We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

NOT: bakım ve bu yazıda tüm farelerin deney manipülasyon Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Cerrahi ayarlama <ol><li> Bir otoklav veya onaylı sterilizasyon prosedürleri kullanarak gerekli tüm araçları sterilize. En azından, bir neşter, makas, makas vanna, forseps, kuyumcu tornavida, pamuk bezlerden, retraktörlerinin bir dizi, implant (Şekil 1A) ve dağıtım sistemi (Şekil 1D, E) içerir. </li><li> % 70 etanol ve / veya uygun dezenfektanlarla, herhangi bir stereoskop kolları da dahil olmak üzere, tüm yüzeyleri silin. </li><li> Özel stereotaksi (Şekil 1D) bindirilirken ve steril örtüler ile setüstü çevreleyen bir steril alan oluşturun. Bir ısıtma yastığı (kontrollü tercihen geri bildirim) stereotaksi üstünde ve steril örtüler altına alınmalıdır. </li></ol> 2. hazırlanmasıCerrahi Fare <ol><li> Solunum hızı yaklaşık 1 nefes / sn yavaşlatır kadar bir indüksiyon odasında% 5 izofluran / oksijen altında fare anestezisi. </li><li> Izofluran pozlama devam etmek için bir burun konisi kullanılarak, steril alana uzak bir sahne alanı fare aktarın. % 2 izofluran azaltın. Kornea kurumasını önlemek için göz merhemi sürün. </li><li> Kolun, her bir enjeksiyon hacminin yaklaşık olarak% 50 veren, 30 G iğne ile 10/3 cc şırınga - kas içinden 29 ile arka ayakların içine 0.05 mg / 100 g fare de glikopirolat (bir antikolinerjik ilaç) uygulayınız. NOT: Glikopirolat fare anestezi altında iken akciğerlerde sıvı birikimini önlemek için hizmet vermektedir. </li><li> Elektrik makası kullanarak, 2 cm genişliğinde ve göğüs kemer merkezli tarafından fare dorsal, yaklaşık 3 cm uzunluğunda bir kısmını tıraş. De uzakta traş alanda herhangi kesilmiş saç temizleyin. </li><li> Traş deri altından ve uzak aşağıdaki enjeksiyon yönetme29 ile yama - 30 G iğne ile 10/3 cc şırınga: 1 ml / 100 gr fare% 5 glükoz tuzlu su içinde (hidrasyon), 5 mg / kg fare Ketoprofen (analjezi için bir NSAID), 0.2 mg / kg fare deksametazon ( antienflamatuar bir steroid) enflamasyonu azaltır. </li><li> Pamuklu kullanarak, yıkar arasında 1 dakika bekliyor, iyot ve% 70 etanol üç alternatif yıkar gerçekleştirmek. </li><li> Kesi yerinde ağrıyı azaltmak için 30 G iğne ve traş yama merkezine 3/10 cc şırınga - subkutan 29 kullanılarak% 0.125 bupivakain (periferik sinir bloğu) 100 ul yönetme. </li><li> Özel stereotaksi (Şekil 1D) Transfer fare, rektal termometre takın ve bupivakain yürürlüğe girmesi için yaklaşık 10 dakika bekleyin. </li></ol> 3. Açığa ve 3 Bitişik torakal vertebraların dorsal laminalar temizleyin <ol><li> Neşter bıçak kullanarak, faiz (Şekil 2A) ve omurlar üzerinde küçük (5 mm veya daha az) kesi oluşturun. </li><li&gt; Ya forseps kullanarak veya cerrahi makas ucu takmadan ve kolları yayarak, künt diseksiyon ile deride açılma boyutunu artırmak. </li><li> Bir neşter veya cerrahi makas kullanarak, yavaşça cilt ve altta yatan kas arasındaki bağ fasya ayırmak. </li><li> Mümkün (Şekil 2B) gibi büyük bir çalışma alanı sağlayan, cilt geri tutmak için Ekartörleri kullanın. Göğüs üzerindeki yükü artırır ve böylece nefes engel değil dikkat edin. </li><li> Forseps bir çift, kavrama örten kas yoluyla maruz kalacağı rostral-en vertebra kullanma. Bir neşter kullanarak, uzak tüm 3 vertebra (Şekil 2c) dorsal sürecinin iki tarafında doku kesti. </li><li> Bir neşter bıçak, pamuklu, ve / veya kemik kazıyıcı herhangi bir kombinasyonunu kullanarak, dorsal lamina (Şekil 2B) tüm örten doku kaldırmak. </li><li> Cerrahi makas kullanarak, dikkatle her iki Latera üzerinde omurları bağlı tendonları kesipomurganın (Şekil 2E) l kenarları. </li><li> Neşter kullanılarak, yavaşça temiz bir kıstırma yüzeyi temin etmek amacıyla, mümkün olduğu kadar vertebral kolonun yan kenarlarından kadar doku çıkarın. </li><li> Yavaşça bir kemik kazıyıcı ve / veya pamuklu çubukla kullanarak kalan yumuşak doku omurga debridman. Başka cerrahi makas (Şekil 2F) kullanarak herhangi bir yersiz doku uzak Trim. NOT: Bu sıkıştırma ve vertebra temiz maruz kaldığı dorsal laminektomi gerçekleştirmek hem de gereklidir. Bir cauterizer sonraki kanama kontrol edilmesinde faydalı olabilir. </li><li> Cilt (Şekil 2F) ek olarak omurga kolonu çevreleyen doku tutmak için Ekartörleri Shift. </li><li> Teslimat yazılarda dişleri implant yan barlar takın ve (Şekil 1E gibi) sonrası sahipleri içine bu yük. </li><li> SECUREL tutmak için yeterli basınç uygulayarak, yan çubuklar kullanarak 3 omurga Kelepçey (Şekil 2G, H) &#39;. 3 vertebra bir seviye kenetlenmesini sağlamak için forseps kullanın. Çeşitli girişimler gerekli olabilir unutmayın. Yan çubukları düzeyi ve laminektomi gerçekleştirmeden önce paralel hem de emin olun. </li><li> Dikkatle temiz ve pamuklu çubuklarla kullanarak kenetlenmiş omurların dorsal yüzeyini kurulayın. </li></ol> 4. Bir dorsal laminektomi gerçekleştirin <ol><li> Medial kenetlenmiş vertebra epidural boşluğa vannas makas ipuçlarını yerleştirin ve hafifçe kolları sıkmak; kemik kuru ise, bu sırt tabakanın uzunluğu boyunca çatlak gerekir. Lamina serbest bırakmak için karşı tarafta bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yavaşça dikkatle Lamina rostral ve kaudal ucunda herhangi bir bağ dokusu kesip ve uzak kaldırın, forseps ile dorsal işlemi ile gevşek lamina sürükleyici. </li><li> % 0.9 tuz ve / veya yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) kullanarak, iyice herhangi bir kan overlyi yıkayacakomurilik ng. Aşırı sıvıyı emmek için pamuklu bezlerden kullanın. </li><li> Vannas makas kullanarak, dikkatlice implantın yan barlar kemiğin lateral kenarlarını kırpın. Yine, yıkayacak ve pamuk bezlerden ve tuzlu / ACSF kullanarak kanamayı kontrol. </li><li> 30 G iğne - periost bir kısmı müstakil ve omuriliği örten olması durumunda, yavaşça pamuk bezlerden ve / veya 29 kullanarak bu dokuyu. Prosedürün bu bölümünde omuriliği kesmemeye özen gösterin. Sıkıca sarılmış dura mater ile gevşek periost karıştırmayın. </li><li> Dikkatle, bir veya diş akrilik ve siyanoakrilat (Şekil 2I) her iki ile kemik kalan maruz kenarları mühür. Yapıştırıcılar maruz omurilik üzerine akmasına izin vermemeye özen gösterin. </li></ol> 5. Mühür Odası <ol><li> 4 slot yan barlar 4 delikli sıraya ve açılış maruz falso örter çok dikkatli bir üst plaka yerleştirinarkadaşları kablosu (Şekil 1B ve 2J). </li><li> Kuyumcu tornavida kullanarak, dikkatle forseps başka bir çift ile tornavidanın mili stabilize, ilk vidayı başlatın. Bu aşamada vidayı sıkın, ancak ilk birkaç konuları meşgul böylece o takmayın. Diğer 3 vida için bu işlemi tekrarlayın. NOT: Bu aşamada konumunu belirlemeye vidaları yardımcı titanyum ya da diğer manyetikleştirilebilir forseps kullanmak yararlıdır. </li><li> Yerde tüm 4 vida ile, vidalar sıkıca (Şekil 2K) güvencesindedir kadar her küçük artışlarla aynı miktarda dönüşümlü vida sıkın. Üst plaka Bu işlem sırasında flex için alışılmadık bir durum değildir unutmayın. Vida başı zarar verebilir ve aşırı düşüş baskısının kelepçesini yerinden ve / veya spinal kord yaralanması neden olacak gibi, çok fazla vidaları sıkın dikkat edin. </li><li> Omurilik ve cam pencere arasındaki boşluğu doldurmak için bir silikon elastomer kullanın. O doe Çünkükür esnasında asetik asit üretmek değil s, KwikSil marka elastomer ve karıştırma ipuçlarını kullanın. Maruz omuriliğe silikon liberal kısmını uygulayın. Karıştırma ucundan önce omuriliğe uygulamaya hava kabarcıkları içeren herhangi bir silikondan kurtulmak için özen gösterin. </li><li> Hızlı çalışarak, yavaşça üst plakada içerlek içine 5 mm # 0 lamel basın. Yavaş yavaş omurilik çevreleyen sıvı elastomer sıkmak, ancak spinal kord sıkıştırma (Şekil 2L) neden değil yeterli basınç uygulayın. Elastomer saatin ayarlanması yani lamel hızla uygulanan emin olun, yaklaşık 90 sn. </li><li> 5.5 - Bir başarısız sızdırmazlık durumunda, elastomer set kadar, yavaşça forseps ile implant çıkarın ve 5.4 tekrarlayın bekleyin. </li><li> Diş akrilik / siyanoakrilat ile dönen elastomerin kenarlarını kaplayabilir ve omurilik yüzeyi üzerinde kaymasını elastomer önlemek için mümkün olduğu kadar çevre kemik yapışır. </li><li> Ekartörleri çıkarın ve implantın kenarında cilt yukarı çekin. Siyanoakrilat kullanarak, implant (Şekil 2M, N) kenarlarına cilt uygun. </li><li> Yerleştirin # 0-80 - 1/4 &quot;üst plakanın kanatlarında (Şekil 1C ve 2 O) içine vidaları ayarlayın. </li><li> Diş akrilik kullanarak, üst plaka (Şekil 2P) vida yuvaları herhangi boşlukları mühür. </li></ol> 6. Ameliyat Sonrası Bakım <ol><li> Büyük bir temiz kafese anestezi ve yerden hayvan çıkarın. Kafes odası şey yırtılmayıp şekilde yeterince büyük olduğundan emin olun kafes boyunca normal lokomosyon sırasında (bir su şişesi ve / veya gıda için V-şekilli daldırma gibi). NOT: Bir standart sıçan kafes idealdir. </li><li> Hayvan kurtarır ısıtılmış bir yüzey üzerinde kafes yerleştirin. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete fareyi iade etmeyin. </li><li> Hayvan Beha kontrolağrı veya sıkıntı ve implant bütünlüğü belirtileri için 2 saat Postoperatif - 1 içinde VIOR. NOT: Normal koşullar altında, hayvan hareketine mütevazı tedirginlikler ile ambulasyon gerekir. </li><li> Ağırlığının ölçülmesi ve davranışlarını izlemek, ilk 72 saat için 12 saat - hayvana her 8 kontrol devam edin. Hayvanlar gece boyunca aktif ve hareketli olup olmadığını kontrol edin. Şasi biçiminde ıslak yiyecek, içecek ya da besin jeller, yiyecek topaklarına ile karıştırılır yemi ve içme suyu zemin seviyesinde sağlanmalıdır. Deri altı ya da karın içinden enjeksiyonlar ek nemlendirme gerektiğinde sağlanmalıdır. </li><li> Postoperatif, 24 ve 48 saat zaman noktalarında 5 mg / kg fare ketoprofen ve 0.2 mg / kg fare deksametazon deri altından yönetme. Buna ek olarak, 0.005-0.010 mg / 100 g fare 72 saat için bir deri altından enjeksiyon ile her 8 saat kullanılmalıdır. </li></ol> 7. in vivo olarak görüntülenmesi <ol><li> Altında fare anestezisiSolunum hızı kadar bir indüksiyon odasında% 5 izofluran / oksijen yaklaşık 1 nefes / sn yavaşlatır. </li><li> Geribildirim kontrollü ısıtma pedi ile özel stereotaksi (Şekil 1D) fare aktarın ve rektal termometre yerleştirin. % 2 izofluran azaltın. </li><li> Kolun, her bir enjeksiyon hacminin yaklaşık olarak% 50 veren, 30 G iğne ile 10/3 cc şırınga - 29 ile arka ayakların içine glikopirolat, 0.05 mg / 100 g fare intramüsküler uygulayın. </li><li> Deri altından tuzlu su içinde 1 ml / (hidrasyon) 100 g fare% 5 glukoz kez saat başına uygulayın. </li><li> Cerrahi (Şekil 1F) için kullanılan post-yuvalarına dişli odası sahipleri yerleştirin. Yüksekliğini ayarlayın ve üst plaka set vida üzerine mesajları bükün. </li><li> Her iki sahipleri ekli olan göğüs serbestçe ilham üzerine genişletebilirsiniz kadar, post-tutuculara sahipleri yükseltmek. NOT: sahiplerinin firma eki ve göğüs significan ücretsiz genişleme Hemtly nefes nedeniyle hareket eserler azaltır. </li><li> Istediğiniz gibi görüntüleme yapın. </li><li> Görüntüleme tamamlandığında, alt mesajlar, bölme sahipleri kapalı büküm kurtarmak için bir ısıtılmış yüzey üzerinde rektal termometre ve yer fareyi çıkarın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete fareyi iade etmeyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#956;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:+Al+2+O+3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#956;m in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier.</a> Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).</li><li>Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo,+Deep+Tissue+Three-Photon+Imaging+at+the+1700-nm+Spectral+Window.">In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window.</a> Biomedical Optics. 7 (3), (2012).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Lichtman, J. W., DENK, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Big+and+the+Small:+Challenges+of+Imaging+the+Brain's+Circuits.">The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits.</a> Science. 334 (6056), 618-623 (2011).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake,+Mobile+Mice.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Imaging+of+Neural+Activity+in+Awake,+Head-Restrained+Mice.+.">Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. .</a> Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).</li><li>Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats).">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats).</a> Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).</li><li>Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clustering+of+Neurons+in+Motor+Cortex+Determined+by+Cellular+Resolution+Imaging+in+Awake+Behaving+Mice.">Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice.</a> Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).</li><li>Ylera, B., Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-Injured+Adult+Sensory+Neurons+Gain+Regenerative+Competence+upon+a+Lesion+of+Their+Peripheral+Axon.">Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon.</a> Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).</li><li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord.">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS.">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> Plos One. 6 (3), 17910 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nature Communications. 3, 1227 (2012).</li><li>Dibaj, P., Steffens, H., Zsch&#252;ntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

Burada gösterilen tekniği tekrarlanan, time-lapse sağlar, birçok hafta dışarı dorsal fare SC in vivo görüntüleme sonraki cerrahi prosedürler için gerek kalmadan ameliyat sonrası. Bu prosedür tekrar cerrahi görüntüleme çalışmaları üzerinde veya hücresel dinamikleri hakkında bilgiler kaybolur portmortem histolojik yaklaşımlar üzerinde önemli bir gelişme gösterir. Biz daha önce 30 in vivo SKY patolojiyi incelemek için bu tekniğin değerini göstermiştir var. görüntüleme maksimum uzunluk boyutu SC dorsal yüzeyi üzerinde yoğun, fibröz doku büyümesi ile saptanmıştır. Zamanla, bu büyüme görüntü kontrastı ve çözünürlük kaybı ile sonuçlandı. Bu büyüme, aynı zamanda alternatif cerrahi hazırlıkları 31 görülmüştür. Biraraya, dikkatli bir şekilde bir sızdırmazlık yüzeyi, kan ürünleri çıkarmak için, dorsal SC yüzeyinin yıkama ile bu büyüme minimize edilebilir gözlediksiyanoakrilat ile kesilmiş kemik, silikon elastomer iyice odasının kenarları sızdırmazlık ve dorsal SC ve cam kapak arasındaki interstisyel boşluk en aza indirir. Son zamanlarda, bir polikarbonat odacığı kullanılarak kendi benzer başka bir yaklaşım 32 gösterilmiştir. Bizim paslanmaz çelik parçalar için durum böyle değildir X-ışınını akustik görüntüleme cihazları ile uyumlu olduğundan, polikarbonatın kullanılması avantajlıdır. Ancak, 3D yazıcılar şimdi her yerde teknoloji ile, oda parçaları belirli ihtiyaçlarını karşılamak için geniş bir malzeme çeşitli imal edilebilir. Biz son zamanlarda açık bir fotopolimer bizim tüm parçaları baskılı var. Kapalı odasının Bir anahtar dezavantajı ilaçlar veya SC görüntüleme 34 için uygun eksojen boyaların tekrarlanan dozlarda yönetmek için yetersizlik. Ancak, bugünkü sistemin mekanik stabilite yararlanarak, biz zaten başarılı bizim şimdiki odasına kullandıkly da kapalı bir bölme sistemi (yayınlanmamış çalışma), çoklu zaman noktalarında ilaç verme izin veren bir deri altından implante edilen enjeksiyon portuna bağlı bir intratekal kateter çapa. Üstelik, üst plaka modüler doğası, bu hazırlık gelecekteki versiyonları terapötik maddeler ve floresan etiketler iki tekrarlı uygulama için izin vermek için açılıp kapanabilir bir bölmeyi içerir. Bu ilaç iletimi için elektrotlar, optik geçme ve bağlantı noktaları kayıt için bağlantı elemanları ile üst plakaları tasavvur edilmesi de mümkündür. Bu tür eklemeler olasılıkla Fenrich ark. 31 daha minimalist sistemini kullanarak uygulamak daha zor olacaktır. Sonuç olarak, bizim odası farklı deneyler dayalı olabilir bunun üzerine bir ağ geçidi platform sağlar.

Sağlam organizmalarda in vivo mikroskopi time-lapse gibi immünohistokimya gibi geleneksel tek-zaman noktası analizi erişilemez karmaşık biyolojik süreçlerin, direkt görüntülenmesini sağlar. Özel olarak, çoklu foton mikroskobu (MPM) 1, örneğin, 2,3 kadar ve 4 1 mm&#39;den daha fazla görüntüleme elde edilmiştir kemirgen neokorteks gibi, doku saçılma görüntüleme için izin verir. Tek bir prosedür haftalar ve aylar beyne optik erişim sağlar 5-7 olan cerrahi preparatları ile bir araya getirildiğinde, bu mikroskopi yaklaşımlar sağlıklı ve hastalıklı ülkelerde 8-11 beyinde dinamik süreçleri incelemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, protokoller davranış deneyleri sırasında hücresel çözünürlüklü fonksiyonel görüntüleme için izin uyanık (yani, sigara, anestezi), hayvanlarda in vivo görüntüleme için temin 12,13 geliştirilmiştir. Bu protokoller, comparis kullanılmaktadırkorelasyon nöronal aktivitenin 14 ons, anestezi ve uyanık hayvanlarda 15 sinyalizasyon astrosit kalsiyum, görev özgü nöronal kümelerin 16 belirlenmesi ve nöronların yeteneği bıyık stimülasyonu 17 üzerine nesne konumunu ayırt etmek. Bir hastalık mekanizması 18 gibi akut aksonal dejenerasyon tanımlaması (AAD) sağlayan, fare omurilik (SC) tatbik edilmiştir, sağlıklı ve patolojik mekanizmalar, in vivo görüntüleme zaman atlamalı aydınlatmak için bu yaklaşım potansiyeli göz önüne alındığında. Daha sonraki çalışmalar, arka kök gangliyon (DRG) akson rejeneras-yonunun 19 akson rejenerasyonu 20 kan damarlarının yeri, yaralanma 21 karşılık glial kemotaksis, deneysel otoimmün ensefalomiyelit T-hücresi göçü (EAE) 22, aktivite ile ilgili periferal lezyonların etkileri araştırıldı amyotroph yanıt mikrogliya 23,24 ve astrositler 25ic lateral skleroz (ALS), SC yaralanması (SKY) 26 sonra aksonal filizlenme içinde STAT-3 rolü ve EAE 27 akson kaybı ve kurtarma mekanizması. Bu yaklaşımların başarısına rağmen, tüm bu çalışmalar zaman noktalarında erişilebilir sayısını sınırlayarak, her görüntüleme zaman noktasında hayvanın cerrahi açıklıklar tekrarlanan gerekli başka böylelikle kısa vadeli dinamikleri çalışmaları sınırlayan, tek bir görüntüleme oturumu ya sınırlı ya da alındı ve karıştırıcı deneysel eserler olasılığını arttırır. Bu ameliyatlar için protokoller önceden 28,29 yayınlanmıştır. Son zamanlarda, biz tekrar ameliyatları için gerek kalmadan birden fazla haftalarda fare SC zaman atlamalı MPM görüntüleme etkin bir kronik omurilik odasının implantasyonu için bir teknik 30 yayınladı. Kısaca, bu cerrahi hazırlık alt torakal laminektomi ve dört parçalı odasının implantasyonu performans dahil. odası dahillaminektomi çevreleyen omurlar ve bir cam lamel SC üzerine yerleştirilir ve silikon elastomer ile güvenli kelepçeli üç özel işlenmiş paslanmaz çelik parçalar. Bu teknik, tekrar ameliyatları için gerek kalmadan sağlıklı ve yaralı devletler postoperatif fazla 5 hafta dışarı rutin görüntüleme için izin verdi. Görüntüleme zaman noktalarının sayısı sadece hayvan anestezi indüksiyon tahammül hangi frekansı ile sınırlı idi. Görüntüleme süresi SC yüzeyi üzerine yoğun, fibröz doku büyümesi ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca, cerrahi implant motor fonksiyon üzerinde uzun süreli etkisi olduğu belirlenmiş. Bizim ilk yayınlanmasından bu yana, aynı zamanda SC uzun vadeli görüntüleme sağlayan alternatif yaklaşımlar başka 31-33 tarif edilmiştir. Bu protokol, geliştirdiğimiz omurga bölme yerleştirilmesi için prosedürü gösterir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Yukarıdaki prosedür izlenerek, ameliyat, her aşamada, Şekil 2&#39;de belirtilen cerrahi her bir aşama için sonuçlar taklit etmelidir. Özel bakım cam altındaki hava kabarcıklarını yok etmek için silikon elastomer uygulanırken alınan ya da en azından emin olmak gerekir ilgi alanı (Şekil 2L) periferinde yer. Deneyimli bir cerrah için, ameliyat sırasında ya da ilk 24 saat içinde cerrahi girişimden ya ötenazi gerektiren cerrahi komplikasyonlar operasyonların yaklaşık% 20 oluşur. Bu komplikasyonlar en sık aşırı yumuşak doku kanama veya güvenli Vertebral kolon odasına takmak için doğacak. Başarıyla implante odalarında, pencere genellikle birden hafta (Şekil 3) için optik şeffaf kalır. En iyi çabalarına rağmen, opak, lifli, neoplastik büyüme genellikle kısmi obscuri sonuçlanan, bir kaç gün içinde oluştururPencerenin ng (Şekil 3C - F, siyah kesikli çizgi). Floresan yapılar bu fibröz doku altında 2PEF mikroskopi kullanılarak görmek zordur. Biz başarıyla implante pencerelerin yaklaşık 50% postoperatif fazla 5 hafta açık kalan, sonuçların bimodal dağılımını bulmak ve yaklaşık 50% 1 içinde Karartılmış olma - 3 hafta. 2PEF görüntüleme engel değil, - görüntüleme penceresi deneyimi veya dura (F, yeşil yıldız Şekil 3D) Yukarıdaki neovaskülarizasyon sadece mütevazı bir derece içinde net, çoğu yerde kalır pencereler için. Daha önceki çalışmada, 30 kafa penceresi preparasyonlar 5 görülene benzer Orta bir iltihap gösteren pencere ve komşu vertebralar altında mikroglia artış ancak astrosit yoğunluğu göstermiştir. Dorsal kök Gangl bir alt kümesi olarak sarı floresan proteini (YFP) ifade eden transjenik farelerdeia (DRG) nöronları (YFPH hattı, Jackson Labs), aksonlar açıkça operasyon sonrası hafta ayırdedilebilir olmuştur (Şekil 4A ve b) ve uzun bir hayvanda dört ay gibi (veri gösterilmemiştir). Kan damarları (Şekil 4A ve B), kan plazması içinde dekstran etiketli retro orbital enjekte floresan Teksas Kırmızısı görülür hale getirilir. Mikroglia bir CX3CR1 knock-in fare GFP ifade eden farelerde görselleştirilmiştir (CX3CR1-GFP, Jackson Labs) YFPH hattı (Şekil 4C) geçti. Kontrast ve çözünürlük nedeniyle daha önce 30 tarif lifli büyümesi oluşumuna zaman (Şekil 4C) üzerinden alçakgönüllülükle kötüleşti. Biz rutin her 12 saat olduğunca sık ölüm olmadan tek oturumda 3 saat görüntülü ve. Oturum süresi ve sıklığı laboratuvar hayvanlarında ağrı ve sıkıntı eşlik etik hususlar ile anestezi indüksiyonu, eşlik eden hayvan tolerans ile sınırlıdır. &lt;<html> keep-together.within-sayfa = &quot;always&quot;&gt;: fo p class = &quot;jove_content&quot; <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Özel bir cerrahi paketi implantasyonu sırasında odası teslim kolaylaştırır ve daha sonraki görüntüleme oturumları sırasında odasına stabilize. İki yan barlar ve bir üst plaka (A) spinal odasının (C) içine küçük vidayı kullanarak (B) monte edilir. Uzatılabilir mesaj (D) bir ameliyat masası tutma pimleri kullanarak omur (E) yan çubukların teslimat sıkma sağlar. Daha sonraki görüntüleme oturumları yerine implant (F) kanatlarında kümesi vidalar aracılığıyla odasına eklemek için içten dişli mesajları kullanın. Bu rakamın Panel b Nature Publishing Group izni ile Farrar ve ark., Nature Yöntemleri, 2012 30 modifiye edilmiştir.96 / 52196fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Bir dorsal laminektomi yapılır ve kronik görüntüleme odası omuriliğe optik erişim sağlamak için implante edilir. Prosedür montaj açıklanmıştır. İlk olarak, cilt (paneller A, B, protokol bölümleri 3,1-3,4) ve kaslar (C; 3.5) üç alttaki vertebra ortaya çıkarmak için çekilir. Bu üç omurga üzerinde uzanan doku çıkarılır (D, E, K; 3,6-3,10) her iki tarafına (3.12 G, H) üzerine sıkıştırılmış önce ve yan işlemleri, temiz kazınır. Dikkatle, merkezi vertebra dorsal lamina kaldırılır ve kemik kenarları (I mühürlü </strong&gt;; 4. 6). Bir üst plakası (J; 5.1) uygulanır ve vidalar pozisyon (K; 5.3) içine tutturulmuş silikon elastomer ve kapak cam (5.5 L) ile odasını mühürleme önce odasına güvenceye alın. Sevkiyat pimleri (M, 5.8) çıkarıldıktan sonra, deri odası içinde deri kenarlarına yapıştırılmıştır (M, N, 5.8) ve ayar vidası kanat (O; 5.9) eklenir. (P; 5,10) Son vida yuvaları diş akrilik ile mühürlenir. Ve fare kurtarmak için temiz bir kafes yerleştirilir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Kronik omurilik odası optik şeffaf ov kalırBirden çok hafta er. Bir kaç dakika (A) ameliyat sonrası üç hafta (F) arasında değişen omurilik beyaz ışık ve görüntüler. Vasküler görülecek her zaman noktalarında (sarı oklar) tanımlanabilir. Küçük bir değişiklik, bir gün, cerrahi girişimden (B) görülür. Yoğun lifli büyümesi (C - Sağ alt kesikli çizgi ile sınırlanan F) mevcut en erken üç gün ve görüntüleme alanının kısmi şaşırtmaca sonuçları olduğunu. Hafif neovaskülarizasyon (D, E, F, yeşil yıldız) da mevcut, ancak. Beyaz ışık veya 2PEF görüntüleme orijinal damarsal belirsiz değil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Şekil A kronik spinal odası tekrar ameliyatları için gerek kalmadan tekrarlanan çoklu foton görüntüleme sağlar 4.. spinal dorsal Funiculi DRG akson (yeşil) bir alt kümesi YFP ifade transgenik farelerin Tekrarlanan görüntüleme kord ve damar boya enjeksiyonu (A, B) işaretli damar (kırmızı). mikrogliada (leylak rengi) aktivitesi de Thy1-YFP / CX3CR1-GFP çift transgenik fareler (C) zamanla izlenebilir. Akson ve mikroglia görünür kalırken, zamanla alçakgönüllülükle kontrast ve çözünürlük düşüş (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

a-procedure-for-implanting-spinal-chamber-for-longitudinal-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

13.9K Görüntüleme.  Cornell University.  Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Sıçan Servikal Spinal Kord difüzyon Görüntüleme

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...