The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

NOT: Tüm hayvanların barındırıldığı ve kurumdaki hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) uyarınca kullanılmalıdır. Burada açıklanan tüm işlemler Case Western Reserve Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmıştır. 1. Transgenik Hayvanlar <ol><li> Aksonlar (Thy-1 YFP H) 50 ve mikroglia / monositler etiket piyasada mevcut floresan muhabiri fareler kullanın (CX3CR1 GFP / GFP 51; malzemelerin listesine bakınız). Bu fareler intercrossed ve kurumsal hayvan bakım politikalarına göre bireysel üreme kolonilerinin olarak muhafaza edilmelidir. </li></ol> 2. Kemik İliği Chimeras <ol><li> Alıcı hayvan olarak kullanma yaşı en az 8 hafta olan hayvanları tanımlamak. </li><li> Hatta, tüm vücut ışınlaması sağlamak için bir konumda fare tutmak için tasarlanmış bir dairesel ışınlama tutan kafeste konak hayvanları yerleştirin. </li><li> Bir sezyum üzerine zamanlayıcı ayarlayın (Cs-137) ışınlayıcı bir tüm vücut radyasyon dos yönetmek içinÜreticinin talimatlarına uygun olarak, hayvanlara 800-1.000 Rads yaşı (Burada gösterilen örnekler 980 Rads vardır). </li><li> 4 saat en az dinlenmek için kafeslerine hayvanları dönün. </li><li> Uygun genotip verici hayvanlar seç iliği projenitör hücrelerin kaynağı olarak (Şekil 2A &#39;ya bakınız). NOT: Uygun donör farklı hücre popülasyonlarının, ya da kontroller aynı genotip birini tanımlamak için ana bilgisayardan farklı soy-spesifik floresan gazetecilere ifade hayvanlardır. </li><li> Bir Petri% 70 alkol ile çanak ve 10 ml Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) medya ve medyada batırılmış bir 40 mikron hücre süzgecinden ile ikinci tabak doldurun. RPMI medya ile bir 15 ml konik tüp doldurun. Buz üzerinde yemekleri ve tüp tutun. </li><li> Kurumsal kurallarına göre CO 2 boğulma donör hayvanlar Kurban. Tüm kürk ıslak kadar% 70 etanol ile tüm hayvan iliklerine cildi ve kürk temizleyin. </li><li> Sk kaldırorta bölümünde etrafında kesme ve tam bacak kaslarını ortaya çıkarmak için arka ayakları üzerinde cildi aşağı doğru çekerek hayvanın alt yarısında gelen. </li><li> , Kemik yerinden sonra steril forseps ve makas, kabuğu kullanarak ve tibia her iki ucunda uzak kasları kesmek için diz ekleminde anterior fazla uzaması ile tibia çıkarın. Ortamı içeren bir Petri kabı içinde hücre süzgecinden transfer sonra 30 saniye boyunca bir alkol ile Petri kabındaki kemik yerleştirin. </li><li> Kalça eklemini yerinden ve femur bağlı kasları soymaya, alkol femur kısaca yerleştirilir ve daha sonra çanak içinde aynı hücre süzgecinden koyun. </li><li> Bir doku kültürü kaputu, kemiklerin her iki ucunu kesti ve kemik ucunu bir 1 ml şırınga üzerindeki bir 21 iğne eklemek için steril makas kullanın. Medya ile 15 ml&#39;lik konik içine iliği yıkayın. Kalan kemikler için prosedürleri tekrarlayın. </li><li> 3 ml şırınga pistonu arka kullanarak, ezilme, kemik hücresinde biterpetri üzerinde süzgeç daha fazla hücre elde etmek. </li><li> 50 ml konik tüp üstüne filtreyi yerleştirin ve 15 ml konik tüp aspire hücreler ile medya aktarın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere kemik iliği ezmek için, pistonun geri kullanın. 15 ml konik tüp, kemik parçaları ve 50 ml konik bir tüp içine ortam 30 ml hücre süzgecinden yıkayın. </li><li> Pelet hücreleri, 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücreler santrifüjleyin. </li><li> Amonyum Klorür-potasyum (ACK) 2 ml ile lizleyin kırmızı kan hücreleri, 2 dakika boyunca liziz tamponunda. % 10 fetal sığır serumu içeren ortamda 10 ml liziz tamponu söndürüldü. 500 xg 5-10 dakika süreyle santrifüj pelet. </li><li> Her bir yıkama için pelet haline getirmek üzere, 5-10 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj, tuzlu su içinde iki kez RPMI ortamında 10 ml bir kez hücreler yıkanır ve. </li><li> Tuzlu su, 200 ul içinde 3 x 10 6 hücre bir nihai konsantrasyona kadar tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> IRR kuyruk ven enjeksiyon yoluyla Transferi 3 x 10 6 iliği hücreleriadiated alıcı fareler. </li><li> Alıcı kafeste asitleştirilmiş su (pH 3.0), koyun ve fare kurtarmak için izin verir. NOT: transplantasyonu sonrası 10-14 gün içinde ölecek başarısız Fareler. </li><li> 8 hafta sonra, akış sitometri (Şekil 2B-C) ile periferik kan bağışıklık hücrelerini inceleyerek iliği sulandırılması doğrulayın. </li></ol> 3. Sırt Sütun Crush Yaralanma NOT: Uygun chimera hayvanları veya istenilen deneye dayalı cerrahi çift transgenik hayvanların seçin. Ya etiketli ikamet veya kemik iliğinden elde edilen hücrelerle Hayvanlar önceki adımlarda oluşturduğunuz bulundu. <ol><li> Hazırlayın ve rongeurs dahil cerrahi aletleri, otoklav, Dumont # 4 forseps, iris makas, holding dokular, iğne sürücüleri ve yara klipleri için forseps. </li><li> Ağrı kontrolü için farelere yönetmek için ilaçlar hazırlayın. Bupernex ve Marcaine yaygın ağrı kontrolü için kullanılır. Gerektiği gibi uygun ilaçlar kullanınnd Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış. </li><li> % 4 izofluran ile anestezi øndükle ve min başına 60-100 nefes bir nefes oranını elde etmek için% 1-2 izofluran ile korumak. Anestezi altında kuruluğunu önlemek ve ayak tutam tarafından tepki eksikliği onaylamak için hayvanın gözlerine göz yağlayıcı. Bir ısıtma pedi kullanarak sıcaklığını korumak ve bir rektal prob kullanılarak sıcaklığını izlemek. </li><li> Hedeflenen omurilik seviyesinin üzerinde bir elektrikli tıraş makinesi ile fare arka Tıraş ve daha sonra iki kez% 70 alkol takip povidon-iyot ile alanı üç kez çubukla. Steril bir örtü üzerinde hayvan yerleştirin ve cerrahi siteyi görselleştirmek için uygun bir konumda kesilmiş bir delik ile başka bir steril örtü ile hayvan kapak. Ameliyat boyunca steril örtüler üzerinde tüm araçları koruyun. </li><li> Hayvan arkasındaki kas maruz iris makas ile istenilen spinal düzeyde orta hat boyunca cildi kesin. </li><li> Bir diss altındamikroskop etkilemeden, trapez ve dorsal spinal süreçleri eklemek orta hat boyunca latissimus dorsi ligamanlarında dahil sırt kasları, kesip, ve vertebra sütun maruz. </li><li> Belirli vertebra lamina ortaya çıkarmak için vertebra dorsal ve enine süreçleri arasındaki rotator kasları çıkarın (bu durumda T11) kaldırılacak. Bu süreçte üzerine son olmayan yüzen kaburga sokulmasıyla T11 belirleyin. </li><li> Kaldırılacak süreci üstünde ve altında uzaya rongeurs ipuçları yerleştirin ve emin onlar omurga zarar çok derin vertebra lamina etrafında yerde güvenli ama yapmak için biraz kaldırın. Tek harekette yakın rongeurs lamina kaldırmak için. </li><li> Kalan vertebra küçük parçalarını kaldırmak için rongeurs kullanarak gerektiği gibi laminektomi büyütün. </li><li> Bir cetvel karşı tutarak ve kalıcı bir kalem ile işaretleyerek bir 4. forseps ipuçları 1 mm ölçün. Ayırma bahiste 1 mm ölçüncetvel karşı forseps tutarak iki uçlarını ween ve forseps milin üzerine yerine bir lastik forseps halka kaydırarak 1 mm ipuçları maksimum genişliğini düzeltmek. </li><li> Omuriliği erişmek için forseps uçları iki ekleme noktasında dura ile 30 iğne takarak küçük bir delik oluşturun. </li><li> Işareti dura üzerinde emin, forseps tarafta işaretlenmiş 1 mm derinliğe kadar deliklerden dura bir 90 ° açıyla forseps uçlarını takın. Forseps kapatın ve 10 saniye tutun sıkıştırın. Yayın ve tekrar forseps üç tutan toplam iki kez daha sıkın. Omurilikten forseps çıkarın. </li><li> Yaralanma sitesi üzerinden tuzlu ve yerinde emilebilir jelatin sünger sıkıştırılmış bir parça bekletin. </li><li> Bir çalışan dikiş kullanarak, # 4 sentetik olmayan emilebilir dikişlerle naylon ile laminektomi üzerinde yer kas ve batırılmış jelatin sünger sütür. </li><li> 5 mm&#39;lik yara cli kullanarak yerinde cilt Klipps. </li><li> Kas gluteus kas içine 10 ul Marcaine 490 kesi yeri etrafında tuzlu subkutan ul ve 5 ul Bupernex (0.1 mg / kg) (1.0 mg / kg) enjekte edilir. </li><li> Hayvan sıcak pad üzerinde kurtarmak ve arka bacaklarda herhangi bir harekette zorluklar veya felç belirtilerini izlemek için izin verin. Tam anestezi kurtarıldı kadar gözetimsiz veya diğer hayvanların varlığında hayvan bırakmayın. Gözlemlenebilir motor açıkları görüntüler herhangi bir hayvan kullanmayın. NOT: Bu ezilme lezyon omurilik boyunca herhangi bir düzeyde yapılabilir rağmen, pratikte, T10-L4 nefes ve kelepçeler kullanarak vücut hareketini stabilize göre görüntüleme için daha az teknik zorluklar oluşturmaktadır. Kelepçe yerleştirme torakal düzeyde görüntü göğüs kafesinin etrafında modifiye edilmelidir. </li></ol> 4. Intravital Görüntüleme <ol><li> Hazırlayın ve doku, iğne d tutmak için Dumont # 4 forseps, iris makas, forseps, cerrahi aletler, otoklavnehirler ve yara klipleri. </li><li> Izofluran ile daha önce olduğu gibi fare anestezisi. % 4-5 anestezi øndükle ve dakikada 60-100 nefes bir nefes oranı ve ayak tutam yanıt eksikliği korumak için gerektiği gibi% 1-2 korumak. , Isıtmalı fare tutun görüntüleme değil nefes oranını izlemek ve sürekli bir rektal prob ile hayvan sıcaklığını izlemek. </li><li> Alkol daha sonra yara Betadine ile klipleri ve etrafındaki deriyi temizleyin ve üretici talimatlarına göre yara klipleri çıkarın. Yara klipler çıkarıldıktan sonra, gerekirse Nair ile tüylerden ve povidon-iyot ve% 70 alkol ile tekrar siteyi temizleyin. </li><li> Makas ile cilt yeniden açın. Kas kalan sütür çıkarın ve gerekirse makasla kesme, forseps ile ayrı kas çekin. </li><li> Omurilik üstünde ve altında Lami vertebra bir vertebra düzeyinde enine süreçlerin tarafında makas ile keserek kasın kelepçeleri için bir mikroskop altında, cepler oluşturmaknectomy. </li><li> Bu omur her etrafında kelepçeleri yerleştirin ve sıkın. Omuriliği ulaşmak için mikroskop amaç için oda izin gerektiği gibi ayarlayın. Spinal kord görüntüleme platformu paralel olduğundan emin olun ve görüntüleme için doku istikrarı korumak. Solunum artefakt görülürse, görüntüleme alanında hareket aza indirmek için buna göre kelepçeleri yeniden ayarlayın. </li><li> Parafilm kelepçeleri örtün. </li><li> , Forseps ile omurilikten emilebilir jelatin sünger sıkıştırılmış çıkarın ince de mümkün olduğunca meninkslerden yerinden kadar skar dokusu kaldırarak, mümkün olduğunca çok sayıda parça kapalı alıyorum. Gerekirse Kapak tuzlu ve yeni sünger ile omurilik maruz. NOT: Herhangi bir kanama sünger ile sadık ya da gerektiği gibi dağlamak ya, çevredeki kas oluşursa. Ancak, koter ile omurilik dokunmamaya özen gösterin. Dağlama sırasında nemli dokusu veya jelatin sünger sıkıştırılmış bir parça ile ya omuriliği örtün. </li><li> Bir wel oluşturunl İlk omurilik sahibinin iki kelepçe ve hayvan taraflar arasında iyi kurmak için diş akrilik kullanarak daha sonra Vetbond ile deri ve doku sızdırmazlık, tarafından daldırma sıvısı tutun. Akrilik tedavileri kadar bekleyin. </li><li> Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile kuyu doldurun ve cerrahi site çevresinde kanama herhangi tekrar kontrol edin. </li><li> İsteğe bağlı bu noktada, görüntüleme sırasında kan damarlarını vurgulamak için kuyruk ven enjeksiyon yoluyla intravenöz floresan gemi boyaları enjekte. NOT: kuantum noktaları ve floresan etiketli lektinleri olarak da yararlı gemi boyaları hizmet rağmen 70 kDa üstünde Floresan dekstran sıklıkla kullanılır. 150.000 WM TRITC-dekstran 50 ul, tipik olarak intravenöz yolla enjekte edildi. </li><li> Fizyolojik olarak uygun immün hücre motilitesini elde edilmesi için, fare ve sıcaklık 37 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. Görüntüleme için mikroskop altında bir sıcaklık kontrollü bir ortamda fareyi hareket ettirin ve doğru Anes için hayvan izlemeknefes hızı ve ayak tutam tarafından hipestezi seviyesi. Dakikada 100 nefesten - 60 bir solunum hızı elde etmek amacıyla, anestezi derinliğini belirlemek için görüntüleme sırasında sık sık hayvan izleyin. </li><li> Mikroskop mercek aracılığıyla görüntüleme sitesini bulun. </li><li> Dinamik görüntüleme verileri elde etmek z-yığın görüntüyü her 30-60 sn almak için 2-foton lazer tarama mikroskobu ayarlayın. </li><li> Görüntüleme oturumu tamamlandıktan sonra ısıtılmış kutusundan hayvan kaldırmak. </li><li> Spinal kelepçelerini gevşetin ve kelepçeler fareyi çıkarın. Kelepçeler çıkarırken deriden de uzak akrilik çekin. </li><li> Fare tekrar görüntüsü gerekiyorsa, omurilik üzerinde tuzlu batırılmış jelatin sünger sıkıştırılmış yerleştirin. Cerrahi sitesi üzerinden kas ve cilt kapatın. Anestezi kurtarma sırasında gözetimsiz bırakmayın hayvan veya diğer hayvanların varlığında yok. Hayvan kurtarma sonra nörolojik belirtisi gösterirse, hayvan ötenazi edilmelidir. Aksi takdirde, euthanizebir CO2 odası içinde fare bu IACUC onaylı ötenazi protokolüne uygun olarak anestezi ortaya çıkmadan önce. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek görüntü analiz yazılımı kullanarak floresan görüntüleri analiz. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Gerçek zamanlı olarak patolojiyi izleyen sırasında kendi doğal doku bölümlerinde farklı hücre tiplerinin Görüntüleme etkileşimleri büyük ilgi yarattı. MSS, hücre-hücre teması yoğun ağ içinde ve komşu hücrelerle sinyal normal fonksiyon ve MSS patolojiyi anlamak için gereklidir. Burada, spinal kord mekanik lezyon içinde hücresel hareketin gözlem için 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanımı nitelendirdi. Cerrahi ve doku hazırlık kalitesinin yanı sıra, doku mekanik stabilite başarılı time-lapse mikroskobu, hareket objeyi nefes spinal kord özellikle izolasyonu için her şeyden önemlidir. Stabilite hayvanın kalp atış hızı ve solunum tekabül eden bir mikroskop altında, omurilik hareketi için ideal ile değerlendirilebilir. Cerrahi performans ve ayrıca görüntüleme başlamadan hemen önce ise Kararlılık hem değerlendirilmelidir. Anima Eğerl ayarlamaları omurilik kelepçeler yerleştirme ve gerginlik yapılmalıdır, istikrarlı değildir. Kemik iliği kimera yaklaşımları ile birlikte hücre tipi özel flüoresan raportör fare modelleri mikroglia ve akson karşı monositik hücrelerin tanımlanmasına izin vermiştir. Önceki çalışmalar, kan türevi monositler ve mikroglia burada 43 tarif metodoloji kullanılarak travma sonrası ikincil akson hasar için sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Dextran&#39;ın konjuge damar boya hem işaretlerini sağlamak ve damar bütünlüğü ihlalleri tespit etmek damar tanımlama sağlar. Uygun flüoresan raportör fare modelinde seçimi arzu edilen hücre tipleri uygun bir şekilde tanımlanması görüntülü izin vermek için çok önemlidir. Üstlenilen çalışmalar için uygun floresan fare modellerinin geliştirilmesi de deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. CX3CR1 + / GFP iki fagositik nüfus ayırt </sup&gt; MSS hücreleri geleneksel zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi, ortak bir immünolojik teknik, ışınlama kimeralar, kemik iliği türevli makrofajlar radyo dayanıklı, merkezi sinir sistemi yerleşik mikroglia ayırmak için kullanılabilir. ışınlama işlemi hücre fenotipleri kan beyin bariyerini zarar ve değiştirme potansiyeline sahiptir, bu nedenle bu modelin kullanımı dikkatle düşünülmelidir. Bu değişikliklerin ölçüde radyasyon dozu hem de geri kazanım dönemi süresi farklıdır ve farklı ateşli modelleri üzerindeki etkisi tam olarak incelenmemiştir. merkezi sinir sistemi, kan-beyin bariyeri ile ışınlama etkileri uygulama sırasında kafa koruyucu ile minimize edilebilir ve bu, omurilik, doğrudan 52 korunmamış olsa bile, aydınlatmadan sonra, omurilik içine, hücre sızmasını azaltmak için gösterilmiştir. Burada kimera oluşmasının bir sonucu olarak kalıcı halde CNS&#39;ye nüfuz eden hücre sayısı uyuşmuş aksine önemsiz olduğunu gözlemiştirlezyon giren hücrelerin er. Dikkate diğer alternatif modeller ilaca bağlı kimeralar 52 veya Parabiyotik fare modelleri 53 içermektedir. Burada, biz 2-foton mikroskopi kullanılarak görüntü kolay omurilik dorsal beyaz cevherde bir lezyon ile sonuçlanan, belirli basit ve tekrarlanabilir küçük yaralanma modeli sunduk. Bu yöntem aynı zamanda literatürde tamamlayıcı sabit doku analizi 16,18,43,48,54 ile birleştiğinde olmuştur dorsal sütunları aksonal kurumaları derecesini tahlil için ölçülebilir lezyon sağlar. Bu modelde, hayvanlar sadece asgari açıkları görüntülemek ve yaralanma sonrası özel bakım gerektirir. Burada anlatılan dorsal kolon ezilme yaralanması ve görüntüleme teknikleri kullanılarak gelecekteki çalışmalar spinal kord yaralanması tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için güçlü tarama araçları olabilir. Bu tedaviler, küçük molekül inhibitörleri, ilaçlar, hücre ürünleri, doku greftleri ve kombinasyon tedavisi bulunabilirs. makrofajlar, mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşim ayrıca, çoklu skleroz, tümör, menenjit ve amiyotrofik lateral skleroz, omurilik diğer hastalık modellerinde, bir rol oynaması olasıdır ve bu teknik de bu hastalıkların incelenmesinde yararlı olabilir .

merkezi sinir sistemi (MSS) hastalık veya yaralanma iltihabi reaksiyon kötü, özellikle doku içinde bağışıklık ve yerleşik hücreleri arasındaki etkileşimler açısından, anlaşılmaktadır. Omurilik bu hücresel etkileşimler araştırmalar canlı bir hayvanda özel bir öneme sahiptir. Sadece kolayca erişilebilir MSS beyaz cevher yolu bu mümkün deneysel yaklaşımı geliştirmeye çaba için önemli bir alan yapım, omurilik dorsal sütunlar bulunmaktadır. Bu araştırmalar nedeniyle erişmek ve görüntüleme için MSS stabilize teknik zorluk sınırlı olmuştur. Omurilik Canlı görüntüleme ilk tetkikten sonra birkaç saat ötesinde bir omurilik yaralanması önce, ancak, birkaç çalışma 1-13 ele hücresel hareketi tarif edilmiştir. travmatik omurilik lezyon nöronlar, astrositler, fibroblastlar, NG2 progenitör hücreleri ve bağışıklık hücreleri includi ile, karmaşık bir ortamdırmikroglia, nötrofiller, makrofajlar, T-hücreleri, B hücreleri ve dendritik hücreler 14,15 ng. Makrofajlar dolaşımdan infiltre lezyonda fagositoz sorumlu bağışıklık hücrelerinde, bir alt kümesidir. Bu fagositik hücrelerin rolü bu hücrelerin yaralı dokuda hasar ve koruyucu rolleri hem alabilir belirten raporları ile tartışma konusu olmuştur. Bu roller yaralı hayvan 21,23,24 fonksiyonel açıklarının bir yara alarak fenotip şifa ve azalan bir yaralanma sonrasında sekonder aksonal tepe kurumalarına artan ve bir fagositik bir şekilde 16-22 hareket aralığı. Daha önce, öncelikle sağlıklı dokuda morfolojisi dayanıyordu mikrogliada gelen makrofajlar ayırt çalışır. Ancak, aktif mikrogliya ve makrofajlar aynı belirteçlerin birçoğu ifade ve bas çalışmak zordur, bu hücrelerin farklı etkinlikler ayrılmasını yapma, yaralanma 25-29 sonra ayırt morfolojisi gösterilecek30 yalnız bu faktörlere ed. Bu yaklaşım, in vivo olarak, bu hücre tiplerinin ayırt edilmesi daha az yararlı olmasına rağmen, bu hücreler, 33,34, akış sitometrisi kullanılarak CD45 ayırıcı ifadesi ile ayrılabilir. Monositler gibi bu belirteçlerin ifadesi dinamik değişimler doğru analiz 35,36 komplike edebilir makrofajlar içine ayırt rağmen mikroglia ve makrofajlar içinde CCR2 ve CX3CR1 ve kullanmak diferansiyel ifadesi de, araştırılmaktadır. Makrofajlar kemik iliği atalarıdır türetilen ve bir hakaret 31,32 sonra yaralı MSS girmek sırasında mikroglia, MSS ikamet bağışıklık hücreleri ve fetal gelişim sırasında sarısı kesesi atalarıdır kaynaklanmaktadır. Bu iki hücre tiplerini ayırt etmek morfoloji kullanarak alternatif bir yaklaşım MSS ikamet korurken, donör atalarıdır türetilen makrofajlar izlenebilir işaretleyici ifade eden bir donör hayvandan atalarıdır ile kemik iliği değiştirmektir, tilki kuyruğutakabilir türetilen mikroglia. Bu kemik iliği kimerik modelleri yaygın pek çok diğer uygulama 37-40 kullanılmaktadır. Bu yöntem, bu nedenle belirli uygulamalardaki kullanımını sınırlamaktadır konakçıda, ilik progenitörlerinden ortadan kaldırmak için, kullanılan ışıma ya da sitotoksik ilaçların neden olduğu kan-beyin engelinin bütünlüğüne hasar ile ilişkili benzeri olmayan uyarılar yer alır. Son zamanlarda, MSS mikroglia ve makrofajlar arasındaki işlevsel farklılıklar flow sitometri, gen çip dizisi analizi ve gelecekte çok yararlı olacağını kimerizm yöntemleri 24,26,41-44 kullanarak ayırt edilmesi başlıyor. Bu iki hücre tipleri ayıran zor olmasına rağmen, kendilerine özgü işlevleri anlamak CNS içinde hem de mikroglianın ve makrofajlar içeren bozuklukların daha hedefli tedaviler yol açan önemlidir. Spinal kordon hasarı hücresel etkileşimler Açıklaması ilk olarak hücre kültürü modelleri çalışmalardan elde gelmiştir. Bu dcanlı bir hayvanda bir araya görüntüleme spinal kordon hasarı ve bağışıklık hücreleri ile ilgili sorunlara vi. Değişen tipine ve şiddetine spinal kord yaralanması Güncel kemirgen modelleri kontüzyon modelleri 45,46, pin-prick yaralanmalar 2, laserasyon 47, ve burada 16,18,48 açıklanan dorsal kolon ezilme yaralanması bulunmaktadır. Meninkslerde Enflamasyon yaralanma şiddeti artar ve seri görüntüleme için pencere veya cerrahi implantasyon için benzersiz zorluklar oluşturmaktadır. Bu sorunlardan bazıları fagositik hücrelerin infiltrasyonu yanı sıra cerrahi sitesi üzerinden fibröz doku oluşumunu içerir. Dorsal kolon ezilme yaralanması incelemek için buraya yapıldığı gibi, bu konuların bazıları, küçük lezyonlar oluşturmak ve dura ve sonraki yeniden açılması ameliyatı için izin paraspinöz kaslar arasındaki olmayan bağışıklık cerrahi pansuman ile maruz omurilik kapsayan üstesinden gelinebilir . Spin görüntü sadece dorsal kısmı yeteneğikontüzyon modelleri öncelikle sık yaralanma 45,49 sonra özellikle erken zaman noktalarında, sırt sütunların en dorsal kısmını koruyucu, merkez kordon zarar beri el kablosu da, yaralanma seçim sınırlar. Bu nedenle, lezyon içi ve lezyona aksonal konumda kolayca ölçümü için hücre hareketinin gözlenmesi için yararlıdır olan temiz, tekrarlanabilir, dikdörtgen şekilli bir lezyon verir, basit bir yaralanma modeli açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:125px;">Name</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:240px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">CX3CR1 GFP mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">5582</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Thy-1 YFP H mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">3782</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Mouse pie cage</td>
			<td style="width:165px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:64px;">MPC 2 set</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">60mm2 petri dish</td>
			<td style="width:165px;">Corning</td>
			<td style="width:64px;">430166</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Falcon 40 um cell filter</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">08-771-1</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:125px;">1x15mL and 1x50mL conical tube</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">16 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305177</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">309628</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">A10492-01</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">1E+07</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:125px;">RPMI media</td>
			<td rowspan="2" style="width:165px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">R8758</td>
			<td rowspan="2" style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">F4/80 antibody</td>
			<td style="width:165px;">Ebioscience</td>
			<td style="width:64px;">12-4801 PE</td>
			<td style="width:240px;">For FACS verification of chimeras</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30-gauge insulin syringe&#160;</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">328280</td>
			<td style="width:240px;">For tail vein injection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Spinal Cord Clamps</td>
			<td style="width:165px;">Narshinge</td>
			<td style="width:64px;">STS-A</td>
			<td style="width:240px;">For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic powder&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1320</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1404</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Gelfoam gelatin sponges</td>
			<td style="width:165px;">Pfizer</td>
			<td style="width:64px;">9E+06</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">4-0 Ethilon sutures</td>
			<td style="width:165px;">Ethilon</td>
			<td style="width:64px;">1667G</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Reflex Clips, 7mm</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS750344</td>
			<td style="width:240px;">For surgery. Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">14061-09</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">45/5 Forceps, Dumoxel</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11251-35</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">16021-14</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305106</td>
			<td style="width:240px;">For making access holes in dura</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Forceps Dumont #4 Biology tips</td>
			<td style="width:165px;">Dumont</td>
			<td style="width:64px;">11242-40</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Needle Drivers</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12002-12</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Michel Wound Clip Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS700753</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Wound clip remover</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12033-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">O-rings for Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11200-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Cordless Rechargable Animal trimmer</td>
			<td style="width:165px;">Wahl</td>
			<td style="width:64px;">Series 8900</td>
			<td style="width:240px;">for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Vetbond</td>
			<td style="width:165px;">3M</td>
			<td style="width:64px;">1469SB</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td>
			<td style="width:165px;">Purdue Products L.P.</td>
			<td style="width:64px;">NDC 67618-150-08</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Nair Hair remover lotion</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td style="width:64px;">NRSL-22329-05</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:165px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:64px;">NDC 11695-6776-2</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Marcaine</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">6E+06</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Bupernex</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">121-7793</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="345" rowspan="6" style="height:345px;width:125px;">aCSF</td>
			<td rowspan="6" style="width:165px;">Chemicals from Sigma</td>
			<td style="width:64px;">119 mm NaCl</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:64px;">26.2 mM NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">From Cold Spring Harbor Protocols</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:64px;">2.5 mM KCl</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:64px;">1 mM NaH2PO4</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:64px;">1.3 mM MgCl2</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">10 mM glucose&#160;</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">TRITC-dextran 150,000 MW</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">T1287</td>
			<td style="width:240px;">For intravenous administration to label vasculature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Dorsal kolon ezmek lezyon gösteren bir şematik Şekil 1A gösterilmiştir. Lezyon sonra hayvan hazırlanır ve spinal kelepçeleri (Şekil 1B) kullanılarak intravital mikroskobiyle için stabilize edildi. Dorsal kolon ezilme yaralanması hemen sonra çekilen bir görüntü açıkça belirtilmektedir forseps tine ekleme noktaları ile açıkça görülebilir dikdörtgen lezyon gösterir. Yara bölgesinde Aksonlar tüm sırt kolonu (Şekil 1C) süresi boyunca ayrılır. kan damarlarının bütünlüğü bozulmadan kalır ve damar Sızıntı hiçbir kanıt floresan sayesinde ispatlanmıştır. Hafta boyunca aynı lezyonun seri görüntüleme gerçekleştirmek için, kaslar ve cilt sonra yeniden maruz kalma laminektomi üzerinde dikilebilir. Benzer lezyon morfolojisi sonra zaman noktalarında (Şekil 1D, E) görülür. 5 gün yaralanma sonrası, forseps ekleme siteleri hala görünür ama lezyon boyutu d artmaya başlamıştırinflamasyon nedeniyle ikincil yaralanma vi. Lezyonun kuyruk ucundaki akson &quot;aksonal geriye doğru kurumaların yaygın&quot; denilen bir işlem yoluyla yaralanma ilk siteden geri gelmiş. Lezyonun rostral sonunda aksonlar Wallerian gibi dejenerasyon (Şekil 1D, E) sergiledi. Gün 5 ve yaralanma sonrası 22 arasında, lezyonun büyüklüğü stabilize. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bu hücrelerde (makrofajlar karşı mikroglia) kimlik hazırlanmasında ayırt edilemez, ancak eş zamanlı olarak, CX3CR1 + hücrelerinin büyük bir akışı, ve bu zaman noktalarının sırasında ezilme lezyon çevresinde infiltre görülebilir. Ezilme lezyon mikro-içinde mikroglia ve makrofajlar davranışını ayırt etmek için, bir ışınım kimera modeli (Şekil 2A&#39;da tarif edilmektedir) kullanılmıştır. İlk olarak, bir CX3CR1 + / GFP fare kemik iliği projenitör hücrelerin florenas özelliğine sahip olmayan verici cel ile değiştirilirls, böylece sadece GFP + MSS-resident mikrogliya floresan görüntüleme görebilir. kemik iliği yeniden etkinliği 8 hafta iliği nakli (Şekil 2B, C) ​​sonra periferal kan incelemesi akış sitometresi ile teyit edilebilir. Şekil 2B, F4 / 80 ve GFP pozitif makrofajlar ise, mavi vurgulanan, hangi bazı GFP negatif ama F4 / 80 olumlu monositler de mevcut, bir CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 kimerik fare tespit edilir. Şekil 2C, herhangi bir çift pozitif F4 / 80 ve GFP pozitif hücrelerinde vahşi tip kemik iliği CX3CR1 + / GFP alıcı kemik iliği değiştirilmesinden sonra bırakılır. Yaralanma önce mikrogliya eşit bir dinlenme, dallanmış morfolojisi (Şekil 2B) görüntüleme, omurilik içinde dağıtılır. 8 gün yaralanmasından sonra, sadece bir kaç mikroglia ve lezyon çevresinde tespit edilebilir. Bu mikroglia bir amoeboid morfolojisi (Şekil 2E) görüntüler. İkinci olarak, kemikBir floresan olmayan fare kemik iliği projenitör hücrelerinin, bu nedenle, kemik iliği CX3CR1 + monositleri / GFP floresan görünür makrofajlar (Şekil 2A) türetilen, bir fazla CX3CR1 + / GFP fare kemik iliği hücreleri ile değiştirilmiştir. Yaralanma önce, sadece GFP + tespit hücreler, kemik iliği kaynaklı ve sürekli olarak düzenli bir şekilde 28 (Şekil 2F) ile teslim olduğu rapor edilmiş olan, büyük ölçüde perivasküler bulunmaktadır. Ezilme yaralanması sonrasında, CX3CR1 + / GFP hücreleri lezyon (Şekil 2H-J) çevreleyen kan damarlarının iç kısmı boyunca görülebilir, ve lezyon merkezi CX3CR1 + / GFP makrofajlar (Şekil 2G) infiltre ile doldurulur. Dorsal sütunları Zaman atlamalı görüntüleme 6 saat kadar için yapılabilir. Burada dolaşımdan hücreleri görmek mümkündür Şekil 3&#39;te, yaralanmadan sonra hemen olmayan bir kimerik CX3CR1 + / GFP fare göstermektedirn lezyon çekirdeğe doğru kan damarı dışarı hareket ve yaralanma sitesinde (Şekil 3A, B, Ek Film 1) içinde hareket. Makrofajlar (; Ek Film 1 Şekil 3A, B) tarafından alınan yolları izleyebilirsiniz hücreleri tanımlamak için floresan yoğunluğu kullanan Görüntü analizi. Gibi görüntü analizi, elde edilen istatistikler lezyon makrofajların ortalama motilite 3.6 mm / dakika (Şekil 3D) olduğunu göstermektedir. Yaralanma, akson, mikroglialar ve makrofajlar sonra 22 gün hala görüntüleme alanını gösteren lezyon içinde tespit edilebilir nihayet, zaman (Ek Film 2) uzun süreler boyunca stabildir. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: Yaratılış ve dorsal kolon ezilme yaralanması sıralı görüntüleme. (A), sırtSütun ezilme yaralanması ilgi düzeyinde vertebra dorsal sürecini kaldırarak yapılır. Forseps dışında omurilik 1 mm dorsal sütuna yerleştirilir ve daha sonra mor gösterilen lezyonu üretmek için 3 kez kapalı. (B) Hayvan daha sonra omurilik ile konumlandırılmış intravital görüntüleme için istikrar elde etmek için kelepçeler. (C) Hemen yaralanma sonrası, forseps ekleme siteleri (kırmızı oval) ve dikdörtgen ezilme yaralanması hacmi (gri kutu) açıkça tespit edilebilir. Dorsal kök aksonların (beyaz oklar) yanı sıra, bir lezyon (dolu ok başları) kaudal tarafında akson yaralı uçlara görülebilir. (D) 5 gün yaralanma sonrası, forseps girme mevkilerini (kırmızı, oval ), ve lezyon (gri kutu ölçüde) hala kolayca görülebilir. lezyon ilk hakaret beri boyutu artmıştır. Wallerian gibi dejenerasyon geçiren aksonlar Additi lezyon (açık ok başları) rostralinde görülebilirdorsal kökler (beyaz oklar) ve yaralı akson uçlarında (beyaz ok başları). (E) 22 gün yaralanma sonrası akson üzerine, lezyon site hala 5 gün sonra yaralanma benzer boyutları ile tanımlanabilir. Ve hasarlı alana çevresinde CX3CR1 + hücrelerinin büyük sayısını not edin. Etiketli Özellikler (D) &#39;de olduğu gibidir. Tüm ölçek çubukları 200 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: kimerik farelerin İnşaat dorsal kolon ezilme lezyon CNS-yerleşik mikroglia veya kemik iliği kökenli makrofajlar ifade CX3CR1 + / GFP izlemek için. (A), CX3CR1 + / GFP ya da mil ifade kimerik farenin üretimi bir şematik diyagramıdırcroglia ya da makrofajlar. İlk olarak, Thy-1 YFP lH farenin ışınlanır ve kemik iliği olan makrofajlar GFP + olan bir kimerik fare ile sonuçlanan bir CX3CR1 + / GFP fareden izole edilen kemik iliği hücreleri ile sulandırılır. İkinci olarak, Thy-1 YFP lH / CX3CR1 + / GFP farelerden ışınlanır ve kemik iliği olan mikroglia GFP + olan bir kimerik fare üreten bir floresan olmayan bir fareden izole edilen kemik iliği hücreleri ile yeniden oluşturulur. (B) veri akış sitometrisi Örnek ışınlanmış, C57BL / 6 alıcıya nakledilen bir CX3CR1 + / GFP kemik iliği verici ile bir kimerik bir hayvandan alınan kan F4 / 80 + ve CX3CR1 GFP + hücreleri ile. Bir C57BL6 bir kimerik hayvanda F4 / 80 + ve CX3CR1 GFP + hücreleri ile veri akış sitometri mavi bir alan öne hem de GFP ve F4 / 80 pozitif olan CX3CR1 pozitif donörlerden elde edilen hücreler gösterilmiştir. (C), Örnek Donör iliği bir ir nakledilenYayılan CX3CR1 + / GFP alıcı. Mavi alan vurgulanan içinde çift pozitif CX3CR1 + / GFP ve F4 / 80 hücrelerinin eksikliği dikkat. (D) birinci kimerik düzeni bir fare bir intravital iki foton mikroskobik anlık, dorsal içinde dallanmış morfolojisi ile GFP + mikroglia gösteren Kolon (ok başı). Bu hücreler dorsal kök ve dorsal sütununda akson (sarı) arasında serpiştirilmiş. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (E) aynı fare Intravital görüntüleme (B) 8 gün dorsal kolon yaralanma süreçleri (ok kafa) eksik olan büyük ve şekilli amoeboid hücre gövdeleri ile bir kaç CX3CR1 + mikroglia ortaya sonra. MSS parankimi içinde yetersiz GFP + makrofajlar gösteren Ölçek çubuğu ikinci kimerik düzeni bir fare = 100 mikron. (F) Fotoğraf (A),. 100 um. 8 gün sırt kolon yaralanmadan sonra (G) (F) &#39;de, aynı fare intravital görüntüleme al ortaya = Ölçek çubuğuve lezyonun etrafında makrofajların arge akını. Ölçü bar = 100 um. (H), yaralanmamış hayvanda damarları ile temas CX3CR1 + kan kökenli hücrelerden daha yüksek bir büyütme görüntü. Ölçü bar = 30 um. Kabın iç tarafından bakıldığında kabı ile temas halinde CX3CR1 hücrelerinin (I) yeniden oluşturma. Ölçü bar = 30 um. (J), tekne ile temas içindeki CX3CR1 bir hücre yeniden düzenleme, kabın dışarıdan görülebilir. Ölçek çubuğu = 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 3 :. Hemen dorsal kolon ezmek sonra olmayan bir kimerik CX3CR1 + / GFP fare Temsilcisi hücre izleme verileriyaralanma. (A) hemen dorsal kolon ezilme yaralanması sonrası CX3CR1 + mikroglia ve Katkı Film 1 makrofajlar etrafında hasarlı aksonlar (sarı) bir anlık. (B) (gri) yolları (A) CX3CR1 + hücreleri tarafından alınan bir 110 sırasında dk Intravital görüntüleme oturumu. (C) (B) parçaların bir zaman kodlu gösterimi. Zaman çubuğunda gösterilen parçalar, bütün 110 dakika film içindeki zamana göre renklidir. CX3CR1 + hücrelerin genel motilite (D) Histogram. Tüm ölçek çubukları 30 mikron bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ek Film 1: hemen çift heterozigotlarda dorsal kolon ezilme yaralanması sonrası Temsilcisi intravital film Thy-1 YFP / + <stRong&gt; / CX3CR1 GFP / + fare. Intravital spinal görüntüleme T11 seviyesinde dorsal kolon ezilme yaralanması hemen sonra yapıldı. Sağ paneli CX3CR1 + mikrogliya ve makrofajlar hareketini gösterir. Hücre hareketinin yolları sol panelinde beyaz parça olarak gösterilmiştir. yaralanma sol üst köşesine yer almaktadır. CX3CR1 + hücreleri, bu raylar boyunca yaralanma bölgesinde doğru hareket görülebilir. Aksonlar sarı gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 40 mikron =. Toplam süre: 110 dak. Çalma hızı: 300x. Ek Movie 2:. Çift heterozigot Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + fare dorsal kolon ezilme lezyon sonra 22 gün Temsilcisi intravital film burada gösterilen 22 gün ilk dorsal kolon ezmek sonra bir fare alınan bir temsilci film Spinal düzeyde T11 de yaralanması. enjUry çerçevenin sağ üst köşesinde yer almaktadır. Aksonlar (sarı) artan rostrally sağ alt köşesinde gösterilir. dorsal ven ve kan damarları (kırmızı) TRITC-dekstran ile etiketli. Hemen yaralanma sonrası kıyasla daha yavaş bir hızda hareket lezyon içinde CX3CR1 + hücreler. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Toplam süre: 90 dk. Çalma hızı: 600x.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Video: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Sıçanların Hipokampuslarında İleri Difüzyon Görüntüleme

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Rotasyonel İvmeye Dayalı Sıçanlarda Diffüz Aksonal Beyin Hasarıİn İndüksiyonu

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...