Name: identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies at JoVE.com

NIAMS ışık Imaging mikroskoplar ve teknik yardım sağlamak için bölüm teşekkür ediyoruz. MF20 ve Pax7 antikor bankadan gelişim çalışmaları Hibridoma NICHD himayesinde geliştirilip Biyolojik Bilimler Bölümü Iowa Üniversitesi Iowa City tarafından elde edilmiştir. Bu eser Intramural araştırma programı, NIAMS tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri ile desteklenmiştir.

Bu protokol için yetişkin fareler (2-6 ay), tibialis anterior (TA) ve ekstansiyon digitorum longus (EDL), ön arka bacak kasları üzerinde onların SCs boyama ayirt gerçekleştirmek için bir örnek olarak istihdam edildi. Tüm belgili tanımlık merdiven fareler ve kas doku gruptakiler hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), NIAMS/NIH tarafından onaylanmış.
1. fare Hind Lime TA/Edi kas incelemek
<ol><li>Fareyi NIH ACUC kurallar altında bir CO2 dolu ötenazi odasında ötenazi. Servikal yerinden çıkması gerekiyorsa gerçekleştirin.</li>
	<li>Fare yukarı bir diseksiyon üzerinde (sırtüstü) koymak. % 70 etanol karın derisi üzerine sprey. Bir 1-2 cm yatay olarak fare göbek Cilt Merkezi üzerinde açma kesebilir ve sonra fareyi fare ayakları doğru açılış çekerek deskin. Fare hind bacak bir tarafı ortaya çıkarmak.</li>
	<li>İki keskin forseps kullanın: ayak bileği için TA/Edi eklemek tendonlar tutmak için kullanın ve break ve TA/Edi kapsayan fasya yamultmak için diğerini kullanın. Fasya soyulmuş sonra forseps keskin ucu ucunu TA/Edi kas altında çalıştırarak TA/Edi tibia kemikten ayırmak için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Ayak bileği tendon hala onları Forseps ile tutarak makasla kesme. Forseps ile TA/Edi ayak bileği taraftan kaldırma sırasında diz için TA/Edi ayak bileği dan uzunlamasına çizgi boyunca makasla kas kırpın. Bütün TA/Edi tibia dan ayırmak için diz tarafı tendonlar kesilmiş.</li>
</ol>2. Cryo-gömme TA/Edi kas
<ol><li>Bir kap içinde örneğinbir sıvı azot Banyosu hazırlamak., sıvı nitrojen Dewar flask. Methylbutane yarısı dolu için küçük plastik kabı (yaklaşık 20 mL) içine dökün. Sonra kabı dondur için sıvı azot banyoda koymak. Birkaç dakika sonra methylbutane donuk olduğunu denetleyin. Not: Sıvı azot kuru buz bir kova tarafından değiştirilebilir, ancak daha yavaş dondurma zamanı.</li>
	<li>Küçük plastik enjektör pompası düz yüzeyine disseke TA/Edi yatıyordu. Tam olarak TA/Edi ile birkaç damla, en uygun kesme sıcaklık (O.C.T.) bileşik (dondurucu orta) kapsar.</li>
	<li>Sıvı azot banyosu dışında methylbutane kabı alın ve sıcak bir nesne ile yüzey çözülme (örn., makas tanıtıcısı). Hızlı bir şekilde DIP O.C.T. TA/Edi pistonu üzerinde ek-doku dondurmak için erimiş methylbutane kapalı.</li>
	<li>Forseps ile pistonu katıştırılmış dokusundan ayırmak ve 1.5 mL microcentrifuge tüp içine koy. Daha fazla örnekleri işlerken depolamak için sıvı azot tüpü yerleştirin. Not: Katıştırılmış doku-80 ° C-20 ° C veya uzun vadeli (2 yıl) için kısa vadeli (6 ay) saklanır.</li>
</ol>3. cryostat kesit
<ol><li>O.C.T. bir cryostat numune sahibinin Merkezi bileşik bir damla ekleyin. O.C.T. bileşik neredeyse katılaşmış kadar bekleyin. Hızlı bir şekilde katıştırılmış TA/Edi O.C.T. karışımla, ayak bileği tarafı dik için sopa aşağı ve diz tarafı yukarı.</li>
	<li>Numune tutucu bir cryostat üzerine monte, doku 10 µm Aralık kesme ve cryo-bölümleri ile kaplı frost slaytlarda ilgili toplamak bir slayt bölümlerde 4-8.</li>
	<li>Bölümler için en az 3 saat gece oda sıcaklığında kuru. Not: dondurucu gece veya daha uzun bölümlerde kurutma kabul edilebilir olsa da, bu kaçınılmaz autofluorescence artıracaktır. En iyi sonuçlar için Kuru bölümleri için 0,5 h, sonra devam edin fiksasyon ve boyama adımları ile hemen.</li>
	<li>Slaytları bir slayt kutusunda toplamak ve bunları hemen kullanmak veya slaytları-80 ° C veya daha sonra kullanmak için-20 ° C, depolama.</li>
</ol>4. ayirt boyama için hazırlanması reaktifler
<ol><li>
Arabellekleri hazırlayın:
	<ol>
<li>2 L 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 10 x PBS hazırlayın.</li>
		<li>1 x PBS % 16 dan % 4 paraformaldehyde (PFA) 40 mL hazırlayın PFA.</li>
		<li>PBST 2 L hazırlamak: 1 x PBS ile % 0,1 Triton-100.</li>
		<li>PBST-B: PBST 50 mL % 2 sığır serum albumin (BSA) ile hazırlayın.</li>
		<li>10 mL PBST-B-G: PBST % 2 BSA ve % 5 Normal keçi Serum ile hazırlayın.</li>
		<li>1 mL engelleme çözeltisi hazırlamak. Seyreltik AffiniPure Fab parçası keçi Anti-fare IgG (H + L) (1:10) PBST-d.</li>
		<li>200 mL 1 x sitrat arabelleği hazırlayın. Not: Yukarıdaki çözümleri hacimleri en az 5 slayt için yeterlidir. Birimleri istediğiniz slayt sayısını ve slayt konteyner boyutunu göre ayarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antikor lekeleri hazırlayın:
	<ol>
<li>Birincil antikorlar (çalışma konsantrasyonu): birincil antikor Mix 1.2 mL Pax7 fare Monoklonal antikor (Igg1) sulandrarak hazırlamak (1-5 µg/mL) + Laminin tavşan poliklonal antikor (0,5-2 µg/mL) + MF20 fare Monoklonal antikor (Igg2b) (0,5-2,5 µg / mL) içinde PBST-B-G. Not: MF20 fare Monoklonal antikor (Igg2b) isteğe bağlıdır.</li>
		<li>İkincil antikorlar (çalışma konsantrasyonu): ikincil antikor Mix 1.2 mL keçi Anti-fare Igg1 çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor 488 sulandrarak hazırlamak (0,5-2 µg/mL) + keçi Anti-tavşan IgG (H + L) son derece çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor artı 555 (0,5-2 µg/mL) + keçi Anti-fare Igg2b çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) içinde PBST-B-G. Not: Alexa Fluor 647 seçime bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ayirt boyama adımları
<ol><li>
Suyla temasa ve cryo-bölümler PFA ile düzeltin.
	<ol>
<li>Birkaç TA/Edi cryo-bölümü slaytları slayt kutusundan kaldırın. Slaytları bir slayt tutma tepsi oda sıcaklığında ısıtın.</li>
		<li>Bir sıvı engelleyici kalem (PAP kalem) tüm cryo-bölümleri slayt içeren bir çizmek için kullanın. Bu daire çözümleri slaytın dışına akan önlemek.</li>
		<li>Tepsiyi laboratuvar duman kukuIeta götür. 300-500 µL % 4'lük eklemek PFA daire içinde alanı içinde slayda 10 dk. dışarı PFA 1 x PBS ile yıkama için oda sıcaklığında bölümleri düzeltmek için en az 3 x 5 dk bir slayt kap içinde. Dikkat: PFA zehirli ve tehlikeli atık olduğunu; özenle işletilen ve tehlikeli atık konteyner içine atılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antijen alma
	<ol>
<li>Başka bir slayt konteyner sitrat arabellek 200 mL ile doldurulması.</li>
		<li>Slaytları konteyner içine aktarın. Slaytları yüksek basınç modunda 10 dk pişirmek bir düdüklü tencere kapsayıcı slaytlar ile aktarın.</li>
		<li>PBST (200 mL) ile yeni bir kapsayıcı tüm slaytlara 10 dk. Transfer için su boşaltma ile konteyner sakin, PBST ile slaytlar için en az 3 x 5 dakika yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Engelleme
	<ol>
<li>Kimwipes suya batırılmış slaytları slayt kurutma önlemek için nemli bir ortam oluşturmak için tutan tepsisi.</li>
		<li>Slaytlar geri tepsiye hareket ve çözüm her slayda engelleme 200 µL ekleyin. Tepsiyi bir kap ile kapak ve geliştirmek için 30 dk engelleme izin. Not: yüksek arka plan oluşturan fare IgG fare Kas dokularında belirsiz bağlama yani fare Monoklonal antikor Pax7 antikor var. AffiniPure Fab parçası keçi Anti-fare IgG (H + L) kullanarak fare fare belirsiz bağlama engeller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Birincil antikorlar uygulanır.
	<ol>
<li>Slaytlar slayt kapsayıcısında bir kez PBST ile yıkayın. Ardından slaytları yeniden boyama tepsi taşıyın.</li>
		<li>Birincil antikor Mix 200 µL her slayta uygulamak, tepsiyi bir kap ile kapak ve 1 h için oda sıcaklığında veya gece kalmak için 4 ° C'de geliştirmek tepki izin. Not: oda sıcaklığında reaksiyon gelişen tatmin edici sonuçlar verir, ancak en iyi sonucu 4 ° C'de gecede tepki verir. Myosin MF20 antikor karışımı bir üçlü (Pax7, Laminin, MF20) etiketleme gerçekleştirmek için eklenebilir. MF20 lekeleri kas lifleri farklı. Bu adımı da ikincil antikorlar (keçi antikorlar) aşağıdaki adımda potansiyel belirsiz bağlama azaltmak için PBST-B-G ile başka bir engelleme adım olarak hizmet vermektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İkincil antikorlar uygulanır.
	<ol>
<li>Oda sıcaklığında PBST ile antikor birincil dışarı yıkama en az 3 x 5 dak.</li>
		<li>İkincil antikor Mix 200 µL her slayta eklemek ve oda sıcaklığında en az 1 h için geliştirmek tepki sağlar. Not: Pax7 + Laminin, keçi Anti-fare Igg1 Alexa 488 ve keçi Anti-tavşan Alexa 555 kullanın. Pax7 + Laminin + MF20 için keçi Anti-fare Igg2b Alexa 647 karışımı ekleyin.</li>
		<li>PBST ile ikincil antikorlar dışarı yıkama en az 3 x 5 dak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) Counter leke ve montaj
	<ol>
<li>DAPI (1:20, 000) PBST slayt kapsayıcısında, örneğin, DAPI 10 µL PBST 200 ml seyreltik.</li>
		<li>3 dk. DAPI kapsayıcısı içindeki slaytları leke.</li>
		<li>PBST ile DAPI dışarı en az 5 x 5 dakika yıkayın.</li>
		<li>Montaj orta slaytlarla bağlayın. Coverslips ile slaytlar kapağı. Dikkat: Zehirli ve tehlikeli DAPI; dikkatli ve tehlikeli atık şişe bertaraf gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. floresan mikroskobu
Not: yukarıda bildirilen immünfloresan boyama protokolü ile bir geniş alanlı floresan veya confocal mikroskop SCs görselleştirme izin verir. SCs tanımlamak için başlangıçta zor olabilir. Burada yardımcı olabilir birkaç önerilen adımlar vardır.
<ol><li>DAPI kanal ve düşük büyütme hedefleri slaytlardaki bölümler görselleştirmek için kullanın.</li>
	<li>Düşük-yüksek boyuta geçiş. SCs gözlemlemek için en az bir 20 X amaç gereklidir).</li>
	<li>İkili filtre küp 488 (FITC) için kullanmak / 555 (rodamine) Pax7 ve Laminin gözlemlemek için SCs tanımlamak için aynı anda sinyalleri. Bu ayarı altında arka plan gürültü daha iyi bir kontrast Pax7 boyama sinyal var.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde FITC kanala doğru SCs tanımlamak için DAPI alternatif. Tüm SCs Pax7/DAPI-pozitif olmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity.">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li><li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+the+engines+of+muscle+repair.">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li><li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration:+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes.">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation.">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li><li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li><li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıdaki Protokolü Pax7/MF20 Zebra balığı iskelet kas12tarihinde boyama yöntemi dayanıyordu. Kullanılan ve adımları engelleme çözümleri aynı veya benzer. Kullanılan antikor aynıdır. Ayarlanan adımları fare kas dokusu ve SCs özelliklerini temel. İlk olarak, Laminin antikor görselleştirmek ve SCs konumunu doğrulamak için mix eklendi. SCs mikroskop altında 488/555 çift filtre küp kullanırken saymak için özellikle yararlı; Bu büyük ölçüde gürültülü autofluore...

Kas iskelet multinucleated kas hücreleri oluşur, myotubes denilen, kuvvet ve daralma ile hareketleri oluşturmak myofibers düzenlenmektedir. En iskelet kasları kraniyofasiyal bazı kasları dışında bir somite1adında bir geçici embriyonik yapısından türetilir. Myogenic öncül hücreleri epitel somite myoblasts olmak için delaminate. Myoblasts daha da çok çekirdekli myofibers oluşturmak için myotubes olmak için sigorta miyositler ayırt etmek. Yukarıdaki işlem myogenesis denir ve gen ekspresyonu tarafından geçici düzenlenir kontrolünü ile karakterizedir. Myogenic Kara filmin tarih öncesi Pax3 ve Pax7, oysa myoblasts Tanrım hızlı ve/veya2,3myogenin ve myosins Myf5 ve miyositler hızlı hızlı. Kas büyüme hangi myofibers daha fazla myonuclei varolan lifleri (Hiperplazi) birleşmeyle ve kas lif boyutu (hipertrofisi)4bir artış daha büyük olmak bir süreçtir. Kas büyüme sırasında onlar ayırt etmek ve kendi kendini yenilemek kök hücre özelliklerine sahip myogenic hücre sürdürülebilir bir kaynağıdır. Bu hücreler uydu fiziksel konumlarını sarcolemma (myofiber, hücre zarı) ve Bazal lamina5arasındaki temel hücre denir. SCs şiddetle Juvenil aşamasında (doğum sonrası fareler ilk 2-3 hafta) kas büyümesine katkıda bulunmak, ama yetişkin kas6dinlenme sakin ol. Dikkat çekici, onlar-ebilmek var olmak yanıt kas olarak yeniden Aktif kişi yaralandı ve hasarlı kas7onarmak için yeni kas hücreleri ayırt etmek.
Kök hücre özellikleri SCs çalışmanın ilgili temel kas Biyoloji ve terapileri kas hastalıkları8için yapmak. Sonuç olarak, son yıllarda yoğun araştırma çalışmaları bir alan olmuştur. Bir muazzam genetik ve epigenetik SCs9,10dissekan ilerlemeler kaydedilmiştir. SCs in situ tespit ve yalıtma de tekniklerin geliştirilmiş olup yol11en iyi duruma getirilmiş. İmmünfloresan boyama SCs tanımlaması için Pax7 da dahil olmak üzere belirli antikor kullanımı sağlar. Ancak, kıtlık ve bir güçlü auto-floresan ile yetişkin iskelet kas dokusunun kombine SCs küçük boyutlu görselleştirme zorlu render. Burada, biz fare kas dokusu için Pax7 için optimize edilmiş ve Zebra balığı kas12için varolan bir yöntemine dayalı bir immünfloresan boyama iletişim kuralı tanımlamak. Buna ek olarak, farklı bir fluorophore ile etiketli bir Laminin antikor Bazal lamina altında SCs yer almaktadır belirlemek için istihdam edilmektedir. Bu iletişim kuralı sürekli Pax7 pozitif SCs ve tüm test fizyolojik şartlarda ve gelişim aşamalarında altında myogenic öncüleri görselleştirme sağlar.

<table><tbody><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Citrate Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt;) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG2&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt; cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1860 cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuisinart electronic pressure cooker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

Ayirt doku bölümlerinde farklı hücre tipleri tanımlamak için yardımcı olan etkili bir yöntemdir. İstenen hücre nüfus çalışma için antikorlar belirli hücre işaretçileri için doku bölümlerde uygulanır. Yetişkin iskelet kas, uydu (SCs) kas onarım ve rejenerasyon katkıda kök hücre hücrelerdir. Bu nedenle, görselleştirmek ve uydu hücre nüfus farklı fizyolojik koşullar altında izlemek önemlidir. İskelet kas istirahat, SCs Bazal lamina ve myofiber plazma zarı arasında yer alır. Myofibers veya hücre kültürü SCs tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici Pax7 Eşli kutu proteindir. Bu makalede, en iyi duruma getirilmiş bir Pax7 ayirt protokol kas iskelet bölümleri üzerinde non-spesifik boyama ve arka plan en aza indiren sunulur. Bir protein (laminin) Bazal lamina tanır başka bir antikor SCs. benzer protokoller tanımlamanıza yardımcı olması için de Pax7 ve ilgi ek proteinler için antikorlar ile ikili veya üçlü etiketleme gerçekleştirmek için kullanılabilir da eklendi.

Belgili tanımlık yukarıda merdiven SCs floresan mikroskop (şekil 1) altında yetişkin dinlenme kas bölümlerde başarıyla görüntülenmeyecektir. Yetişkin kas dokusu lifleri belirli tür güçlü auto-floresan olsa da, parlak Alexa serisi boyalar arka plan gürültü üstesinden gelebilir ve sinyal öne çıkmaktadır (şekil 1A, B; ok uçları). İki fotonlu confocal mikroskobu nispeten temiz görüntü...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies at JoVE.com

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

21.0K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.

Video: Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

Genetik

Fare Uzuv Kaslarından Uydu Hücre İzolasyonu ve Akış Sitometrisi Analizi

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

Yazar Spotlight: Fare Kas Kök Hücrelerinde Sistrom Analizi 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Biyoloji

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması