NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Hibe Numarası UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 ve Joan S. Holmes Memorial Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. MJH ve GCO UCLA Joan S. Holmes Memorial Doktora Sonrası Bursu desteklenen aldı. CSM cihaz Yaratıcı Bilimsel Yöntemleri elde edilmiştir: www.creative-sci.com. Lentiviral vektör KÜR / P30 DK041301 tarafından desteklenen UCLA Vektör Core, alındı.

1. Slayt Hazırlama <ol><li> Sterilizasyon torbalar içine Hücre Sedimantasyon Manifold slaytlar yerleştirin ve otoklav bandı ile mühür. Kese kağıdı tarafı kuyuları plastik birikmeleri önlemek için slayt Teflon kaplı yan Yüz. </li><li> 121 ° C&#39;de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır torbalar. </li><li> Steril 150 x 15 mm steril Petri kabındaki bir biyogüvenlik kabini ve yerin içinde sterilizasyon kese slaytı çıkarın. Dört slaytlar kadar tabak başına sığabilir. Slaytlar yanında 35 x 10 mm Petri kabı yerleştirin. Nemlendirmeyi sağlamak için steril H2O 2-3 ml ilave edilir. </li><li> Şekilde tüm karşılamak için yeterli hacmi kullanılarak 100 ug / ml poli-D-lisin ile önceden kat kayar. Oda sıcaklığında bir saat sonra, çözelti aspire edilerek kuyu yüzeyi üzerine 1x PBS pipetleme de iki yüzey yıkayın. </li><li> İsteğe bağlı olarak, daha güçlü tümör hücre yapışmasını sağlamak için fibronektin veya diğer ECM bileşenleri ekleyin. Yeterli hacim tha 5 ug / ml fibronektin ekleKuyular t oda sıcaklığında zaman kısa bir süre içinde kuru olmaz. <ol><li> 1 saat sonra, artık bir çözüm aspire ve 1x PBS ile pipetleme ve aşağı iki kez yıkayın. </li></ol></li><li> Tümör kaplama için hazır olana kadar kuyular PBS tutun. Kullanım aynı gün slaytlar. </li><li> Istenen yapışkan tümör hücre tipi bir birleşik bir şişe hasat edilir. Yeterli tamponlu büyüme ortamı; örneğin 5 x 10 6 hücre / ml&#39;de ışık mikroskobu ve tekrar süspansiyon Tripan mavisi kullanılarak canlı hücre sayımı, Dulbecco minimum gerekli ortam,% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS), L- glutamin ve sodyum piruvat. </li><li> Yapışık hücre popülasyonunun floresan görüntüleme isteniyorsa, önemli bir flüoresan boya veya üretici tarafından sağlanan protokol izlenerek, bir hücre çoğalması boya ile yapışık hücre popülasyonu olarak etiketleyin. </li><li> Sorunsuz wel içinde hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için slayt özen göstererek her kuyuya tam orta 10 ul pipetls, bu gibi üniforma tümör hücresi yapışmasını önleyebilirsiniz. </li><li> Her bir sıra (Şekil 1A) ortama 2.5-5.0 x 10 4 hücrelerini (hücre süspansiyonu 5-10 ul) eklenir. Tümör hücre tipine ve arzu edilen büyüme gün sayısına bağlı olarak uygun sayıda ayarlayın. Büyük tümör hücreleri veya hızlı büyüyen hücreleri başlangıçta daha az hücre gerektirebilir. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için yukarı ve aşağı orta ve pipet ekleyerek 40 ul kadar iyi ses getirmek. </li><li> Tüm oyuklar tohumlanmış olduktan sonra, tümör hücreleri, daha sonra oda sıcaklığında uygun yer kapak 150 x 15 mm Petri tabağına ve dikkatli bir şekilde en az 24 saat süreyle 37 ° C /% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör çanağı hareket etmesine izin verir. </li><li> Günlük kültür ortamı değiştirin. Dikkatle tek tabaka harcanan ortamın bir bölümünü pipet ve taze tamamlanmış besiyeri ile değiştirin. NOT: buharlaşma nedeniyle, daha fazla hacim dışarı alındı ​​daha ilave edilmesi gerekecektir. Wells tahlil için ne zaman hazır olacağını daha, conflhücre uent tabaka mevcuttur. Bu 1-3 gün ilk tohumlama sonra genellikle. </li><li> Adım 1.4 tarif ve mono tabakalar isteniyorsa 2. adıma geçin, ya da tek tabaka ECM proteinleri ayıklamak için aşağıdaki 1,13 adıma olarak ya PBS ile hafifçe kez tek tabaka yıkayın. </li><li> Komple ortam içinde% 0.5 Triton-X (h / h) çözeltisi oluşturunuz ve her bir oyuğa 30 ul ilave edin. Tek tabaka, daha sonra 2 dakika süre ile kaputu sindirimi, yukarıda anlatıldığı gibi pipetleme tam ortam ile iki kez yıkayın olsun. NOT: ECM tabakası ışık mikroskobu (Şekil 2) ile görülebilir. Hemen slaytlar kullanarak, veya 1-2 gün süreyle nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde komple ortam içinde tutmak. Kuyular kurumasına izin vermeyin. </li></ol> Slide üzerine Yapışmayan T hücrelerinin 2. sedimantasyon <ol><li> Yapışmayan hücre popülasyonunun floresan görüntüleme isteniyorsa, bu tür CFSE, hücre Takibi Kırmızı CMPTX veya eFluor olarak önemli bir floresan boya ile yapışkan olmayan hücre popülasyonları, etiketTahlilde önceden üreticisi, en az 1 saat tarafından sağlanan protokolleri takip ederek 670. Seçenek olarak ise, viral vektörler tarafından kodlanan floresan proteinleri ifade etmek için hücreleri manipüle. </li><li> Yukarıda 1.2&#39;de tarif edildiği gibi bir otoklav torbanın hücre sedimantasyon manifoldu otoklava. </li><li> Biyolojik güvenlik kabininde kuvöz ve yerden Teflon kaplı slaytlar içeren nemlendirilmiş odasına çıkarın. </li><li> Pipetleme 1x PBS ile yıkayın ve aşağı, daha sonra, en az% 10 serum içeren komple ortam içinde 45 ul ekle. </li><li> Sterilizasyon zarf manifoldu çıkarın ve dikkatlice slayt (Şekil 1B) alt dokunur manifoldu sonunda &#39;kanca&#39; kadar kuyularda üzerinde slayt. </li><li> Kültür ortamı, her bir kanal görünür olduğundan emin olun. Hiçbiri görülürse, manifoldu çıkarmak ve iyi gelen daha fazla orta ekleyin, daha sonra değiştirin ve tekrar kontrol edin. </li><li> Her chan için yineleyin 2.5nel manifold ya da birçok kuyu için arzu edildiği şekilde. </li><li> En az / 5, 10 x 1.0-2.0 daha ul yıkanarak yapışmayan hücreler ve tekrar süspansiyon sayısı. Hücrelerin 1 ul çizin ve yavaş yavaş kanal (Şekil 1C) içine pipetle. Iyi istenen her yapın. </li><li> Kanal hücreleri yerleşmek için izin 20-30 dakika süreyle biyo-kaput içinde, yani manifoldu ve slayt tüm hücre yüklü cihazı, bırakın. </li><li> Fokal kuyularda (Şekil 1D) merkezinde seribaşı hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde slayttan yukarı doğru kaldırarak hafifçe iki ucunu dokunarak ve manifoldu çıkarın. </li><li> Yapışmayan hücreler başarılı bir şekilde iyi manifoldu kanalın çevresi içinde kalma merkezinde seribaşı olarak emin olmak için her iyi kontrol edin. yapışmayan hücreler ideal bir miktar, bu nedenle hafif hücre Pelle neden olmaz çevresinde slayt hareket tek tabaka veya ECM ve birbirine yapışırt dağıtmak için. Slayt jostle etmeyin. </li></ol> 3. Floresan Mikroskopi <ol><li> Sedimantasyon onaylandıktan sonra uygun deneysel donanımları ile, görüntüleme gerçekleştirmek. İdeal olarak, bir CO2 ve nem odası ile donatılmış bir mikroskop kullanılır. Kuyunun tamamı görülebilir, böylece birden fazla görüntü için izin vermek için, düşük güç, yani, 4X veya 10X, bir görüntü daha büyük bir alanı alınacak. </li><li> Görüntü yakalama yazılımı kullanarak dijital görüntüler elde edin. Aydınlık ve / veya çok-kanallı floresan görüntüleme yapın. </li><li> İstenirse, belirli bir alanda farklı kanallarda görüntü kaydetmek ya da nemlendirilmiş slayt tutmak ve 37 ° C /% 5 CO 2 inkübatör ve manuel (istenilen zaman noktalarında görüntü Şekil almaya bir time-lapse kurmak daha uzun bir zaman noktası için önerilen 1E &amp; F). </li></ol> 4. Analiz ve Görüntü <ol><li> Resim düzenleme yazılımı kullanarak, ışık ve fl birleştirmebir katman birden çok hücre tipleri ve işaretleri içine uorescent görüntüleri aynı görüntüde görülebilir. Sürükle ve her programa renk ve istendiğinde, çoklu katmanlar ile bir görüntü dosyası oluşturmak için &#39;Katman ekle&#39; seçeneğini görüntü dosyalarını bırakın. <ol><li> Yüksek büyütmede, almak hizalamak ve dijital birlikte kuyunun genelinde görüntüleri dikiş. İki görüntü arasında korunmuş bölgeler bakarak ve tam bir resim oluşturulur kadar üst üste bir görüntü kaplayan dosyaları hizalayın. </li></ol></li><li> Tek tek hücreler göç mesafeyi belirlemek için yakalama yazılımı kullanarak edinimi sırasında görüntülere mikron çubuklarını ekleyin. </li><li> , Çeşitli zamanlarda hücre göçü belirleyen floresan T hücre agregasyonu veya zamana yayılmış ölçmek için, yani görüntü yazılımı, ImageJ ile yüzey yoğunluğu floresan haritaları yapmak için. <ol><li> Yüzey araziler oluşturmak adımda 4.1 ve Katmanlar pencerenin altında oluşturulan bir katmanlı görüntü çekmek için,İstediğiniz kanala karşılık gelen olanlar dışındaki tüm katmanları işaretini kaldırın. Bir yüzey arsa Merck tanımının görüntülenmesi arzu edildiği takdirde, örneğin, bu marker için kullanılan filtreye karşılık gelen, sadece &#39;yeşil&#39; tabakalar görünür olmalıdır. </li><li> Düzleştirilmiş görüntü ve programa görüntüyü (örn, .png) tanınan bir dosya biçiminde kaydedin ve yükleyin. Yüzey arsa üretmek için, 8-bit görüntü türünü değiştirmek arka plan azaltmak için gerektiği gibi parlaklık / kontrast değiştirmek ve &#39;/ Yüzey Plot Analizi&#39; seçeneğini seçin. Şekil 5 görüntüler &#39;Shade&#39;, &#39;Axis Beraberlik&#39;, &#39;Bir Poligon Başına Hattı&#39;, ve &#39;Smooth&#39; onay kutularını işaretleyerek üretildi. </li><li> Alternatif olarak, sıfır zamanında fokal hücre mevduat yarıçapını veya çapını kullanarak ölçümler almak ve farklı zamanlarda dış noktada hücrelere karşılaştırın. teflon kuyu çapı 6.0 mm&#39;dir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fascin+in+the+migration+and+invasiveness+of+malignant+glioma+cells.">The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells.</a> Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).</li><li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays.">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li><li>Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+in+human+astrocytoma+migration+and+proliferation+studied+in+a+microliter+scale+assay.">The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay.</a> Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).</li><li>Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+membrane+cytoskeleton+cross-linker+ezrin+in+medulloblastoma+cells.">The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells.</a> Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).</li><li>Berens, M. E., Beaudry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+monolayer+cell+migration+assay.">Radial monolayer cell migration assay.</a> Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).</li><li>Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+human+astrocytoma+migration.">Determinants of human astrocytoma migration.</a> Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).</li><li>Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+attachment+and+morphological+differentiation+in+a+pheochromocytoma+cell+line+and+embryonal+sensory+cells+by+the+extracellular+matrix.">Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix.</a> Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Hickey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+preclinical+study+findings+to+protocol+design:+translational+studies+with+alloreactive+CTL+for+gliomas.">Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas.</a> Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).</li><li>Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-shot,+multicycle+suicide+gene+therapy+by+replication-competent+retrovirus+vectors+achieves+long-term+survival+benefit+in+experimental+glioma.">Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma.</a> Mol Ther. 12, 842-851 (2005).</li><li>Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+a+tagged+chimeric+gammaretrovirus:+identification+of+novel+cis-acting+elements+that+modulate+splicing.">Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing.</a> J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+phases+of+distribution+and+tumor+targeting+by+T+cell+receptor+engineered+lymphocytes+inducing+robust+antitumor+responses.">Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).</li><li>Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-dependent+homotypic+aggregates+regulate+CD8+T+cell+effector+function+and+differentiation+during+T+cell+activation.">ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation.</a> J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).</li><li>Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+extracellular+matrix+from+sectioned+human+tissues.">3-D extracellular matrix from sectioned human tissues.</a> Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).</li><li>Prevention, C. f. D. C. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Alstergren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+directed+migration+of+murine+neutrophils+is+dependent+on+cell+surface+expression+of+CD44.">Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44.</a> Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).</li><li>Zhang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+antigen+precursor+protein+profiles+of+adult+and+pediatric+brain+tumors+identify+potential+targets+for+immunotherapy.">Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy.</a> J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Tek bir hücre süspansiyonu olarak tümör hücreleri Teflon-maskeli sürgü oyuklarına pipetle alındı. hücreler yapışmaya bırakıldı ve daha sonra bir nemlendirilmiş bir% 5 CO2, 37 ° C inkübatör (Şekil 1A) içinde tek-tabakalar oluşturulmuştur. Tek tabaka elde kurulan tek tabakalar ya da ECM proteinlerinin bu tahlillerde (Şekil 1B) hasat edilebilir. EMD kodlayan vektörler ile önemli bir floresan boya ile işaretlenmiş ya da transduse efektör T lenfositle...

Radyal tabakalı hücre gücü deneyi ilk olarak, hücre dışı matris (ECM), proteinleri 5-7 ile ya da fibronektin ve laminin 1,2 tek tek ECM bileşenleri ile kaplanmış dilimlerin üzerine yapışık tümör hücreleri 1-4 infiltratif özelliklerini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu teknik, paslanmaz çelik bir hücre, sedimantasyon manifoldu (CSM) kullanılarak kuyu merkezinde tümör hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu tohumlama çıkıyor. Sedimantasyon sonra, tümör hücreleri, yatay motilite oranı belirlemek üzere kullanılan kuyu ve zaman içinde başlangıç ​​hücre popülasyonunda çapında değişiklik alt azaltacaklardır. Radyal tabakalı hücre gücü deneyi hücrelerinin in vitro göç yeteneklerine tahlil edilmesi Transwell plakaları kullanılan diğer mevcut yöntemlere göre görsel bir avantaj sağlanır; Bu analizler görüntüleme 8 olmayan elverişli. Yanı sıra, aynı zamanda bir zaman noktası seçiminde özgürlük büyük miktarda sağladıgöç, değerlendirilir timepoints sayısında herhangi bir sınır ile bir araştırmacı sedimantasyon sonra görüntünün tercih ne zaman s. Geçirmek için yeteneği, özellikle de viral vektörler için salıverme araçları olarak kullanılabilir immünoterapi veya burada alanında, yapışkan olmayan hücreler için önemli bir işlevi olduğu için, yapışkan olmayan hücre göçünü değerlendirmek için CSM kullanımını uyarlanmış tümör hücre tekli katmanları üzerinde tipleri, ECM proteinleri ilave olarak. Mikroskopik olarak, ya da tek tek ECM bileşenleri tümöründen izole edilmiş kompleks ECM ile, uygun bir tümör hücre tekli katmanları üzerinde yapışkan olmayan hücreleri göç görselleştirme yararı, bu deney, çok yönlü kılar. Tek bir hücre dışı bir protein ile kaplı oyuklar da kullanan deneyler doğru hücrelerin, in vivo yoluyla göç edecektir ECM doku alt-tabakanın ya da tümör yansıtmamaktadır. Burada, biz büyük histocomp karşı duyarlı alloreaktif sitotoksik T lenfositleri (alloCTL), kullanılanBizim için temsili yapışmayan hücre tipi olarak, tek yönlü karma lenfosit tümör hücresi tepkileri (MLTR) ya da karışık lenfosit reaksiyonları (MLR), 9 kullanarak atibility kompleksi (MHC) proteinleri içerir. Biz de, insan ve murin kökenli hücreler test edildi. Göç tümör mono tabakaları üzerinde ölçüldü zaman kullanılan tümör hücreleri ya kısmen ilgili hedefler MHC moleküllerinin tam bir set ile efektörler, ya da tamamen ilgili hedefler, duyarlı kullanılan hücre popülasyonu üzerinde bulunan aynı MHC proteinlerinin bazı görüntüleme, olduğunu etkileyiciler karşı duyarlı hale getirilmiş. Bazı deneylerde, efektör ve hedef hücrelerin ayırt etmek için floresan CellTracker Kırmızı CMPTX veya hücre çoğalması, boya eFluor 670 kullanılır. Ayrıca hücrelerin görselleştirmek için ek bir yol olarak floresan proteinler için viral vektörler, kodlama ile transdüksiyon kullanılır. Bazı deneyler için, Emerald Green (Merck) floresan protein 10,11 kodlayan retroviral replike vektörleri (RRV) ile alloCTL transduse; oth içinalıcılar, tümör hücreleri mStrawberry kodlayan lentiviral vektörleri ile transdüse edilmiştir. alloCTL tümör hücre monokatmanlarından hasat edilen tümör hücre mono tabakaları ya da ECM ya merkezine manifoldunun bir kanal üzerinden ekilmiştir. Yapışkan olmayan yapışık hücre etkileşimleri ışık ve / veya zaman içinde floresan mikroskobu ile görülür hale getirilirler. Yüksek güçte parçalanmış çekirdekleri ile düşük güçte tümör hücre mono tabakasında bozulması ya da tümör hücreleri, sırasıyla erime ve apoptoz ile hücre hasarı göstergeleri idi. Biz dijital tek tabaka kültürler üzerinde yapışmaz floresanlama T hücrelerinin göçünü gösteren yüzey yoğunluğu floresan haritalar yarattı. Biz de sitotoksisite Kaplanmış yapışmayan alloCTL küme oluşumundan sonra yapışık glioma hücre tabakasına yol açtığı kaydetti. Yanı sıra, glioma tek tabaka için alloCTL gelen RRV-EMD yatay transdüksiyon gözlendi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

İlk floresan etiketli, yapışkan olmayan, insan veya murin efektör bağışıklık hücrelerinin hareketliliği ölçmek için, hücre dışı matris proteinleri üzerinde yapışık tümör hücrelerinin radyal migrasyonun ölçülmesi için rapor Radyal tabakalı hücre gücü deneyi yeni bir adaptasyon sunulmaktadır. Bu teknik bir paslanmaz çelik manifoldu ve 10-kuyu teflon slayt fokal birleşen tümör hücre mono tabakaları veya hücre dışı matriks proteinleri ya hazırlanan kuyulara yapışmaz T hücrelerini yatırmak için kullanır. Hafif ve / veya çok-kanallı floresan mikroskobu zamanla efektör hücrelerin hareketi ve davranışını izlemek için kullanılır. Floresan boyalar ve / veya floresan transgenler için kod diferansiyel görüntüleme için hücre tipleri etiketlemek için kullanılan viral vektörler. Bu yöntem, bir slayt bölmeleri, agar veya Transwell plakaları kullanılarak, yatay ya da dikey göç / işgali etiket in vitro deneyler içindeki tip farklıdır. Tahlil ayrıntılı görüntüleme verileri b sağlarBelirli bir fluoresan markörler ile ayırt farklı hücre tipleri ile toplanmış, e; hücrelerin hatta belirli alt gruplar (örneğin, nontransduced / transdüksiyon ile aktarılabilir) izlenebilir. Yüzey yoğunluklu floresan araziler göç hücre tipine karşılık gelen özel flüoresan kanalları kullanılarak üretilir. Bu belirli zamanlarda yapışkan olmayan immün hücre hareketliliğinin iyi olarak gösterebilir. Bir de, hedef hücrelere gibi sitotoksisite veya efektör viral vektörlerin transferi gibi diğer efektör hücre fonksiyonlarının, kanıt toplamak mümkündür. Bu durumda, yöntem, araştırmacılar mikroskobik çeşitli yapışkan hücreler ile farklı olarak etiketli olmayan yapışık hücre-hücre etkileşimleri belge sağlar. Bu tür bilgiler, işlevselliği görsel kanıt, kanser tedavisi için kullanılmadan önce tümör hedef hücreleri ile arzu edilen biyolojik olarak manipüle ya da aktive edilmiş immun hücre tiplerinin belirlenmesinde, özellikle uygun olabilir.

Floresan proteinleri kodlayan viral vektörler ya da bunun yerine, floresan boya, bir ek olarak kullanılabilir. Viral transdüksiyon motilite deneyinin önceden yapılmalıdır. Hem yapışkan ve yapışkan olmayan hücre tipleri farklı şekilde etiketlenmiş olabilir. transdüksiyonu için protokol kullanılan vektör tipine bağlı olacaktır. Burada, 12 &#39;de tanımlanan protokol kullanılarak gerçekleştirilen bir deneyde önceden Şekil RRV EMD ile birlikte 3, 5 ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes at JoVE.com

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K Görüntüleme.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

Video: Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...