Bu eser Araştırma Kolaylaştırma Hibe EEH ve Araştırma Ortabatı Üniversitesi Ofisi ve Intramural Hibe KJL verilen Sponsor Programlar verilen Sağlık Bilimleri Ortabatı University College fonları tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için AVMA Hayvan Refahı İlkelerine uygun ve Ortabatı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Anestezi, Ekipman, &amp; Medya 1. Hazırlık <ol><li> Ticari deklor ajan (evcil hayvan mağazalarında mevcuttur) veya 24 saat su standı sağlayarak kullanarak musluk suyu yaklaşık 1.5 L Klorsuzlaşmaz. Üç 1 L beher edinin ve su dechlorinated 500 ml her doldurunuz. Herhangi bir prosedür önce balık tutmak için bir ve kurtarma için bir Etiket. Üçüncü bir behere, tricaine metansülfonat, 100 ug / ml eklemek; Bu balık anestezi edilecektir beher olur. </li><li> Kültür ortamı sıcak buzla sığ kabını (RPMI 1640,% 10 FBS (fetal inek serumu), 50 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml kanamisin, 25 mM HEPES), oda sıcaklığına kadar, ve temiz kuyumcu cımbız toplamak. Immer tarafından temiz cımbız% 70 etanol ipuçlarını şarkı ve etanol yakmak için izin, bir Bunsen beki geçer. </li><li> 10X büyütme, ya da mikroskop (kişisel tercihinize tamamen bağımlı) diseksiyon - prosedür 2 ile ticari, masa üstü ışıklı büyüteç, büyütme olmadan yapılacaktır karar verin. </li></ol> 2. Eksplantasyon Kültürler kurulması <ol><li> Bir tutma beher balık ve yerin istenilen sayıda yakalayın. Anestezi beher tek bir balık aktarın; tek tek balık uyutmak için en iyisidir. </li><li> Balık yüzme ve solungaç hareketi gözlemleyerek anestezi etkilerini izlemek. Anestezi ilerledikçe, solungaç hareketi yavaşlar ve balık kararsız ve sık sık baş aşağı yüzmek olacak; en kısa sürede solungaç hareketi durur gibi anestezi balık düşünün. Bu balığın ölümüne neden olabilir anestezi banyosunda daha uzun süre balık bırakmayın. </li><li> Anestezi beher ve transfer balık kaldırbuz, cımbız tutan eli karşı karşıya kuyruk yatay balık yerleştirerek. Tekniği ile ve eğer deneyimli, birden fazla balık, eksplantlar yapmak şu anda anestezi çanak içinde bir sonraki balık yerleştirerek dikkate kullanılacak. </li><li> Ölçekler kaldırmak için, pozisyon cımbız ölçekte kenarında ucu ile balık paralel. Ölçek balık vücuttan yükseltmesine neden biraz balık yan içine cımbız düz tarafı basın. Doku kültürü çanak cımbız, koparmak, ve (inversiyon olmadan) yer ölçeği kavrayın. Solungaç bölge, yan çizgi, ve yüzgeçleri kaçınarak, (her iki tarafta 6) Büyük bir yetişkin 12 ölçeklerde maksimum kaldırma prosedürü tekrarlayın. </li><li> Kurtarma beher içine balık yerleştirin ve anestezi etkisinden kurtarır sağlamak için monitör. Şu anda, balık bağımsız bir tanka geri aktarılabilir. Balık tam ölçekli rejenerasyonu için izin en az 21 gün süreyle kurtarmak için izin verin. </li><li> Bağlı olarakcam alt çanak başına 6 ölçeklerde - deneysel tasarım, plastik 35 mm doku kültürü ile tedavi çanak başına 20 ölçekler ya da 4 kadar koyun. Ölçekler çanak ölçekler ayırmak için değil şekilde yavaşça ortamı eklemeden önce çanak uymak için izin verin. NOT: Ortam ilk çanak eklenmeden önce tecrübesi ile, birden fazla balık işlenebilir. </li><li> Her 35 mm çanak içine tam ortam (yukarıda 1.2) 1.2 ml ekleyin. </li><li> Tercihen ya da ilave işlem olmadan, istenen zaman süresi için% 5 CO2 içinde 28 ° C &#39;de eksplant kültürleri inkübe edin. Alternatif olarak, bir ısıtmalı mikroskop sahnede veya video mikroskopi için canlı hücre kültür odası içinde kültürleri kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 3. aydınlık ve video mikroskobu <ol><li> Başlangıçta mikroskop sahneye hücre tabakaları içeren ve Pozisyon yemekleri 4X objektif lens kullanarak odak. Not: Daha yüksek büyütme deneye bağlı olarak kullanılabilir. Yerini İşaretlemeHer hücre sac ve / veya sahnede çanak yönü yaklaşık aynı yönde levhalar ile zamanla görüntüleri alarak kolaylaştıracaktır. </li><li> Her deney protokole göre, çeşitli zaman noktalarında kuvöz ve fotoğraftan yemekleri çıkarın ve yalnızca hareketsiz görüntüler deneysel bir zaman dilimi içinde gerekirse kuvöz içine geri yerleştirin. </li><li> Video mikroskobu yerine getirirken, aşağıdaki dikkat: <ol><li> Göç hücre sac videonun süresi için görüş alanında kalacak şekilde görüş alanı içinde ölçek / gelişmekte olan hücre tabakasını yerleştirin. NOT: Bu hücreler ölçek altında göç nasıl gözlemleyerek biraz tecrübe alabilir. Kısa videolar için, bu uzun videolar için daha endişe azdır. </li><li> Kısa zaman dilimlerinde için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha uzun zaman aralıklarında (18 + saat) için, ısıtılmış bir aşama ya da tutulması için bir inkübasyon odası, pH dengesini kullanın ve kültür m buharlaşmasını en aza indirmek içinedium. </li></ol></li></ol> İmmünofloresan Mikroskopi için 4. Tespit <ol><li> Hazırlayın ve 28 ° C ön-sıcak tüm çözümler. , Floresan altında keratosit görüntülemek cam alt 35 mm doku kültür kaplarına kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi eksplant kültürleri büyümesi için. Alternatif olarak, cam haznesi slaytlar kullanın. </li><li> Her bir tabağa 1.1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 0.8 ml ilave edilir. İlk kültür ortamını çıkarmayın. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her bir tabağa 1.1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 0.8 ml ilave edilir. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1X PBS içinde 0.5 ml% 0.2 Triton X-100 eklenmesi ile dışındaki ligandları ya da dış epitopu Permeabilize hücreler kullanılarak edilmiştir. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1x PBS içinde 0.5 mi% 1 BSA ilave edin ve (4 ° C&#39;de) 1 (oda sıcaklığında) saat veya O / N inkübe edin. Not: Deneysel koşullara göre, phalloidin bu aşamada eklenebilir. </li><li> Inkübasyondan sonra, aspirat çözüm kaldırmak ve antikor boyama ile devam edin. 4 ° C &#39;de 4 hafta - 3 1x PBS içinde% 1 BSA ve 2 ml - Alternatif olarak, en azından 1 eklenerek kültür kaplarına saklayın. </li></ol> 5. İmmünofloresan Protokolü <ol><li> Üreticinin önerilerine göre primer ve sekonder antikor çözümleri hazırlayın. Not: üretici önerileri mevcut değilse, (1x PBS içinde% 1 BSA içinde), birincil antikor iyi bir başlangıç ​​dilüsyonu 1: poliklonal 500 ve 1: monoklonal antikorlar için 1000; ikincil antikorlar için iyi bir başlangıç ​​dilüsyonu 1: 1000. Sinyal güçlü ve arka bir sorun olup olmadığını sinyal düşük, zayıfsa yüksek üreticinin elde edilen orijinal stokunun bu dilüsyonlarını ayarlayın. </li><li> 1x PBS çözeltisi içinde% 1 BSA aspire. Primer antikor solüsyonu, 0.5 ml ilave edilir ve (4 ° C) ya da O / N (oda sıcaklığında) 1 saat süre ile inkübe edilir. </li&gt; <li> Birincil antikor çözeltisini çıkarın yer temiz halinde ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü etiketli ve -20 ° C&#39;de dondurun. Not: Gerekirse bu primer antikor yeniden kullanım için sağlar. </li><li> Kaldırma ve her yıkamadan sonra PBS atarak, 1x PBS ile 5 kez - çanak 3 yıkayın. </li><li> Ikinci antikor çözeltisi, 0.5 ml ilave edilir. Arzu edildiği takdirde, bu aşama sırasında (bir üreticinin tavsiye edilen konsantrasyon sonrasında) floresan işaretlenmiş falloidinle ekleyin. (4 ° C&#39;de) ya da O / N (oda sıcaklığında) 1 saat süreyle inkübe edin. NOT: Kullanımı falloidin floresan etiketli aktin filamentler görselleştirme sağlar; Biz 488-işaretlenmiş falloidinle eden zebra balığı keratositlerde en uygun olduğu bulunmuştur, fakat diğer flüoroforlar kullanılabilir. </li><li> Çıkarın ve ikincil antikor çözüm atın. </li><li> Kaldırma ve her yıkamadan sonra PBS atarak, 1x PBS ile 5 kez - çanak 3 yıkayın. Not: çanak 4 ° C vie tutulamazsa, ışıktan gelen kapalı saklanabilirhemen a; Emin 1x PBS hücreleri ama sıcak RT kurumasına değil emin olmak için saklamadan önce çanak içine ilave edilir olun (20-30 dk), sonra hemen önce bir sonraki adıma geçmeden için PBS kaldırmak. </li><li> Çanak içine, deneysel ihtiyaçlarına bağlı olarak, ya da DAPI olmadan, bir montaj orta 3 damla ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin - hazır gözlemlemek için zaman, 2 ekleyin. NOT: DAPI ile bir ticari olarak temin edilebilen, gliserol tabanlı bir montaj ortamı, ancak diğer montaj ortam da kullanılabilir. Çanak oturup montaj orta 10 dakika izin çanak altından cam lamel kolayca çıkarılmasına olanak. </li><li> Inkübasyondan sonra, yavaşça gevşetin ve lamel kaldırmak için çanak tarafta sıkmak. Slayt üzerine, aşağı, hücreler cam slayt üzerine montaj medya ek damla ekleyin ve lamel yerleştirin. NOT: - 2 gün slayt daha uzun 1 tutulması gerekiyorsa açık tırnak cilası kullanarak slayt lamel sızdırmazlık düşünün. </li><li> Bir floresan mikroskop altında slayt gözlemleyin. NOT: Bizim görüntülerin çoğu petrol daldırma altında 40X veya 63X objektif lens kullanarak alınmıştır, ancak belirli objektif deneysel protokol bağlıdır kullanılır. </li></ol>

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

kültür ortamı ilavesinden önce 3 dk - keratosit eksplant kültürünün başarısı için en kritik adım ölçeği yaklaşık 2 için kültür çanak uymak için izin veriyor. Yaklaşık ölçek% 75 yapışır ve (her bir deney için kurulan kültürlerin sayısı buna göre ayarlanması gerekir) yaprak artacak. Keratosit yaprak balık çıkarıldı ve çeşitli nedenlerle kültüre yerleştirilmiştir, her ölçek çevresinde oluşturmazlar. İlk olarak, eksplant DAPI boyama bazı ölçekler birkaç hücre bağlı...

<html> Hücre hareketi Çalışmaları geleneksel bireysel göç hücreleri üzerinde odaklanmıştır. Balık ve amfibi Eksplantlardan kültürlü keratositler 1-6 yaklaşımları deneysel ve matematiksel modelleme hem de kullanılarak hücre hareketi mekanizmaları incelemek için güçlü bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Düzgün bir şekil, hız, yön ve korurken bireysel göç hücreleri üzerinde deneysel çalışmalar, hücrelerin hızlı, pürüzsüz kayma hareketi ile destekli olduğunu. Özellikle embriyojenez, yara iyileşmesi, ve metastaz sırasında, hücre-hücre kavşaklar muhafaza Bununla birlikte, in vivo koşullarında, hücreler sık sık birlikte hareket eder. Böylece, toplu hücre göçü, hücre göçü alanında araştırma büyüyen ve giderek daha belirgin bir alandır. Bu hücrelerin toplu göç son zamanlarda 7 tarif edilmiştir ve bunun bir yara iyileşmesi modelinde toplu hücre göçü çalışmak için güçlü bir sistem yapmak birçok benzersiz özelliklere sahiptir. ove_content &quot;&gt; terazi Anestezi uygulanmış yetişkin bir zebrabalıkları koparılan zaman, bir epitel doku ölçek alt bağlı kalır. hücre kültür ortamı eklenir, bu epitel hücreleri veya keratositler, ölçekli bir toplu birim olarak daha hızlı göç ederler. The, eksplant kültürü hücreleri sağlam bir epitel yeniden kurmak için yatağı bir yaranın geçici matris boyunca olduğu gibi eksplant uzak göç olduğu bir epitel yara iyileşmesi modeli olarak görülebilir. Son veriler göstermektedir bu ex vivo kültür taklit birçok özellikleri olduğunu in vivo yetişkin zebrafish yaranın iyileşmesini. Yara kapatma oranları 8 ex vivo sistemde 7 gözlenen benzer bir göç hızına çevirmek. Ayrıca, bir in vivo yara iyileşme modeli, warfarin ile tedavi hemostaz oranı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir hidrokortizon tedavisi bağışıklık yanıtı azaltmak için ise şifa, reepithelialization 8 gecikme değil </&gt; sup. Ölçek hayvan çıkarıldığında Zebra balığı kanama değil gibi, hemostaz önemli bir oyuncu değil. Biz eksplantlarda bağışıklık hücrelerini bulduk rağmen, biz onlar kolektif hücre göçü üzerinde olabilir etkileri incelenmiştir değil. Burada sunulan protokol birçok biyolojik tahlillerde kullanılmak için tutarlılık ve yeniden üretilebilirlik sağlamak zebra balığı keratosit eksplant kültürleri oluşturulması anlatılmaktadır. Bu eksplant kültürler çeşitli nedenlerle toplu hücre göçü için in vitro model özellikle zorlayıcı. İlk olarak, zebra balığı keratositler eksplant kültürleri oluşturulması saat içinde kullanılan primer hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücreler, birincil hücrelerin 9-13 geçişi ile ilişkili morfolojik ve gen ifadesi değişikliklerini geçirmiş değil. İkinci olarak, bu sistem, yaralanma karşısında, mezenkimal tr bir epitel bir parçası olarak, 14 yaralama yanıt olarak reepithelialization çalışma için bir modeli temsil eder vegen ekspresyonunda değişiklikler ve sitoskeletal yeniden düzenlemeler 14,15 ile kanıtlandığı gibi ansition (EMT) işlemi başlatılır. Böylece, işlenmemiş hücrelerde meydana gen ifadesi ve hareketlilik arka plan değişiklikleri ile karakterize ve tedavi değişiklikleri yorumlamak için bir bağlam sağlamak edilmiştir. Ayrıca, balık keratosit ve insan keratinosit işlevsel olarak eşdeğer olan; her ikisi de kendi türlerinin birincil epitelyum hücreleri ve epitel yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Üçüncü olarak, yetişkin zebrabalıkları melanom ve diğer kanserler 19-21, 8,14 ve doku rejenerasyonu 22-24 iyileşme deri yara dahil olmak üzere insan hastalıklarının 16-18 çeşitli için bir model sistem olarak tanıma kazanıyor. Bu model, sistemin teknik avantajları eşit zorlayıcı. Mutant ve transgenik hatları giderek artan sayıda kar amacı gütmeyen, merkezi tesisleri mevcuttur. Özellikle, Zebra balığı Mutasyon Projesi (SMN) Wellcome Trust Sanger Enstitüsü Zebra balığı genomunda geni kodlama her protein bir nakavt alel yaratmayı amaçlamaktadır. Şu anda, bu özelliği, 24.088 allel ile, 11892 gen, genomun yaklaşık olarak% 45 mutasyona uğramış. Buna ek olarak, SMN önerilerini kabul ve ücretsiz knock-çıkışları üretecektir. Larva ve ergin zebrabalıkları 25-28 gen demonte son yöntemler transgenik yaklaşımlar sorunlu ya da pratik olduğu için gelişimsel olarak önemli genlerin fonksiyonunu incelemek için esneklik sağlar. ~ 145 mm / saat motilite onların son derece hızlı oranları nedeniyle kısa bir süre kültürlerin 29 kurulmasından sonra, tahliller (genellikle 24 saat ya da daha az) hızla tamamlanabilir. Deneyler hızla tamamlandı ve kültürler, oda sıcaklığında iyi bir video mikroskobu ile ilgili memeli hücre göçü tahlilleri önlenir ile ilgili teknik engeller birkaç büyümesi gibi. Buna ek olarak, araştırma bütçeleri sıkma çağında, zebrafish kolay ve masrafsız korunur. eksplant yapısı ve davranışları karmaşık. Ölçek çıkarıldığında balık kanama yok gibi, yüzeysel epidermal katmanlar daha fazla ölçek ile kaldırılır olası değildir. Hücrelerinin büyük bir çoğunluğu, bir anti-E-kaderin antikoru 14 leke görüldüğünden ölçekler ilk balık kaldırıldığında keratosit eksplant baskın hücre tipi olduğu görülmektedir. Ayrıca, bağışıklık 14 vimentin boyanma olmaması ile değerlendirildiği gibi, ilk kültür fibroblastların bir kanıt yoktur. Ancak, tekrarlanan ölçekli kaldırılması ile, eksplant sayısız nötrofiller olduğu görülmektedir (Videoyu 1). LPS&#39;ye maruz Biz, büyüklükleri, hızlı bir şekilde hareketliliği ve hücre zarının dışına göçlerine morfolojik gözlemlerine dayanarak nötrofiller gibi bu hücreleri belirledik (veriler gösterilmemiştir). Buna ek olarak, bu hücreler, parlak wit lekenötrofil sitosolik faktörü gibi olan kendi yüzeyi üzerinde bol FcR&#39;yi olduğunu gösterir ikincil IgG antikorları, çeşitli için bir antikor (veriler gösterilmemiştir) h. Çoklu hücre tabakaları eksplant içinde mevcut. Konfokal mikroskopi altında, üstünde, ve hücre keratosit levhalar arasındaki görünür nötrofiller ölçeğin yanında keratositlerin ikiden daha fazla katman için öncü kenarında tek bir tabaka mevcudiyetini ortaya koymaktadır. Erken zaman noktalarında, ~ 145 mm / saat başlangıç ​​fiyatla eksplantından keratositlerin toplu göç başlatan çok katmanlı eksplant polarize kenarında hücreler. Eksplant tarafından kaplanan alan hızla artar tabaka içinde, gerilim yayılan hücreye giden ve ön kenarın önceden bir azalma oranı. Lider ve takipçi hücreleri arasındaki hızlı dönüşümleri tabaka 7 içinde kendiliğinden oluşan deliklerin oluşumu ve kapatılması sırasında önde gelen kenarında görülmektedir. OlarakEksplant ile başlatılan EMT süreç sac parçaları ve keratositler kendi uzmanlık, hızlı hareketliliği kaybetmek, devam ediyor. Gen ifadesi ve EMT ile uyumlu morfolojik değişiklikler, yara iyileşmesi ve inflamatuar yanıtlar eksplant yaklaşık 10 gün 14 için geçerli kabul ediliyor kültür 7 gün içinde ortaya çıkar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Dolayı eşsiz hareketli özellikleri, balık keratositler eksplant kültürleri, uzun tek hücre göçü mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır ayrışmış. Motilite hızlı oranları, bir dik aktin kablosu ile geniş aktin-zengin lamel, ve nispeten sabit hız ve: eksplant kurulmuş Ancak, bu hücreler de bireysel göç incelemek için cazip bir model keratositler yapmak birçok özellikleri koruyarak, topluca hareket göç yönü. Erken eksplantlarda, toplu göç edenlerin ayrı ayrı göç hücrelerin hızlı bir ara-geçiş modunu belirlenmesinde hücre-hücre yapışıklıklar rolü çalışma sağlar, ve göç iki mod arasında moleküler bağları vurgulamaktadır. Mezenkimal geçiş bir epitel oluşur ve yara iyileşmesi ve enflamasyon ile ilişkili genlerin farklı ifade olarak daha sonraki eksplantlarda Hücreler hızla ve toplu göç etme yeteneklerini kaybederler. Bu nedenle, keratosit eksplantlar deri yara iyileşmesi sırasında görülen ve gen sentezleme değişikliklerin belirli bir programı kapsamında toplu hücre göçü mekanizmaları incelemek için benzersiz bir sistemi temsil edebilir reepithelialization için bir in vitro model olarak hizmet edebilir. Mutant ve transgenik zebra balığı hatlarının çeşitli mevcuttur eksplantlar, farklı genetik geçmişlerde, balık tesis edilmesi için izin verilmiştir. Bu durum, bu süreçler içinde farklı protein rolü benzersiz tepki verebilir. Burada belirtilen protokoller toplu hücre göçü ile ilgili bir çok analizde kullanım için olan bu eksplant kültürleri oluşturulması için kolay ve etkili bir yöntem tarif eder.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, keratositlerin yaprak eksplant kültürünü kurma saat içinde ölçek altında dışarı doğru yer değiştiren gözlenebilir. Bazen, toplu göç levha koptuğunu bir bireysel göç keratosit görülebilir. Eksplant önce koparıp olan bir balık kurulmuştur Buna ek olarak, tabaka içinden göç bol nötrofiller bulunmaktadır. Uzun kültür dönemlerde, hücreler gibi keratosit sac parçaları EMT 14 uğrarlar. sac ilerle...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Balığı keratositler eksplantlardan hücre tabakaları hareket eder ve epitel yara iyileşmesi bağlamında toplu hücre göçü mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir in vitro model sağlar. Bu protokoller detaylı toplu hücre göçü tahlillerde kullanılmak için primer eksplant kültürleri oluşturmak için etkili bir yoldur.

Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Görüntüleme.  Midwestern University.  Balığı keratositler eksplantlardan hücre tabakaları hareket eder ve epitel yara iyileşmesi bağlamında toplu hücre göçü mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir in vitro model sağlar. Bu protokoller detaylı toplu hücre göçü tahlillerde kullanılmak için primer eksplant kültürleri oluşturmak için etkili bir yoldur. 

Video: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Gelişim Biyolojisi

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.