This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Bodrum Membran Matrix hazırlanması ve Plasticware Kaplama <ol><li> Buz üzerine -20 ° dondurulmuş bazal membran matris stok yerleştirin ve 4 ° C&#39;de bir gece eritin. </li><li> Çözündükten sonra, önceden soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine taban membran matrisi pipet 2 mg&#39;lik parçalara. Gerekli olana kadar -20 ° C&#39;de bu saklayın. </li><li> , Bazal membran matris kaplı plakaları hazırlamak Eppendorf tüp kaybolana buz son parçası (genellikle 2 ~ içinde saat) kadar buz üzerinde bir kısım Çözülme için. </li><li> Çözündükten sonra, bazal membran matris kaplama çözeltisi yapmak için soğuk (4 ° C), DMEM / F12 içinde 12 ml kadar bazal membran matrisi ekleyin. </li><li> Uygun bir kültür teknesine bazal membran matris solüsyonu ekleyin. 6-çukurlu plaka için, oyuk başına 1 ml akıtın. Bazal membran matris çözümü tamamen her iyi kapsar emin olmak için plakayı girdap. </li><li> Parafilm bazal membran matris kaplı plaka / çanak mühür ve roo inkübekullanımdan önce 1 saat m sıcaklığı. Seçenek olarak ise, mağaza bazal membran matris kaplı plakalar / 4 ° C&#39;de yemekleri ve kaplamanın 2 hafta içinde kullanın. NOT: kurumasını önlemek için bazal membran matris kaplı plaka / çanak ekstra DMEM / F12 ekleyin. 4 ° C &#39;de depolanmıştır bazal membran matris kaplı plaka / çanak kullanmadan önce, bir biyolojik güvenlik kabini içine koyun ve en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin. </li><li> Tam ortam ve hücreler ilave edilmeden önce aspire taban membran matrisi. </li></ol> E8 ortamının 2. Hazırlık <ol><li> 4 ° C&#39;de gece boyunca E8 takviyesi çözülme E8 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 500 ml stoktan E8 bazal ortam 10 ml çıkarın ve atın. </li><li> Doğrudan E8 bazal ortam 490 ml E8 takviyesi tüm 10 ml flakon Pipet. Tekrarlanan sıcaklık dalgalanmaları comple içinde bFGF düşürebilir gibi, bir 37 ° C su banyosunda değil sıcak komple E8 orta yapınte E8 ortamı. </li><li> Eki ek 2 hafta içinde tam E8 ortamı kullanın. </li></ol> IPSCs 3. Çözülme <ol><li> Kuru buz üzerinde, sıvı azotun ve yerden dondurulmuş iPSCs bir şişe çıkarın. </li><li> Hızla bir 37 ° C su banyosunda şişeyi çözülme; buz kalıntıları sadece küçük bir parçası kadar su banyosunda şişeyi girdap. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini% 70 etanol ve transferi ile şişeyi püskürtün. </li><li> Doğrudan flakon oda sıcaklığı E8 orta damla damla 1 ml ekleyin. </li><li> 2 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, 15 ml konik bir tüp içinde E8 ortamın 9 ml hücre süspansiyonu, damla damla aktarın. Hücreler ve orta hızlı iyice karıştırın sağlamak için sık sık tüp girdap. </li><li> 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı havalandırın, ve 10 uM Y-27632 ile takviye E8 uygun hacimde bir hücre pelletini. </li><li> Bodrum uygun sayıda hücrelerin ekleyin membrangecede 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör e matris kaplı kuyuları ve yer. Bu çözmeden sonra hızlı bir iyileşme sağlamak için, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğu başına en azından 0.2 x 10 6 IPSC plaka tavsiye edilir. </li></ol> 4. Bakım ve iPSCs rutin Pasajlanması <ol><li> Günlük E8 orta yenileyin. </li><li> Bir inverted mikroskop ile morfolojisi ve hücre konfluent izleyin. yüksek kaliteli iPSCs farklı sınırları düz koloniler halinde büyür; Bireysel koloniler &quot;Arnavut kaldırımı gibi&quot; bir görünüm sahip. </li><li> Passage iPSCs hücreler ~ 70% confluency ulaştığınızda. </li><li> 0.9 g NaCI ve 500 ml DPBS 500 ul 0.5 M EDTA ilave ederek bir EDTA pasajı çözelti hazırlayın. Sterilize etmek NaCl ve vakum filtresi çözmek için iyice karıştırın. Pasajlayarak önce 37 ° C&#39;lik bir su banyosu içerisinde pasajı çözeltisi bir kısım ısıtın. </li><li> Geçit için, aspirat kültür ortamı geçirdi ve sıcak pas eşit hacimde ile bir kez hücreleri yıkayınçözelti saging. Kaplamak için aspire ve pipet yeterli EDTA pasajı çözeltisi hücreleri (6-çukurlu plaka içinde çukur başına 1 mi). </li><li> Ters döndürülmüş bir mikroskop altında hücre yerleştirin ve iPSC kolonilerin. koloniler ve yükseltilmiş sınırları içinde delik görünümü 2 ila 5 dakika içinde belirgin hale gelmelidir. </li><li> Dikkatle EDTA Pasajlanması çözüm aspire. </li><li> Şirketinden de geçişli her içine yüksek basınç altında (6 çukurlu bir plaka kullanılarak varsa) 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, E8 ortamının 4 ml dağıtmak. </li><li> IPSC kümeleri toplamak, ve 1 ila bölme oranına bağlı olarak, deliklerin bir uygun sayıda bölünmüş: 01:12 ila 8. Aşırı pipet, hücre kümeleri parçalanma zayıf canlılığı neden olur vermeyin. </li><li> Bir inkübatör plaka koyun, ve hücreleri dağıtmak için geri ve ileri-ve yan-yan birkaç kez plaka sallayın. </li></ol> Tansfection için MEF&#39;ler ve iPSCs 5. N- <ol><li> Transfectio 48 saat önceN, geçit iPSCs ~ 1 için: bir bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plaka dört veya daha fazla kuyu içine 6 iki gün dolayısıyla% 70 konfluent olacak şekilde. </li><li> Bir sonraki gün,% 10 FBS ve 1 x MEM-NEAA ile takviye edilmiş DMEM (yüksek glukoz) &#39;den oluşan MEF ortam içine DR4 MEFS eritin. </li><li> • 2 x 10 4 hücre / cm2 de iki adet 10 cm&#39;lik kaplar içine levhalar DR4 MEFS ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. </li><li> Transfeksiyondan bir gün, 30 dakika iPSCs üzerinde transfeksiyon gerçekleştirilmeden önce 10 uM Y-27632 ile takviye edilmiş E8 MEF aracını değiştirme. </li><li> İsteğe bağlı: iPSCs transfeksiyondan akış sitometrik analizi, arzu edildiği takdirde, oda sıcaklığında, bir bazal membran matris ile kaplanmış 4 ° C plaka ve yer çıkarın. </li><li> İsteğe bağlı 4 saat, transfeksiyondan önce, 10 uM nihai konsantrasyon-Y-27632 ile ön transfeksiyon iPSC kültür tamamlar. </li></ol> 6. Nazik-hücreli Ayrılma Reaktif Tedavind transfeksiyonu iPSCs bir Elektroporasyon Sistemi kullanılarak <ol><li> 4 ° C ve P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonu çıkarın ve ~ boyunca oda sıcaklığına 30 dk gelmesini sağlar. Kullanımdan önce transfeksiyon çözeltisine, tüm 100 ul ek ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;lik bir su banyosu içinde sıcak nazik-hücre ayrıştırma reaktifi. </li><li> AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 ve PZT-AAVS1-R1), -20 ° C ve AAVS1-CAG-EGFP donör elde edilir. </li><li> Inkübatörden iPSCs çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkanır. </li><li> Oyuk başına nazik-hücre ayrıştırma reaktifi 1 ml ilave edilir, ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe iPSCs veya hücrelerin% 50&#39;den daha fazla kültür teknesine ayrışmış kadar. </li><li> Yukarı ve kültür kabından kalan hücreleri ayırmak için, ve iPSC öbekler kırmak için bir P1000 pipet kullanarak birkaç kez aşağı hücreleri pipetle. </li><li> Fürth için 10 ml&#39;lik pipet kullanarak her bir kuyunun E8 orta 2 ml ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kezer tek hücre içine hücre kümeleri parçalara ayırma NOT: hücre kümeleri yeterince ayrıştırılmış değilse Transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde azalır. </li><li> 3 dakika boyunca 100 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp içinde iPSCs ve santrifüj toplayın. </li><li> E8 ortamının en az bir miktarda aspire yüzer madde ve tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Bir canlı bir boya gibi% 0.4 tripan mavisi uygulanmasından sonra bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. (&quot;Küme&quot; başına 1-3 hücre) sayım sırasında hücreler yeterince ayrışmış emin olun. </li><li> İki 15 ml konik tüplerin her birine 3 x 10 6 hücre koyun ve 3 dakika boyunca 100 xg&#39;de tekrar aşağı doğru döndürün. NOT: Düşük hız santrifüj hücre stresi azaltır ve elektroporasyon önce iPSCs kolay yeniden asılmasını sağlıyor. </li><li> İnsan embriyonik kök hücre hattı H9 (Program CB-150) hücre tipi özel program elektroporasyon sistemi ayarlayın. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, cel süpernatant aspirel peletler. Bir pelet için, kontrol örneği olarak, sıcak verici 10 ug ekleyin. Diğer pelet 5 mikrogram ile birlikte İK donörün 10 ug, eklediğiniz her deney numune olarak TALEN (PZT-AAVS1-L1 ve PZT-AAVS1-R1). </li><li> P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonundan 100 ul her bir hücre pelletini, bir küvete aktarılır. </li><li> Transfeksiyon gerçekleştirin ve hemen her küvete oda sıcaklığı E8 orta 500 ul ekleyin. </li><li> Adım 5.4 hazırlanan DR4 MEFS içeren bir 10 cm&#39;lik çanak transfekte iPSCs damla damla aktarın. </li><li> İsteğe bağlı: Transfeksiyon verimi analizlerinin nasıl sitometri akışı istendiği takdirde, bir bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plaka içinde bir kuyuya her bir deney birkaç damla ekleyin. </li><li> Tekrar her iki örnekleri bitirmek için 6,15-6,17 adımları. Ertesi gün, DPBS hücreleri iki kez yıkayın ve E8 daha besleyici daha iyi iPSC kültürünü desteklemek için görünür NutriStem, kültür ortamı geçmek. </li><li> Tr48 saat sonrası transfeksiyon 72 en ansient EGFP ifade zirveleri; arzu edilen transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek. </li></ol> Hedefli iPSCs 7. puromisin seçimine <ol><li> IPSCs% 70 confluency ulaştığında puromisin Seçimi transfeksiyondan sonra 72 saat başlayın. </li><li> NCRM5 iPSCs için NutriStem kültür ortamında seyreltilmiş 0.5 ug / ml puromisin (1/2 tam doz) ile puromisin seçimi başlar. Optimal puromisin konsantrasyonu 0.25 bazı iPSC hatları için 1 ug / MLL bağlı olarak değişebilir. </li><li> Günlük olarak orta ferahlatıcı 3 gün NutriStem ± 0.5 ug / ml puromisin Kültür iPSCs. </li><li> 3 gün sonra, 1 ug / ml puromisin konsantrasyonunun arttırılması için. </li><li> / Ml puromısin seçimi 1 ug altında Kültür iPSCs başka bir 7 ila 8 gün için, ya kadar farklı koloniler koloni toplama için yeterince büyük görünür. </li></ol> 8. Koloni Toplama ve Hedeflenen iPSCs Yaygınlaştırılması <ol><li> Kullanım bazal membrankaplamak için matris, her oyuğa (12 mi DMEM / F12 içinde seyreltilmiş, 2 mg bazal membran matris) bazal membran matris kaplama solüsyonu 50 ul dağıtma ile 96 oyuklu plaka. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca, kullanımdan önce plaka saklayın. </li><li> Bazal membran matris kaplı plaka, oda sıcaklığına gelmeye bırakıldıktan sonra, bazal membran matrisi aspire ve 10 uM Y-27632, her bir oyuğa ile takviye edilmiş 100 ul E8 dağıtın. </li><li> Bir biyolojik güvenlik kabini içine ters bir mikroskop yerleştirin ve sterilize etmek için% 70 EtOH ile hafifçe sprey. </li><li> Ucunda küçük bir &quot;kanca&quot; olan ideal bir koloni toplama aracı edinmek için Bunsen beki üzerinde cam Pasteur pipet çekin. % 70 EtOH ile sterilize ve kurumaya kaputun yerleştirmek. </li><li> Inkübatör hedeflenen iPSC kolonileri içeren çanak çıkarın ve mikroskop altında kaputun içine yerleştirin. </li><li> Koloni toplama aracı ile koloni sınır etrafında bir daire izleme tarafından iPSCs seçin.</li><li> Hafifçe kazıyın ve plaka yüzeyinden iPSC kolonisi kaldırmak için koloni-toplama aracı &quot;kanca&quot; kullanın. Daha büyük koloniler için, koloni tekrar kaplamadan sonra hücre büyümesini kolaylaştıracak çeyrek koloni toplama aracı ile bir X çizim. </li><li> Hücre kümeleri müstakil ve serbestçe yüzen sonra, iPSCs toplamak için ~ 30 ul set P200 pipet kullanın. Doğrudan 96 oyuklu bir plakaya Levha hücreleri. </li><li> İsteğe bağlı: daha sonra 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca sindirimi 50 ul nazik-hücre ayrışma reaktifmi, bir Eppendorf tüpüne iPSCs toplamak için ~ 5 ul ayarlanmış bir p20 pipet kullanın. Sindirimden sonra, yumuşak-hücre ayrıştırma reaktifi seyreltilmesi ve 5 dakika için standart bir masa üstü mikrosantrifüj 200 xg&#39;de hücreleri yavaşlamalarını Eppendorf tüpüne, 500 ul E8 orta ekleyin. Daha sonra sıvı ortamı en iyi aspire ve • tekrar süspansiyon ve 96 oyuklu bir plakaya hücreleri aktarmak için 30 ul bırakın. NOT: Buyaklaşım hücre küme ve aldı koloninin hızlı genişleme ayrışma kolaylaştıracaktır. </li><li> IPSC koloniler yeterli sayıda toplanmıştır kadar koloni toplama devam (kabaca deney başına 20-30 kolonileri tavsiye edilir). </li><li> Koloni toplama sonra, gece boyunca bir kuluçka makinesi içinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir. Tam E8 orta Ertesi gün, ve kültür 70 ~ kadar% konfluent ile yenileyin. </li><li> Içine 96 oyuklu geçişin hücreleri, 24-çukurlu, daha sonra bir 6-çukurlu, adım 4,5-4,10 hazırlanır. NOT: 6-çukurlu plaka daha küçük kuyu kullanıldığında EDTA çözeltisi ve E8 ortamının hacmi orantısal olarak azaltılmalıdır. </li><li> Rastgele eklenen vektörlerin 16 hedeflenmiş kaset entegrasyonu ve yokluğunu onaylamak için kavşak PCR ve Southern blot analizi ile hedefleme başarısını değerlendirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts.">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration.">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li><li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer.">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li><li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+insulator+in+AAVS1,+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA.">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells.">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells.">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering.">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human.">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells:+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting.">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li><li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease.">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

(1) verimli transfeksiyonla iPSCs içine TALEN ve donör plazmitlerini teslim;: AAVS1 güvenli liman başarılı nesil için en kritik adımlar insan iPSCs vardır hedefli (2) transfeksiyondan sonra transfeksiyon ve kaplama yoğunluğu önce tek hücre içine iPSCs ayrılmasını optimize; (3) doz ve iPSC hattının büyüme dayalı ilaç seçimi süresi optimize; (4) dikkatli diseksiyon ve hedeflenen koloniler toplama ve / kuyu yeni plaka transfer. Hockemeyer en kağıt 10 kullanılan benzer yöntemlerle kar...

embriyonik kök hücre benzeri uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine (iPSCs), insan somatik hücreleri yeniden programlamak için yeteneği ilk olarak Takahashi ve arkadaşları tarafından keşfedildi. 2007&#39;de 1. retrovirüsler dört transkripsiyon faktörlerini ifade ile transdük İnsan dermal fibroblastlar (so-dublaj Yamanaka Oct3 faktörleri / 4, Sox2, c-Myc ve Klf4) morfoloji, çoğalması, gen ekspresyonu ve epigenetik durumuna göre, insan embriyonik kök hücreler (HESC) büyük ölçüde benzer olduğu gösterilmiştir; önemlisi, iPSCs da, tüm üç germ 1 hücrelerine ayrım yapabilmektedir. iPSCs çoğalma potansiyeli ve farklılaşma kapasitesi onlara çok cazip araçlar yapar; Belirli hastalıklara yakalanmış hastalardan alınan hücrelerin yeniden programlanması, iPSCs, in vitro bir hastalık modeli olarak ve potansiyel terapötik maddeler olarak hem de kullanılabilir. İkinci amaçla, çeşitli konularda iPSCs tam potansiyeline önce ele alınmalıdırKlinik bir ortamda gerçekleştirilebilir; In vitro kültürlenmiş HESC ve iPSCs, yeniden programlama ve hücre bakım sırasında ksenojenik türevlerinin kullanımına tümörojenik potansiyeli ve in vivo olarak nakledilen hücrelerin izlemek için olan ihtiyaç en Hentze et tarafından yapılmıştır pluripotent kök hücrelerin klinik uygulama (tüm önemli engeller vardır. 2). Farklılaşmış hücreler transplantasyon sonrası izleme ihtiyacı için ideal bir çözüm ne olursa olsun uygulama susturulması ve renklilik direnen bir görsel tespit işaretleyici içerecektir. Eksojen DNA güvenli liman loci içine sokulduğunda entegre transgenlerin sağlam ve kalıcı sentezleme en kolayca elde edilebilir; yani, bir entegre vektör yeterli transkripsiyonunu sağlayacak genomik siteleri komşu genlerin 3 ifade düzensizlikler hafifletici aynı zamanda da. Çok iyi keşfedildiğinden beri karakterize edilmiştir Böyle bir site adeno-ilişkili virüs, Integr olanprotein fosfataz 1 düzenleyici alt birimi 12C (PPP1R12C) geninin ilk intronu içinde tirme Alanı 1 (AAVS1). Bu odağı sürekli ve genişletilmiş zaman içinde entegre transgenlerin sağlam ifade kültürü ve in vitro farklılaşma 3, aynı zamanda transkripsiyonel pertürbasyon 4 genlerin çevreleyen korumak için izin veren değil, sadece gösterilmiştir; Her iki özellik nedeniyle AAVS1 sitesini 5 yan endojen kromatin izolatör elemanlarının varlığı olduğu düşünülmektedir. Sadece son on yılda genom mühendislik araçları gelişmeler büyük ölçüde herhangi bir hücre tipinde genetik manipülasyonlar elde edilebildiği kolaylığı ve verimliliği kolaylaştırmıştır. Erken başarılı deneyler EKH 6,7 hedefleme geni elde etmek için bir tanıttı donörü ile endojen homolog rekombinasyon (HR) olarak son derece düşük seviyelerde dayanıyordu ederken, çinko parmak nükleazlardır (ZFNs), signi ki gibi site-spesifik nükleazlara, kullanımıficantly, bu gibi deneylerin 8,9 verimliliğini arttırdı büyük bir çift-iplikçikli DNA kırılmasının nesil ile homolog rekombinasyonu teşvik eder. Her iki transkripsiyon aktivatörü gibi etkileyicilerin bitki patojeni xanthomanas cinslerin (Tales) ve prokaryotik kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) verimli site-spesifik tasarımcı nükleazlara içine / Cas9 sistemi yeniden amaç pluripotent kök hücreleri hedef geni yaptı erişilebilir ve Uygulanabilir metodoloji 10-13. Yeni bir kağıt TACE&#39;nin nükleazlar (TALENS) 14 kullanılarak insan iPSCs olarak AAVS1 güvenli liman lokusuna yeşil flüoresan raportör kaseti kararlı entegrasyonu için etkili bir yöntem açıklamıştır. Bunlar hedeflenen iPSCs böyle bir programı için güçlü kanıtlar sunan, hatta miyokard infarktüsü (MI) bir fare modeli kardiyomiyositlerinin ve transplantasyon yönelik farklılaşma sonra floresan devamstabil floresan pluripotent kök hücreler 14. Hedeflenen koloniler elde etmek için, bir gen trap yöntemi bir ekleme-alıcı (SA), 2A kendi kapanan peptid dizisi, endojen PPP1R12C promoterinin kontrolü altında puromisin, N-asetil-transferaz (PAC) geni yerleştirir, burada kullanıldı; Böylece, AAVS1 lokustaki DNA donör dahil yalnızca iPSCs puromycin direnci dayalı seçilebilir onları render, PAC ifade; (Şekil 1, 15). Bu protokole göre iPSCs, AAVS1 GFP iPSCs TALENS ile iPSCs transfekte süreci ve AAVS1 güvenli liman lokusunun bir 4.2kb DNA fragmanı entegre etmek için bir 9.8 kb verici de dahil olmak üzere, son kağıt 14 bildirilmiştir üreten seçilmesi işlemlerini detayları puromisin-dirençli ve klonal genişleme için çekme kolonileri. Burada tarif edilen teknikler bir çok genom mühendisliği deneylere uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Protokolün bir görselleştirme iPSCs NutriStem için ya E8, yeşil veya mavi tarafından vurgulanan farklı bir ortam içinde kültürlenir dönemlerin, Şekil 2&#39;de verilmiştir. Sadece yüksek kaliteli iPSCs transfekte etmek önemlidir; Rutin bakım boyunca kültür yemekleri incelemek ve iPSC kültürleri bir Arnavut kaldırımı gibi morfoloji taşıyan başta farklı koloniler (Şekil 3A) içerdiğini doğrulayın; farklılaşmış hücre kültürünün% 10&#39;dan fazla işga...

Watch this Scientific Journal Video about Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor at JoVE.com

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.3K Görüntüleme.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Video: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Gelişim Biyolojisi

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

İndüklenmiş Pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer Chimeric fare modeli

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...