Bu protokol, TDP-43'ün patolojik faz geçişlerini teşvik etmemizi ve motor nöronların ALS'de neden dejenere olduğunu anlamakla ilgili olan spinal motor nöronlarda hücresel sonuçları ele almamızı sağlar. Zebra balığı larvalarının yüksek şeffaflığı nedeniyle, omurilikteki motor nöronlar doğrudan görülebilir. Böylece tek spinal motor nöronlarda faz geçişleri geçiren TDP-43'ün dinamik davranışını görselleştirebilirsiniz.
Bu yöntem ALS'nin yeni bir hayvan modelini sunar. Bu ALS modelinde ışık kaynaklı TDP-43 faz geçişini ve toplamayı önleyebilecek herhangi bir yöntemin ALS tedavisi için potansiyel bir aday olabileceğine inanıyoruz. Özünde düzensiz bölgelere sahip diğer ALS ile ilgili proteinler, anormal faz geçişleriyle ilişkili nörotoksiyi araştırmak için ifade edilebilir.
Bu yaklaşımda başarının anahtarı, spinal motor nöronlardaki optogenetik TDP-43'ün toksik olmayan düzeyde ifade etmesidir. BAC transgenez zaman alıcı bir adımdır, ancak uygun bir transgenik balık oluşturduğunuzda, aşağıdaki adımlar nispeten daha kolay ve basittir. Başlamak için, bir tablette veya telefonda yüklü olan ilişkili uygulamayı kullanarak ışık yayan diyot veya LED panelini açın.
Ardından, spektrometre probunu 6 kuyulu bir kabın boş bir kuyusuna yerleştirin. Ardından uygulamayı kullanarak LED ışığını 456 nm'de zirve yaparak dalga boylarına ayarlayın. Optik güç ölçerin optik sensörlerini boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın.
Daha sonra LED panel ayarına sahip yemeği 28 C'de bir inkübatöre yerleştirin.Optogenetik TDP-43'ü ifade eden zebra balık larvalarının görüntülenmesi için, çift transgenik balığı kaynatın ve 250 g/mL Tricane içeren E3 tamponunda uyuşturun. Daha sonra, 42 C'de 250 g/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat içeren% 1 düşük erime sıcaklığı agarose önceden ısıtın.Daha sonra cam taban kabına bir damla agarose koyun. Cam tabaktaki kubbe şeklindeki agarose damlasının çapı 8 ila 10 mm olmalıdır.
Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak, uyuşturuldu balığı cam bazlı tabakta agarose ekleyin. Balıkla birlikte agarose'a eklenen E3 tampon miktarını en aza indirin. Ardından, birkaç kez pipetleme ile karıştırın.
Agarose katılaşması sırasında, omuriliğin uygun bir yatay konumda olması için bir şırınga iğnesi kullanarak balığı yan tarafında tut. Agarose katılaştıktan sonra, kubbe şeklindeki agarose monteli balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu ekleyin. 20 kat suya daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, omuriliğin seri konfokal z bölümlerini elde edin.
Zaman noktalarındaki omurga segmentlerini tanımlamak ve karşılaştırmak için bir referans olarak, balıkların ventral tarafındaki kloakayı ilgi çekici bölgelere ekleyin. Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz, agarose'u dikkatlice kırmak ve balıkları agarose'dan çıkarmak için bir şırınga iğnesi kullanın. Balığın agarose'a gömdülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarose 30 dakikadan daha az bir süre boyunca gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.
6 kuyulu bir yemeğin bir kuyusuna 7,5 mL E3 tampon ekleyin ve görüntülenmiş çift transgenik balığı bu kuyuya yerleştirin. Ardından, çanağı LED panele yerleştirin, çanağı ve LED panelini bir ara parça ile 5 mm ayrı tutun ve mavi LED ışığını açın. Bazı çift transgenik balıkları, unilluminated kontrol balıkları için alüminyum folyo ile kaplı ayrı bir 6 kuyulu tabakta saklayın.
İstenilen aydınlatma süresinden sonra, daha önce gösterildiği gibi aydınlatılmış balığın omuriliğini görüntüledi. OpTDP-43h'nin tek spinal motor nöronlarda sitoplazmik yer değiştirmesi, 48 yaşında elde edilen z serisi görüntüler ayrılarak görselleştirildi. ve her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h kanalına döllenmeden 72 saat sonra.
EGFP-TDP-43z'nin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntülerinden, her ikisinde de tanımlanabilen tek bir izole spinal nöron. ve döllenme sonrası 72 saat seçildi. Motor nöronların somalarını kapsayan ilgi alanları, EGFP sinyalinin kenarı 48'de izlenerek belirlendi.
ve döllenmeden 72 saat sonra. Somanın ana ekseni boyunca normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizildi. Döllenmeden 48 saat sonra, her iki sinyalin de desenleri büyük ölçüde birbiriyle örtüştü.
Buna karşılık, 72 saatte, EGFP-TDP-43z sinyalinin düşük olduğu bölgede opTDP-43h sinyalinin zirvesi bulundu ve bu da opTDP-43h'nin sitoplazmik yer değiştirmesini gösterdi. Mavi ışık stimülasyonundan önce ve sonra opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyallerini ölçmek için, aynı z serisi görüntülerin her kanalı için bazı dilim projeksiyon görüntüleri 48'de üretildi. ve döllenmeden 72 saat sonra.
Araştırılan dört mnr2b+hücreden 1 hücresi, özellikle doymuş bir EGFP-TDP-43z sinyali gösterdi. OPTDP-43h ile EGFP-TDP-43z arasındaki göreli miktarlar, RFP değerinin GFP değerine bölünmesiyle hesaplanmıştır. 2 ila 4 arası hücreler, mavi ışık aydınlatmadan sonra azalan opTDP-43h seviyelerini görüntüledi.
Balıkların sağlıklı kalmalarını sağlamak için agarose'a gömülme süresini en aza indirmek önemlidir. LED aydınlatmanın yoğunluğunu ve süresini ayarlayarak, TDP-43 faz geçişini geçici olarak düzenlenmiş bir şekilde kontrol ediyoruz, bu da motor nörondaki patolojik TDP-43 faz geçişinin ilerlemesinin parçalanmasına yardımcı olabilir.
