doku içinde ikinci amputasyon (as 3.2 &#39;de açıklanan) gerçekleştirmek ve kuyruk yüzgeci rejenerasyon assay (3,1-3,7) Şekil 1 gerçekleştirin. </li><li> Doku izole ve ilgi testi gerçekleştirin. Bir protokol özeti için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Diabetes mellitus, başlangıçta sonuçta öglisemi farmasötik müdahale olsa elde edildikten sonra tüm bile devam birçok komplikasyonlara yol açan kan damarı hasar ile sonuçlanan hiperglisemi, tanısı metabolik düzensizlik bir hastalıktır. Komplikasyonların Bu sebat metabolik bellek ve çeşitli yeni çalışmalar epigenetik mekanizmalar bu fenomeni oynadığı rolü incelenmiştir olarak adlandırılır. Burada akut diyabetik ve metabolik bellek (restore şekeri kontrolü) zebrafish hem üretimi için izin...

Diabetes mellitus (DM) ciddi ve büyüyen bir sağlık sorunu olduğunu hastalığa özgü mikrovasküler (retinopati, nefropati, nöropati, yara iyileşmesinde bozulma) ve makrovasküler (kalp hastalığı ve inme) komplikasyonlar 1 nedeniyle azalmış yaşam beklentisi sonuçlar. Bir kez başlatılan, diyabet komplikasyonları glisemik kontrol 2,3 elde edilmiş olsa bile kesintisiz ilerlemeye devam ediyor ve bu fenomenin metabolik bellek veya eski etkisi olarak adlandırılır olmuştur. Bu olayın varlığı, &quot;Diyabet Kontrol ve Komplikasyonları Çalışması (DCCT)&quot; ilerledi ve o zamandan beri birçok ek klinik 4,5,6,7,8,9,10 tarafından desteklenmektedir olarak 1990&#39;ların başlarında klinik olarak tanındı 11,12,13,14. DM Hayvan modelleri diyabetik komplikasyonlar ve metabolik bellek pato-fizyolojisi ile ilgili keşifler için kritik olmuştur. Aslında, diyabetik komplikasyonların sebat ilk diyabetik bir köpek modelinde belgelendiHangi retinopati yana in vitro kültür sistemleri ve hayvan modelleri 15,16,17,18,19,20,21 içinde çeşitli kullanarak deneysel kanıt birkaç satırlık tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmalar, net bir şekilde hedef organ / hücrelerin sürekli bozukluklar (anormal gen ekspresyonu dahil olmak üzere) ve mekanistik bir ilk dönem sonuçlarının hiperglisemik epigenom katılımı göstermektedir göstermektedir. Epigenomes belirli bir hücre tipi için tüm kromatin modifikasyonları oluşur ve hücre benzersiz gen ekspresyon profili sorumludur. Kromozom değişiklikler, geliştirme, destek hücre farklılaşması sırasında dinamik dış uyaranlara duyarlı, mitotik stabil 22,23 devralınan ve hastalık 24,25,26 değişmiş olabilir. Bu epigenetik mekanizmalar şunlardır: translasyonel histon modifikasyonları, octomers olmayan kanonik histon varyant içerme, DNA metilasyonu ile kromatin erişim değişiklikler ve gen yayınlayınmikro RNA&#39;lar 27,28,29,30 kodlamayan yoluyla ifade kontrolü. Toplamda, epigenetik süreçleri hücre / organizma hızlı çevresel uyaranlara 31,32,33 değişen yanıt vermesini sağlamak, onlar da bu uyarıcı 23,22 çıkartıldıktan sonra karşılaştığında &quot;hatırlamak&quot; için hücre için yeteneği kazandırmaz. Epigenetik süreçler sonucunda değişmiş gen ekspresyon profilleri bunları başlatılan sinyalinin olmaması (ler) in kararlı ve hücre bölünmesi yoluyla kalıtsal olarak, bu nedenle, onların metabolik bellek dahil olmak üzere insan patolojilerin moleküler mekanizmalar olarak büyük ilgi kazanmıştır. DM ve epigenetik hiperglisemi ile indüklenmiş epigenetik değişikliklerin bir bolluk hücre transkripsiyonel ağlarda kayda değer kalıcı değişiklikler (34,35,36,37,38 olarak gözden geçirilmiştir) neden olduğu diğer hastalıkların paralel gelişmeler bağlamında ortaya çıkmaktadır sonuçlanır. Zebrafish uzun stu için önde gelen bir model organizma olmuşturdy omurgalı gelişimi Ancak son 15 yılda insan hastalık çalışma için bu organizma kullanan bir üstel büyüme. 39. gördü. Insan hastalık Zebrafish modeller genetik bozukluklar ve edinilmiş hastalığı 40,41,42 dahil olmak üzere insan patolojileri geniş bir aralığı kapsayan kurulmuştur. Diğer omurgalı model organizmalar üzerinde zebrafish birçok avantajı yüksek doğurganlık, kısa döl süresi, erken yetişkinlik yoluyla şeffaflık, düşük konut maliyetleri ve gen manipülasyonu için bir dizi araç içerir. Dahası, omurgalılarda ve yüksek verimli ilaç taramalarında gerçekleştirmek için kapasite arasında genetik yolları ve hücre fizyolojisi geniş koruma dolayı, zebrabalığı başarılı ilaç keşfi için kullanılmıştır. Biz diyabetojenik ilaç, streptozosin kullanarak tip I diyabet, yetişkin zebrafish modeli geliştirdik. Biz diyabetik zebrafish hiçbir göstermek için bu modeli karakterize etmişt sadece bilinen insan ikincil komplikasyonlar görüntüler, ancak ilave olarak, çevre hiperglisemik bir sonucu olarak bozulmuş uzuv yenilenme (kaudal yüzgeç rejenerasyon) sergiler. Ayrıca, hiperglisemik zebrafish bir fizyolojik normal glisemik devlet sonuçlanan endojen pankreatik beta hücrelerinin yenilenmesi nedeniyle uzaklaştırılan ilaç 2 hafta içinde normal glisemi geri dönmek olduğunu bildirdi. Bu komplikasyonun devam ve metabolik bellek duyarlı olduğunu belirten akut diyabetik devlet Ancak, aksine, bu balık uzuv rejenerasyon aynı ölçüde bozulmuş kalır. Bu modelin üretilmesi için ana hız önceki hiperglisemik çevre arka plan gürültü yokluğunda metabolik bellek fenomen destek mitotik olarak kararlı epigenetik bileşenini ve bir sistem sağlamaktır. Protokolü bitiminde zebrafish ve veya seçici dokuların resea uygun herhangi bir tahlil ile işlenebilir Burada sağlananrchers gerekmektedir. Biz başarıyla metabolik bellek durumu 21 tutulur hiperglisemi ile indüklenen DNA metilasyonu genom kalıcı değişiklikleri tanımlamak için bu prosedürü kullandık. Biz tip I diyabet bu zebrafish modeli metabolik bellek incelenmesi için diğer model sistemler üzerinde birçok yenilikçi avantajları olduğunu hissediyorum. 1) bizim Tüm çalışmalarda, in vivo olarak gerçekleştirilebilir ve önceki hiperglisemik balık endojen insülin üretiminin rejenerasyonu ile öglisemi dönmek gibi, eksojen insülin enjeksiyonları gerekmez. Bu nedenle, bu dışsal ensülin gerektiren hayvanların oluşabilir glisemik kontrol zorlaştıran ani ve vadiler önler. 2) yukarıda tarif edilen önceki diyabetik durumuna (yani ileri glikasyon son-ürünleri ve reaktif oksijen türlerinin belirteçlerin devam eden varlığı) için arka plan uyarım elimine edilir ve bu nedenle tek bir saf epig incelemek üzeremetabolik bellek enetic faktörleri. Bu metabolik bellek inceleme kadar diyabet indüksiyon yaklaşık 80 gün sürer olarak 3) deneyleri hızla gerçekleştirilebilir. 4) Kuyruk yüzgeci rejenerasyon deneysel çok cana yakın ve araçları geniş bir dizi var olduğu için kolay genetik ve deneysel manipülasyon için izin verir. 5) Kuyruk yüzgeci rejenerasyon metabolik bellek değerlendirmek ve bu nedenle gelecekteki ilaç keşfi için izin verecek bir çok basit ve ölçülebilir bir yöntem sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Batlarda </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2 fenoksietanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi (boyut 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Petri Yemekleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> 27 1/2 gauge iğne ile ½ cc şırınga, </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome glucose tahlil kiti. </td><td> Biyoassay Sistemleri </td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Herhangi bir diseksiyon mikroskobu gayet iyi. </td></tr><tr><td> Görüntüleme için Kamera </td><td> Nikon </td><td> Q görüntüleme </td><td> Herhangi bir kamera uygundur. </td></tr><tr><td> Image J yazılımı </td><td> Ulusal Sağlık Enstitüleri </td><td> NIH Image </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elemanları </td><td> Nikon </td><td></td><td> Herhangi bir görüntüleme yazılımı uygundur. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

Diabetes mellitus, şu anda 346 milyon kişi etkiler ve bu sayının 2030 yılında 400 milyon artması beklenmektedir. Laboratuvar ve büyük ölçekli klinik çalışmalarda hem Kanıt diyabetik komplikasyonların gelişme glisemik kontrol farmasötik gerçekleşse bile metabolik bellek fenomen aracılığıyla engelsiz olduğunu ortaya koymuştur. Gen ekspresyonu stabil bir şekilde hücreler ve organizmalar hızla çevresel uyarıcılar değişen cevap vermesine izin verir, sadece epigenetik değişiklikleri yoluyla değiştirilen değil aynı zamanda bu uyarıcı çıkartıldıktan sonra karşılaşır &quot;hatırlamak&quot; için hücre yeteneği vermek edilebilir. Gibi, bu mekanizmaların metabolik bellek fenomen oynadığı roller henüz incelenmektedir. Biz son zamanlarda tip I diabet zebrafish modelinin geliştirilmesi bildirdi ve ilişkili değişiklikler dahil olmak üzere bilinen sekonder komplikasyonların görüntüleyemez sadece diyabetik zebrafish göstermek için bu modeli karakterize etmişDiyabetik retinopati, diyabetik nefropati ve bozulmuş yara iyileşmesi ile değil, aynı zamanda engelli Kuyruk yüzgecinin rejenerasyon sergilerler. Bu model zebrafish hasar görmüş pankreas yeniden ve transplant sonrası insan hastalarda beklenen ne benzer bir öglisemik durumuna geri yüklemek için yeteneğine sahip olduğunu benzersizdir. Ayrıca, Kuyruk yüzgecinin amputasyon çok sayıda mermi önceki Diyabetik devlet potansiyel zorlaştıran faktörler olmadan vivo sistemde saf epigenetik etkileri ayrılması ve çalışma için izin verir. Öglisemi pankreas rejenerasyon sonrasında elde olmasına rağmen, yüzgeç yenilenmesi ve cilt yara iyileşmesi Diyabetik sekonder komplikasyon süresiz devam. Bozulmuş yüzgeç rejenerasyon durumunda, bu patoloji hatta kız yüzgeç dokularda kanat rejenerasyon çok sayıda mermi sonra saklanır. Bu gözlemler, metabolik bellekte varolan bir durumda bulunan altta yatan epigenetik sürecine işaret etmektedir. Burada başarılı bir nesil için gerekli yöntemleri anlatmakbalık diyabetik ve metabolik bellek grupları hafiften orta ve bu modelin avantajları tartışacağız.

Bozulmuş Kuyruk yüzgecinin rejenerasyonu: I diyabetik zebrafish sadece retinopati ve nefropati bilinen sekonder komplikasyonların gösterilecek, ama aynı zamanda, ek bir komplikasyon sergilerler yazın. Bu daha sonra bir komplikasyonudur hiperglisemik dönemi sonrasında normal glukoz kontrolü restore balık metabolik bellek nedeniyle devam etmektedir. Şekil 2A (kontrol) ve Şekil 2B (metabolik bellek) 72 saat sonrası amputasyon ele geçirildi yenileyici yüzgeçleri temsili gör...

Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory at JoVE.com

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Metabolik bellek diyabetik komplikasyonlar inat ve öglisemi farmasötik elde edildikten sonra bile engelsiz ilerleme hangi olgudur. İşte biz metabolik bellek mitotik bulaşıcı epigenetik bileşenlerinin incelenmesi için izin verdiği benzersiz bir diyabet zebrafish modeli açıklamak<em&gt; In vivo</em&gt;.

Diabetes Mellitus ve Metabolik Belleğinin Zebrafish Modeli

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

a-zebrafish-model-of-diabetes-mellitus-and-metabolic-memory

Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K Görüntüleme.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Metabolik bellek diyabetik komplikasyonlar inat ve öglisemi farmasötik elde edildikten sonra bile engelsiz ilerleme hangi olgudur. İşte biz metabolik bellek mitotik bulaşıcı epigenetik bileşenlerinin incelenmesi için izin verdiği benzersiz bir diyabet zebrafish modeli açıklamak In vivo.

Video: A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Tıp

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Sıçan Kronik Besin İnfüzyon Bir Model

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte<em&gt; Wnt5a</em&gt; Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Endokrin ve Ekzokrin yeniden programlanması ve Silahların Yayılmasını Önleme Modeli Olarak Pankreas kanalının bağlanmasını yoluyla Fare Pankreas Cerrahi Sakatlık

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Ferric Klorür kaynaklı Karotis Arter ve Mezenter Gemi Tromboz Fare Modeli

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Fare pankreas diseksiyon histolojik analiz ve metabolik profil oluşturma

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Vücut kompozisyonu ve metabolik Caging Analizi yüksek yağ Fed farelerde

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.