Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Yaratma Elastomerik Pullar <ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMS damgası en silikon ustaları oluşturmak için, bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak PhotoMask metraj desenleri. <ol><li> 300 mikron iç çapı (ID) ve 1,200 mikron merkez-merkez aralığı ile 600 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ilk desen tasarlayın. </li><li> 600 mikron kimliği ve 1200 mikron merkez-merkez aralığı ile 900 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ikinci desen tasarlayın. </li><li> Ayrıca, 45 ° açıyla 1,200 mikron merkez-merkez köşe desen aralıklı her dizi tasarım dört köşe 1 x 1 mm 2 kare referans işaretlerini yerleştirin. </li><li> Mikroakışkan dökümhane ile başka bir yerde, 15 veya işbirliği detaylı olarak, standart litografi teknikleri kullanarak bir 300 um özelliği derinliğe ilişkilendirerek, 1 boy oranları: 1 Bu deneyde kullanılmak üzere silikon ustaları imal. Not: Özellik daha düşük 100 um alt-tabaka yüzeyi ile temas etmeden önce pul anormal deformasyonuna neden olan vuruş derinlikleri. NOT: Bu protokol, özel ekipman ve yaratmak için temiz odalar gerektiren Fotorezist tarif desenleri, zaten elde silikon ustaları sahip başlar. Bu desenli ustaları oluşturmak için bir fabrikatör veya çekirdek tesisi ile danışmak en iyisidir. </li></ol></li><li> Silanize silikon ustaları (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorosilan buharı ile inkübasyon O / N. NOT: Silan buharı son derece toksik ve sadece kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> PDMS nin önceden polimer ve 60 ° C&#39;de bir petri kabı O / N olarak silanize edilmiş silikon ustaların üstüne sertleştirme maddesi PDMS: 1 oranında, bir 10 sertleştirme ile silikon ustaların ters kopyaları oluşturun. </li><li> Silikon ustalardan PDMS pulları kaldırmak ve akrilonitril bütadien stiren damgalar (ABS) arkaları veya diğer herhangi bir sert malzeme bağtutkal kullanarak s. Not: seçim malzemenin şeffaf veya biyolojik olarak uyumlu olmak zorunda değildir. Bununla birlikte, PDMS daha robotik kalıp ve yüksek sağlamlığa sahip olan bir arayüz için düz bir yüzeyin sağlanması gerekir. </li></ol> 2. hazırlanması Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Durulama mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) hafif bir azot akımı altında, etanol ile durulanır ve kurutulur edilmeden önce 1 dakika süre ile, aseton içinde, toluen, metanol ve sonikasyon. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz toluen ve aseton tutun. </li><li> Odaklanmış bir elektron ışını buharlaştırıcı kullanılarak 18.0 nm altın (Au), ardından ~ 3.5 mil titanyum (Ti) ile kaplayın coverslides. NOT: Bu prosedür silikon ve polistiren altın dahil kaplı yüzeylerde çeşitli uyumludur. Bu yerinde oluşturmak mümkün olsa da, altın kaplanmış alt tabakalar aynı zamanda ticari tedarikçilerden yoluyla ulaşılabilir. NOT: yüzeylerde Au tabakalar olması gerekirken, Ti tabakalar, en az 3 mil kalınlığında olmalıdırı en az 5 nm kalınlığında ve son alt-tabakanın 16,17 doğru optik özelliklerine bağlı olarak kalınlığı 1 mm tüm yol arasında olabilir. Yüzeyleri imalatı için optik açık olması gerekli değildir; Bununla birlikte, imal edilen alt-tabakaların mikroskopik analizi kolaylaştırır. </li><li> Kullanımdan hemen önce yumuşak azot altında etanol ve kuru ile altın kaplı coverslides durulayın. </li></ol> 3. R-μCP dış çevresinin <ol style="margin-left: 40px;"><li> Seçici uyumlu mafsallı robot kolu (SCARA) sistemi ile R-μCP önce, sistemin yazılımını kullanarak robotik araç efektörler ve beraberindeki çift kamera sistemleri kalibre. NOT: Bu aletler Şekil 1&#39;de resmedilmiştir. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Şekil 1. R μCP Sistemi ve Robotik Kol İşleme. </strong&gt; (A) tüm takım ve demirbaşlar ile R-μCP sisteminin Büyük ölçekli görünümü, (a) vakumla mandren, (b) reaktif banyo, (c) aşağı bakan kamera, (d) damga yuvalama fikstür, (e) robotik aracı. (B) Robotik kol takım resmeden (f) elmas uçlu dağlama aracı ve (g) pnömatik emme aracı (h) ABS destekli PDMS damga tutarak. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Elle 600 mikron ID ve 900 mikron OD halkasal bölge damga yuvalama fikstür aşağı yüz çıkıntılı bir PDMS damga yerleştirin. Elle Şekil 1A görüntülenen vakum aynası, üstüne taze temizlenmiş altın kaplamalı coverslide yerleştirin ve bağlı laboratuar vakum kullanarak hareketsiz. </li><li> Robot denetimleri kullanarak, Şekil 2A gibi, altın kaplı coverslide merkez noktasının üzerinde aşağı bakan kamera hizalayın. NOT: Bu nokta başlangıçta görsel muayene ile tanımlanabilir ve büyük hassasiyet gerektirmez, PDMS damga çok larg olduğu gibialtın kaplı slayt daha er. </li><li> Dört başvuru etch robot kolu talimat &quot;X&quot; boyutları ile bir kare köşelerinde işaretleri robot koluna bağlı elmas uçlu aşındırma aracını kullanarak altın kaplı coverslide merkezli 3.8 mm 3.8 mm. (Şekil 2B&#39;de tasvir; OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Bu dört referans işaretleri aşağı bakan kamera bir görsel çerçevesinde olmasını sağlar. </li><li> Robotların pnömatik emme takım kullanarak, pick-up ve PDMS Şekil 2C olarak damga yuvalama fikstür üzerinde 1 mm damga basılı tutun. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Damganın kare referans işaretleri görselleştirmek ve damgası ortalama X, Y belirlemek için kamera yazılımı ile 10 kez onları tanımlamak, ve açısal merkezinden ofset, Şekil 2D ve E resimde yukarı bakan kamera ve LED aydınlatma halkası kullanılması robot takım ekseni. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Olduğu gibi <strong&gt; Şekil 2A, görselleştirmek ve robot takım ekseni merkezinden ofset coverslide ortalama X, Y merkezi yerleri ve açısal belirlemek için coverslide en kazınmış referans işaretlendiği 10 kez algılamak için aşağı bakan kamerayı kullanmak. (OTOMATİK SÜRECİ). NOT: Bir iç hesaplama tam hizalamak için robotik sistemin yazılımı tarafından gerçekleştirilir damga ve geleceğin R-μCP adımlarla Coverslip X, Y, merkezi yerleri ve açısal uzaklıklar. </li><li> Şekil 2F&#39;de de gösterildiği gibi 3.8)) alkantiyol bir ATRP inisiyatör, ω-mercaptoundecyl bromoizobutirat (etanol içinde 2 mM bir banyoda damga yerleştirin. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Alkantiyol çözeltiden damga çıkarın ve Şekil 2G olarak etanolün buharlaştırılması 0.48 bar (5 psi) basınçlandı azot akımı üzerine yerleştirin. 1 dakika sonra, azot akışı basınç üniform bir kuruluğa gelene sağlamak için 1.03 bar (15 psi) kadar arttırmaktadır. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Eksik kurutma desen sadakat tamamen veya kısmen kaybına neden olur. </li><li> Kurutma işleminden sonra, altın kaplamalı slayt hesaplanan merkez pozisyonu üzerindeki pul taşımak ve Şekil 2H&#39;de gösterildiği gibi Z eksenine motor gücünü izlerken 100 um artışlarla indirin. NOT: Bu Z-ekseni motoru yaşadığı ve robot rehberlik yazılımında görüntülenen tork iletilir. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> 79.2 kPa önceden belirlenmiş bir basınç elde edildikten sonra damga düşürücü durdurmak, ve 15 saniye için altın kaplı sürgü ile temas sağlamak. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: basınç değerleri burada mevcut damga tasarım ve özellik yüksekliği için optimize edilmiştir. Damga tasarım deneme ve yanılma süreci bu doğrultuda özellikle boy oranı yüksek pul, ayarlamak için, değiştirilir. </li><li> Yavaşça altın kaplamalı slayt damga kaldırmak ve geri damga yuvalama fikstür damgası yer. (OTOMATİK SÜRECİ) </li></ol&gt; Micropatterned Coverslides ilgili PEGMEMA 4. SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> Vakum basıncı micropatterned coverslide tutarak serbest bırakın ve bir 50 ml&#39;lik bir Schlenk şişesine aktarın. Mühür ve degas savurma bir vakum pompası kullanılarak şişeyi. </li><li> Ekleme makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), su (34.4 mi), metanol (43.8 mi), bakır (II) bromür (1 mmol) ve 2 &#39;, 2-bipiridin (3 mmol) ihtiva eden ATRP Reaksiyon karışımı 5.5 mi Schlenk şişesi. </li><li> Reaksiyonu başlatmak için su içinde L-sodyum askorbat (454,3 mM) 0.5 ml ilave edilir, ve atıl gaz altında, oda sıcaklığında 16 saat süre ile devam etmesini sağlar. NOT: Şekil 3A-B&#39;de gösterildiği gibi, L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra, tepkime rengi koyu kahverengiye doğru açık yeşil yönelecektir. NOT: Reaksiyon 16 saat ötesine devam edebilirsiniz, ancak önemli ölçüde PEG fırçaların uzunluğunu artırmak olmayacaktır. </li></ol><imgalt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; SI-ATRP Şekil 3. başlatılması. (A) reaksiyonu ve L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra (B), müteakip bir renk değişikliğiyle başlatılması. SI ATRP prosedür takip edilerek micropatterned coverslide yüzeyinin (C) mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Schenk şişeden micropatterned coverslide çıkarın ve hafif bir azot akımı altında, etanol, su, ve etanol ve kuru ile durulayın. Not: SI-ATRP sonra, yüzey değişiklikleri gözle görünür olmalıdır ve Şekil 3C&#39;de olduğu gibi, bir mikroskop altında görüntülenmiş ve analiz edilebilir. Not: Bu, bu alt-tabakaların immunostain ihtiyacını ortadan kaldıran şekilde deneme hassas test etmek için basit bir yöntemdir. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 5. Azit Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> N, 6 ml ilave edilir, reaksiyon şişesine, 100 mM sodyum azit ihtiva eden N-dimetilformamid (DMF). 24 saat boyunca 37 ° C &#39;de bu reaksiyon koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMF taşıyınız. Sodyum azid tartıp dikkatli olun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> Brom Fonksiyonlu PEGMEMA Chains 6. Pasivasyon <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam reaksiyon şişelerine Micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> 100 mM etanolamin ve reaksiyon şişesine, 300 mM trietilamin ihtiva eden, dimetil sülfoksit (DMSO) ve 6 ml ilave edilir. 24 saat süre ile, 40 ° C&#39;de, bu reaksiyonu tutun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO, etanolamin ve trietilamini tutun. </li><li> Tamamlandığında micropatterned coversl kaldırmakReaksiyon şişesinden ide, bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> İç anulus 7. R-μCP ve PEGMEMA SI-ATRP&#39;si <ol style="margin-left: 40px;"><li> Küçük özellikleri ile halkasal bölge önceden micropatterned anülleri içine yerleştirilir şekilde 300 mikron ID ve 600 mikron OD çıkıntılı anülleri, bir PDMS damga ikame, 3.12 - Daha önce Adımlar 3.2 ve 3.6 de açıklandığı gibi R-μCP adımları uygulayın. NOT: Bu damga basıncı eşik 132,0 kPa. Daha önce de belirtildiği gibi, bu basınç ayarlarının en düşük mühür özellikleri bu deneyde kullanılmak üzere optimize edilmiştir. </li><li> 4.4 - aşamalarında daha önce 4.1 de açıklandığı gibi SI-ATRP&#39;si adımları uygulayın. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 8. Asetilen Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> DMSO mM 100 ihtiva eden 6 ml ekleyinReaksiyon şişesine propargilamin. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bu reaksiyona koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO ve propargilamin tutun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> 9. Bakır-katalize &quot;Click&quot; Asetilen biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> Bakır sülfat (15 mM) / tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA, 30 mM) içinde 6 ml (ekleme 1: 1 h / h su Reaksiyon şişesine 562 uM azit-PEG 4 -Biotin konjugat ihtiva / DMF). Reaksiyonu başlatmak için bu karışıma su içinde L-askorbik asit (0.15 mM) ve 1.2 ml ilave edilir. </li><li> 10 sn için, reaksiyon çözeltisi içinden kabarcık olarak, azot, Parafilm ile şişenin kapatılması, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca reaksiyona girer. </li><li> Completio üzerineN, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide kaldırmak, su ile yıkayın ve bir 12-yuvalı polistiren tabağa koyun. </li></ol> Biyotinilat Asetilen Grupların 10. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS (% 3 eşek serumu) micropatterned coverslide bloke eder. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca HAA içinde Streptavidin-546 konjugatı (2 ug / ml) (PBS içerisinde% 3 eşek serumu) ile biyotinile asetilen grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS ile 5 kez yıkayın. Not: Bu adım tamamlandıktan sonra, Şekil 4B, sürgünün bir görüntüsünü göstermektedir. </li></ol> 11. Bakır-free &quot;Click&quot; Azide&#39;da biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı NOT: Arzu edildiği takdirde, bu alt-tabaka tadilat aşaması, hücre kültürü esnasında in situ gerçekleştirilebilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12-çukurlu, s micropatterned coverslide boşolystyrene çanak aşağıdaki HAA durular. </li><li> 20 uM DBCO-PEG 4 -biotin ihtiva HAA (ya da hücre kültür ortamı) olarak 2 ml ilave edilir, ve bu reaksiyon oda sıcaklığında 24 saat boyunca devam etmesine izin vermek (ya da bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de). </li><li> DPBS (ya da sadece bir ortam değişikliği yapılması) ile tamamlandıktan sonra, micropatterned coverslide 5 kez çalkalayın. </li></ol> Biyotinilat Azit Grupların 12. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 ml DPBS içinde Streptavidin-488 konjugatı (2 ug / ml) (% 3 eşek serumu) ile biyotinile azid grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS içinde 5 kez yıkayın. </li><li> Resim konfokal floresan mikroskobu kullanılarak coverslide Micropatterned. Bu adım tamamlandıktan sonra Şekil 4A-C sürgünün görüntüleri yer almaktadır. NOT: doku kültürü deneyleri için alt tabakalar kullanırken, bölümleri 10 ve bu protokolün 12 atlayın. İstenen açıda sonraişlevsellik e, bir azot akımı altında% 100 etanol ve kurutulması her iki tarafa da durulama işlenmiş coverslide sterilize edin. Steril bir biyolojik güvenlik kabini için slayt aktarın ve hücre tohumlama ve kültürü ile geçmeden önce PBS ile beş kez slayt durulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology:+Current+Applications+and+Future+Perspectives.">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li><li>Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood.">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li><li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Pursuit+of+Zero:+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins.">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li><li>Rozkiewicz, D. I., Ja&#324;czewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click&#8221;+Chemistry+by+Microcontact+Printing.">Click&#8221; Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li><li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology.">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li><li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes.">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li><li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD&#8212;Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">RGD&#8212;Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li><li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays.">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li><li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Self-Assembled+Monolayers:+Efficient,+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology.">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li><li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li><li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Fouling&#8221;+Oligo(ethylene+glycol)-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Non-Fouling&#8221; Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li><li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment.">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li><li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling.">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).</li><li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+robotic+microcontact+printing+(R-&#956;CP)+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm.">High-precision robotic microcontact printing (R-&#956;CP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning.">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures.">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li><li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo(ethylene+glycol)+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold.">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li><li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry.">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li><li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+(3+2)+cycloaddition.">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Doku mühendisliği için ideal bir alt-tabakalar Biyolojik Tabanlı Akıllı ve böylece doğal dokuların içinde bulunan kritik bir biyolojik olarak aktif ligandlann uzamsal dağılımını özetlemek olacaktır. Ayrıca, ligandların zamansal ayarlamaları ve yönlendirilmiş doku morfojenezini izin vermek için sunulan ve mekansal olarak hücre akıbetinde indüksiyon sınırlandırıldığı uzamsal desen etkinleştirmeniz dinamik özelliklere sahip olacaktır. Bu gibi maddelerin imalatı yüzeylerde karmaşık ve...

Aynı anda doğal olmayan kirlenme özellikleri korurken kovalent bağlı biyokimyasal ligandlar görüntülemek için PEG-aşılı yüzeylerin yeteneği, onları kültürü yüzeylerin 1,2,3 mühendislik özel mikro ortamlar için ideal bir seçimdir. Ligand konjüge PEG fırça tarafından aracılık biyospesifik etkileşimlerin tek hücre fenotipleri in vivo doku mikroçevrelerde kompleksi içinde bulunan biyokimyasal işaretlerin etkilerinin indirgeyici analizi sağlar. Ayrıca, biyo-dik bir &quot;klik&quot; kimyaları da yerel konformasyonun 4-6&#39;da sunulmuştur, böylece ligand yönsel hareketsiz kılınmasını temin etmek için kullanılabilir. Böylece, PEG mikro mekansal desenlendirme fırçalar hareketsiz biyokimyasal ipuçları 6,7 ile uyarılan hücre sinyallerini araştırmak için in vitro nişler tasarımcısı oluşturmak için çok yönlü bir araçtır. Biyokimyasal cu mekansal kalıplarını üretmek için ortak bir yöntemes PEG konjuge alkanetiollerin desenleri ile microcontact baskı (μCP) altın kaplı yüzeylerde gerektirir. Daha sonra, PEG-açillenmiş alkanetiollerin micropatterned kendinden düzenlenen tek tabakaları (SAMs), sadece alt-tabaka 8,9 olmayan desenli bölgelere, biyokimyasal moleküllerin, örneğin, protein fiziksel adsorpsiyon kısıtlar. Bununla birlikte, bu teknikle üretilen SAMs uzun vadeli hücre kültür ortamında oksidasyona duyarlı olan. Böylece, SAMs alkantiyol μCP&#39;d genellikle daha fazla bölgenin olmayan kirlenme istikrarı 10 arttırmak için yüzey başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP) kullanılarak PEG polimer fırçalar ile aşılanmış. Özellikle, μCP alkantiyol polimerizasyon başlatıcı, poli SI-ATRP (etilen glikol) metil eter metakrilat (PEGMEMA) monomerlerin ve ardından altın kaplı yüzeylerde ω-meraptoundecyl bromoizobutirat micropatterned uzun süreli, istikrarlı, ve non yüzeyleri oluşturur kirlenme PEG fırçalar. Ayrıca, bu<html> bundan başka çeşitli kimyasal kısımların 11 sağlamak için modifiye edilmiş olma yeteneğine sahiptir. Bu özellik, Sha et yararlanarak. ark. dik &quot;tık&quot; kimyaları sunulması çok bileşenli PEGMEMA fırçalar ile kültür substratları mühendisi için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, bunlar sıralı sodyum azid, etanolamin serpiştirilmiş μCP / SI ATRP bir dizi aşama kullanmak, ve birden fazla hareketsizleştirilmiş ligand 6 mikro desen gösteren kültür tabakaları oluşturmak için nükleofilik sübstitüsyonu propargilamin. Yeni kültür sübstratları mühendislikten geçirilmesi için indirin μCP ile bağlantılı olarak, kimyasallar kullanıldığında potansiyel büyük olsa da, çok sayıda μCP aşamalar, tek bir alt-tabaka üzerinde düzenlenebilir hangi kesinlik ve doğruluğu sınırlıdır. Hassasiyet ve doğruluk yüksek düzeyde tekrarlanabilir bu çok yönlü teknikler kullanılarak in vitro nişler kompleksi üretimi için gerekli olacaktır. e_content &quot;&gt; Bu sınırlama çözmek için, bazı otomatik ve yarı-otomatik μCP sistemleri al.. Çakra ve diğ. üretilen özel pulları bir ray sistemi üzerindeki izlenerek ve altın-kaplı slaytlar konformal temas ettirildiği bir μCP sistemi geliştirilmiştir Bir bilgisayar kontrollü pnömatik aktüatör. Bununla birlikte, bu yöntem, özel damga tasarımlar hassas imalat gerektirir ve çok μCP 12 adım yaparken elde doğruluğunda bir rapor ile birlikte 10 mikron hassas bildirir. Daha yeni olarak, entegre bir kinematik bağlantı sistemini kullanan bir metodu rapor, tek bir desen kullanarak 1 um altında hassas, ama nedeniyle 13 kalıp kalıp damga özelliklerin hassas kontrol eksikliği doğru birden çok desen hizaya koyamadık. Ayrıca, önceki yöntemlerin her ikisi de desenlendirme adımları arasında sabit kalmasını tabakayı gerektirir , böylece önemli ölçüde olabilir yüzey modifikasyonu kimyaları çeşitliliğini sınırlayıcıkullandı. Damga tasarım ve üretim maksimal esneklik verirken Burada, birden çok μCP adımların doğru ve kesin bir uyum otomatik R-μCP sistem yetenekli açıklar. Ayrıca, desenli yüzeyler defalarca böylece sıralı nükleofilik değiştirmelerin dahil olmak üzere çeşitli substrat modifikasyonu kimyaları, kullanımına izin veren, stampings arasındaki sistemden kaldırılabilir. Bu tür kimyasallar kullanıldığında mühendislik Yüzeyleri hem de bize 6,14 ve diğerleri 7 tarafından önceden hücre kültürü için kullanılmıştır. Böylece, karmaşık ve micropatterned biyokimyasal ipuçları ile kültürü yüzeylerin ölçeklenebilir üretimi için bir yöntem geliştirmek için Ar-μCP ve sıralı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonları birleşti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Manuel hizalama μCP tekniklerinin kullanılması dik işlevselleştirüerek PEG-aşılı fırçaları Dizilerle kültür substratları mühendisi kimyaları önceki çalışmalarında 6 kanıtlanmıştır &quot;tıklayın&quot;. Bununla birlikte, bu desen yönlendirme minimum kontrol sağlar ve genellikle fonksiyonalize alanlarında örtüşme ile sonuçlanır. Burada, yeni bir Ar-μCP sistemi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için kullanılır ve onun yetenek için doğru model 300 mikron ID ve 600 mik...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K Görüntüleme.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Video: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Biyomühendislik

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Biyomedikal Uygulamalar için Süperhidrofobik Polimer Malzemeler imalatı

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Pamuk Analitik Cihazlar imalatı

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Sıralı 3D-3D Kaydı Nı Kullanarak Dört Boyutlu CT Analizi

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Robotik Mikroenjeksiyon Kullanarak Beyin Dilimlerinde Tek Nöral Kök Hücre ve Nöronların Manipülasyonu

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...