Protokol, sinaptik bütünlüğü yaşa bağlı bir şekilde değerlendirmek için basit bir model sağlar. Böylece dokularda hem yapısal hem de fonksiyonel analize uygun nörodejeneratif hastalıkları inceleyebiliriz. Bu teknik dorsal longitudinal kas nöromüsküler kavşaklardan hem nöronal hem de kas dokusunun korunmasını kolaylaştırır.
Zaman içinde sinaptik fonksiyonu ve çalışması zor dokuları kapsamlı bir şekilde araştırmak için. Bu yöntem ALS, Parkinson, Huntington ve Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların çalışma uygulanabilir. Diseksiyon başlamadan önce 200 mikrolitrelik bir pipetin ucundan yaklaşık 10 milimetre kesilir.
Anestezi uyguladıktan sonra, %70 etanol içeren altı santimetrelik Petri kabında 6 ila 10 sinek oynayın ve her bir sineği hafifçe yudumlamak için bir boya fırçası kullanın. 1-2 dakika sonra, bir sineği bacaklar veya kanatlar tarafından, bir diseksiyon mikroskobu altında 7 ila 10 mililitre PBS içeren silikon elastomer kaplı diseksiyon kabına aktarmak için forcep kullanın. PBS batık sinek ile, künt Dumont sayısı beş kanatları kaldırmak ve bacaklar kaldırmak için kütikül ventral tarafında küçük bir kesi yapmak için düz kenar yay diseksiyonu makas span kullanmak için forceps bulmak kullanın.
Bir elinde diseksiyon makası ve diğer elinde künt forseps tutarak, sinek ventral tarafı yukarı konumlandırmak ve forseps ile yerinde örnek tutarak, makas ile baş ve karın çıkarın. Thoraces toplamak ve PBS 900 mikrolitre ve% 32 formaldehit 150 mikrolitre içeren uygun etiketli tüp içine izole doku örnekleri yerleştirmek için 40 mikrolitre ve modifiye pipet ucu 40 mikrolitre ayarlanmış bir 200 mikrolitre pipet kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, sabitleme kaldırmak için bir Pasteur pipet kullanın ve yıkama başına PBS 1.5 mililitre ile plies üç kez durulayın.
Bisections Don cryo koruyucu eldiven ve güvenlik gözlükleri başlamadan önce ve sıvı nitrojen ile bir tur şişesi doldurun. Bir açıda bir tüy bıçak kapmak ve küçük bir parça kırmak için bıçak viraj için bir bıçak kırıcı kullanın. Bıçağı pozisyona kilitlemek için bıçak kırıcıyı kullanın ve numune tüplerinden tüm PBS'leri çıkarmak için cam pasteur pipetini kullanın.
Sıvı nitrojen şişesinde tüplerbatırmak için kriyojenik cımbız kullanın. 10 saniye sonra, buz her tüp buz üzerinde buz yaklaşık 300 mikrolitre buz soğuk PBS eklemek için bir Pasteur pipet kullanın ve buz soğuk PBS içeren 10 santimetre silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak kadar bir zavallı Axe ventral tarafı yerleştirin. Toraks konumlandırmak ve forceps çifti bulmak için, toraks orta hattı ortaya çıkarmak için bazı toraks gangliyonu kaldırmak için forceps donuk bir çift kullanın.
Bir kılavuz olarak toraks orta hat kullanarak, toraks üçte biri ile sığ bir kesim yapmak için oyun kullanın ve 45 derecelik bir açıyla toraks konumlandırmak için künt çaksiler kullanın. İki hemithoraces elde etmek ve dikkatle dorsal uzunlamasına kaslara zarar vermeden aşırı doku kaldırmak için bir veya iki kesim yapmak için toraks orta hattı düz kesmek için bıçak kullanın. Daha sonra kas dokusu örneklerini uygun şekilde etiketlenmiş bir PBS tüpüne yerleştirin.
Toraks örneklerinin tümü ikiye bölündüğünde tamponu bloke eden dokuları en az bir saat boyunca dört santigrat derecede geçirin. Kuluçka sonunda, girdap taze hazırlanmış yapısal leke çözeltisi ve karanlıkta oda sıcaklığında bir rotator üzerinde iki saatlik kuluçka için her numune için leke 150 mikrolitre ekleyin. Boyama sonra PBST örnekleri yıkayın ve bir cam mikroskop slayt üzerinde yarım 15 milimetre ayrı yığılmış ve kesilmiş beş takviye etiketleri yerleştirin.
Her slayt üzerine Thoraces aktarmak için değiştirilmiş bir mikro pipet ucu kullanın ve herhangi bir aşırı PBST kaldırmak için bir laboratuvar silme kullanın. Thoraces kas tarafı kadar karşı karşıya olduğu örnekleri düzenlemek için forceps kullanın. Numuneler doğru yönlendirildiğinde, her slayta 70 mikrolitre montaj ortamı uygulamak ve her slaytı bir kapak fişi ile kaplamak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.
Sonra cömertçe her doku etrafında tam bir mühür elde etmek için kapak fişleri dış kenarları kat için oje kullanın. Sinaptik bütünlüğü değerlendirmek için. Nöromüsküler kavşaklar 43 Kilodalton mutans katran bağlayıcı protein horseradish peroksidaz ve Floe kalay Motor nöronlar ile boyanabilir gün 21 tarafından hiçbir horseradish peroksidaz boyama çok az var, vahşi tip protein bozulmadan kalırken.
Kas boyamada gözle görülür bir farklılık gözlenmez. Yapısal boyama dorsal uzunlamasına kas nöromüsküler kavşak etiketleme ek olarak da pre sinaptik ve sonrası sinaptik belirteçleri ile sinaptik bütünlüğün bir değerlendirme sağlayabilir. Sıvı nitrojen flaş dondurma olmayan flaş dondurulmuş doku diseksiyon sırasında hasara daha duyarlı olduğu gibi başarılı bir bisection kolaylaştırır unutmayın.
Bu işlemden sonra konserve numuneleri sinaptik yapının belirli yönlerini ölçmek için konfokal mikroskopi ile analiz edilebilir.
