This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Tüm hayvan prosedürleri Alman Federal Hükümet tarafından belirlenen ve Tübingen Üniversitesi kurumsal hayvan refahı komitesi tarafından onaylanmış hayvan koruma kuralları ve yasalara bağlı kalarak yürütülmüştür. 1. Hayvan Modelleri <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ biyosensör fare <ol><li> Transgenik HR2.1 kullanın: TN-XL fare hat koni fotoreseptörlerin 10 seçici Ca 2 + biyosensör TN-XL ifade. Standart 12 saat gündüz / gece ritmi ile kaldırdı iki cinsiyetten 6 haftalık fareler - 3 kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Retina Diseksiyon <ol><li> Fizyolojik çözelti, <ol><li> 125 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 0.5 mM L-glutamin, ve 20 mM (+) glikoz içeren hücre-dışı çözelti taze 2 L, hazırlayın. Tüm malzemeyi eritmek kadar karıştırın. </li><li> &quot;Kabarcık&quot; hücre dışı çözelti,10 dakika - 5 için carboxygen (% 95 O2,% 5 CO2) ile. 2 mM&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için CaCl2 ekleyin. </li><li> Dışı çözüm köpüren sonra, onun pH ölçümü. pH, aksi takdirde bu hatalar çözeltinin hazırlanması sırasında yapılmış olması muhtemeldir, 7.4 olmalıdır. Sabit pH sağlamak için deney boyunca köpüren hızı ve çözüm sıcaklığı sabit tutun. </li><li> 2 matara, retina diseksiyon için bir ve kayıt kurulumu (perfüzyon) için birine stok ayırın. </li></ol></li><li> Göz enükleasyon ve retinanın izolasyonu (5-10 dk) <ol><li> Enükleasyon için çalışma alanı içinde loş kırmızı aydınlatma koruyun. Diseksiyon sırasında koni beyazlatma önlemek için 650 nm (veya daha uzun) bir zirve dalga boyu LED kullanın. </li><li> Koniler tamamen kayıtları sırasında duyarlı olmasını sağlamak için iyi havalandırılan, lightproof kutu içine kendi kafesi koyarak 2 saat için fare koyu adapte. </li><li> Bir Laborato altında fare uyuşturanbir buharlaştırıcı ve standart bir fare kafesi taşıyan bir gaz-sızdırmaz bir kap kullanılarak izofluran (% 5) ile Ry kapağı. Buharlaştırıcı&#39;yı işlerken dikkatle imalatçının talimatları izleyin. Alerjenlere maruziyeti azaltmak için eldiven ve yüz maskesi kullanın. </li><li> Diseksiyon için 40X büyütme - 10 ile binoküler mikroskop kullanın. </li><li> Dekapitasyon yoluyla anestezi fare kurban. </li><li> Yönlendirme için, su geçirmez bir kalemle her göz (= dorsal) üst işaretleyin. Sol veya sağ gözünü kullanarak konusunda takip edin. </li><li> Göz küresi arkasında optik sinir keserek dikkatlice kavisli makas kullanılarak göz çıkarın. Diseksiyon için taze carboxygenated hücre dışı çözelti ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Gözü aktarmak için, optik sinir güdük tutunuz. </li><li> Keskin bir enjeksiyon iğnesi ile kornea ve (ora serrata de yani) sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktada göz delmek. </li><li> E tuthafifçe forseps çifti ile sklera de siz tek makas önceki adımda yapılan deliğe bıçak yerleştirin. Arka kısmında (göz kapağı) için göz (kornea, lens, vitreus) ön kısmını ayırmak için ora serrata boyunca kesin. Retina üzerinde dorsal konumunu belirtmek için kalem işareti pozisyonunda (optik disk doğru) radyal Göz yuvası kesin. Not: Bu şekilde hazırlanan eyecups daha sonra kullanmak için sürekli carboxygenated çözelti içinde muhafaza edilebilir. </li><li> Dorsal uzakta kendini noktaları kesilmiş şekilde Petri kabındaki Göz yuvası çevirin. Retina ve sklera arasında forseps ipuçları sokulmasıyla sol ve forseps, her bir çift Göz yuvası sağ tarafındaki sklera al. </li><li> Yavaşça Göz yuvası skleral kısmını ters çevirerek retina ayırın. Son olarak, sklera retina boşaltmak için makas diseksiyon mikro kullanarak optik sinir kesti. Not: Bu kritik bir adımdır. Retina (örneğin, tarafından zarar görmemesidokunaklı ve) forseps ile sıkarak. </li><li> Forseps ikinci bir çifti kullanılarak retina yüzeyinden birikintileri ve vitreus cismin çıkarılması hafifçe forseps bir çift ile retinanın kenarlarında birini basılı tutun. Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç ek kısa, radyal kesimler (yaklaşık olarak her 90 °) yapmak için makas diseksiyon mikro kullanın. Bu kesimler, bir dikkatle fotoreseptör tarafı Petri kabı (Şekil 1A) aşağı bakacak şekilde retina düzleştirmek için izin verir. </li></ol></li><li> Dilim hazırlık (10-15 dakika) <ol><li> Dilimleri montaj ve kayıt odasına aktarılması için retina dilimleme ve cam kapak fişleri için önceden nitroselüloz filtre membranlar hazırlayın. Makas kullanılarak yaklaşık 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde nitroselüloz filtre membranı kesin. Bir glasscutter kullanılarak yaklaşık olarak 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde lamelleri kesilir. </li><li> Yavaş yavaş yakın hücre dışı çözelti bir cam slayt batırmakdokusu. Yavaşça, forseps bir çift kullanarak çok kenarında onu kapma ganglion hücre tarafı yukarı cam slayt üzerine retina çekin. Bu süreç, mekanik hasar ve doku katlanmasını azaltır. </li><li> İlgili araştırma sorusu ile ilgilidir retinanın bölge seçin (ayrıca Tartışma bakınız). Adım 2.2.9 yapılan uzun kesilmiş dorsal retina yarısını (Şekil 1A) işaretler, unutmayın. Kavisli neşter bıçak kullanarak seçilen retina bölgesi dışında bir dikdörtgen, yaklaşık 1 x 2 mm büyüklüğünde parça kesin. Doku çevresindeki aşırı çözüm siliniz. </li><li> Ganglion hücre tarafı zarına yapışan şekilde retina parçasının üzerine filtre zarı yerleştirin. Hemen sonra, sıkı bir şekilde zara doku takmak için zar üzerine, hücre dışı ortamın bir damla ekleyin. </li><li> Taze dışı solüsyon içeren dilimleme odasına zar monte retina doku aktarın. </li><li> 200 mikron dikey dilimler halinde kesin retinaBir doku kesici 23 takılan bir taze traş makinesi bıçak kullanılarak kalınlığı (Şekil 1B). Her retina parça için bıçağı değiştirin. Not: jilet ile belirtildiği gibi, tüm membran, aynı anda bölünmeler şekilde mükemmel dilimleme odasının alt yüzeyi ile uyumlu hale getirilmesi gereken bir keserken sesi &quot;linkine tıklayarak&quot; - aksi takdirde bıçak bükülebilir ve dilim zarar. </li><li> Zara yüksek vakum gres uygulayarak cam kapak-slip tek bir zar monte dilim Tutkal sadece (Şekil 1C) sona erer. Gres ücretsiz retina altındaki cam yüzeyini tutun. </li><li> Tutma odası içinde hücre dışı bir çözelti damla kapsadığı lamel monte dilimleri tutun - örneğin, kapalı ışık geçirmeyen kap, alüminyum folyo ile kaplanmış kapaklı bir Petri kabı - oda sıcaklığında bir carboxygen atmosferi altında. Holding atmosfer tutmak için küçük bir su deposu köpüren tarafından carboxygen tanıtılmasıbölme nemlendirilmelidir; Bu kurumasını dilimleri önler. </li><li> Kayıt odasına onları (tek tek) geçmeden önce 15 dakika - dilimler 10 tutma odasında dinlenmek için izin verin. Dilimler, oda sıcaklığında bölme tutarak 4-5 saat kadar muhafaza edilebilir (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. İki foton Ca 2+ Görüntüleme <ol><li> İki foton mikroskopi <ol><li> Bir Hareketli Hedef Mikroskop (MOM) tipi iki foton mikroskop kullanın. Ayrıntılar ayrıca bkz hem MOM tasarım ve görüntüleme işlemleri, daha önce 24 tarif edildi 10,21,25 (kaynaklar ve şirketler için, bakınız Tablo 1). Not: kullanılan aşağıdaki minimum gereksinimleri karşılayan herhangi bir dik iki foton mikroskopu: Bu ~ 860 nm&#39;ye ayarlanabilir bir (a) darbeli bir lazer, (b), iki eş zamanlı olarak elde edilen floresans kanallarının en az, (Cı ile donatılmış olması gerekir )) eCFP ve sitrin floresan, (d için filtrelerhafif bir uyarıcısı (mümkünse tasarımlar için, 24,26 bakınız), ve yeterli bir kare hızında zaman lapsed görüntü dizileri kayıt sağlar (e) yazılım ca ilgi 2+ sinyallerini çözmek için. </li><li> İmalatçının işaret ettiği gibi, iki-fotonlu görüntüleme sistemi başlatın. Strictly tesisin lazer güvenlik kurallarına uyun. ~ 860 nm için lazer ve nağme o başlayın. </li><li> Kayıt odasına tutarak odasından bir dilim aktarın ve hemen carboxygenated ekstrasellüler çözümü ile perfüze başlar. 2 ml / dk&#39;lık bir perfüzyon akış oranı ve kayıt bölümü içinde, 37 ° C&#39;lik bir sıcaklıkta muhafaza. </li><li> 20X 0.95 NA suya daldırma hedefi kullanın. Varsa, retina dilim (Şekil 2) bulmak için kayıt odasına altında bir LED kızıl-ötesi ile birlikte bir CCD kamera kullanmak. Aksi takdirde iki foton görüntüleme (3.1.5 bakınız) kullanarak dilim bulun. </li><li> Biyosensör ifadesini görüntülemek için iki foton görüntüleme geçin. AçeCFP ve sitrin floresan görüntüleme için iki algılama kanalları. </li><li> Tarama ve (Şekil 3A) kayıt için koni terminalleri bir satır seçmek için iki foton mikroskop kontrol görüntü elde etme yazılımı kullanın. 128 x 16 piksel görüntüleri (31.25 Hz) veya benzer yapılandırmaya Set görüntü elde etme. Dış segmentlerinde photopigments beyazlatma önlemek için koni terminallerine taranan alan kısıtlayın. Not: (Ca 2+ unbinding için bağlayıcı Ca τ = ~ 0.6 sn 2+, τ = ~ 0.2 saniye; 16 bakınız) TN-XL kalsiyum sensörü için ~ 8 Hz minimum kare hızı önerilir. </li></ol></li><li> Hafif stimülasyon ve kayıt <ol><li> Başka yerde 10,21,26 açıklandığı gibi aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için alt kademe tam saha ışık uyarıcı kullanın. Not: Tam saha ışık uyarıcısı için basit bir çözüm, iki bant-geçiren filtreden geçen LED&#39;ler (: 360 BP 12, &quot;yeşil&quot;: 578 BP 10 örneğin, &quot;mavi&quot;) kullanmaktırBu fare koni dalga boyu hassasiyetlerini maç ama aynı zamanda floresan tespiti için kullanılan filtreler ile örtüşmeyen (cf. 3.2.4). LED&#39;lerden gelen ışık kayıt odasına (Şekil 2) altına doğru Kondenser tarafından odaklanmıştır. Bu stimülatörü tasarımı, kendi kalibrasyon ile ilgili ayrıntılı bilgi için, ışık yoğunlukları kullanılan ve uyarılmış koni fotoğraf izomerleştirme oranları, 10,21,26 bakın. </li><li> Işık uyaranlara (3.2.3 bakınız) sunulması ya da farmakolojik ajanlar uygulamadan önce - (ayrıca Potansiyel Tuzaklar bakın, 30 saniye 20) lazer açın ve koni tarama lazer ve uyarıcı arka plan ışığı uyum sağlar. </li><li> (Şekil 3B, C de gösterildiği gibi hafif örneğin, yanıp söner) keyfi uyaranların sunumu başlatın. Aşama 3.2.1 tarif stimülatörü durumunda, özel bir yazılım tarafından kontrol edilen bir mikro-işlemci kartına (kullanılarak, zaman içinde iki LED yoğunluğunu modüle harekete geçirici bir güçdetayları) 10,21,26 bkz. </li><li> İki floresan kanalları kaydetmeye başlayın (. Örneğin, &quot;mavi&quot; FRET verici eCFP için 483 nm ve &quot;sarı&quot; FRET-alıcısı için 535 nm, gözlük bakınız Tablo 1 için) aynı anda ilgili görüntü elde etme yazılımı kullanarak (ayrıca bkz 3.1 .6). Örneğin, hafif bir yanıp söner (Şekil 3B, C), kayıt en az 8 durumunda - 10 uyarım sunumları (çalışma). </li></ol></li><li> &quot;In-dilim&quot; Ca 2+ kalibrasyonu <ol><li> Telaffuz Ca (3,4 de tarif edildiği gibi), (3.1.6 ve 3.2.4 tarif edildiği gibi) ve koni bir dizi taban Ca 2 + seviyesini elde konik terminalleri 2 + işaretleri. </li><li> 5 uM (DMSO içinde çözülmüş) ionomisin ve 10 mM EGTA ile &quot;Ca 2 + serbest&quot; hücre dışı ortama geçiş (veya alternatif olarak, BAPTA) ilave edildi. Tutanak koni terminalleri yine her 5 dk minimal floresan oranını (R dk) belirlemek, &lt;etmekem&gt; yani hücre içi Ca (yakın) yokluğunda oranı 2+. 30 dakika - Bu her yerde 15 arasında sürebilir. Not: Bir perfüzyon sistemi, farklı hazneler arasında geçiş sağlar olması gereklidir. </li><li> (DMSO içinde çözülmüş) ile 5 uM ionomisin ve 2.5 mM Ca2 + ile birlikte hücre dışı ortama geçin. 5 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, kayıt koniler yine her 5 dakika, yani maksimum flüoresans oranı (Rmax), 2 + hücre içi Ca doyurucu konsantrasyonlarının mevcudiyetinde oranını ölçmek için kullanılır. Kararlı olmak Ca 2 + oranı 15 dk - ionomycin uygulamayı takiben, bu 3 arasında sürebilir. Not: 2+ yüksek Ca dilimleri merceğin ve sonunda hücrelere zarar verecek uzun süre iyonomisin. Normal morfolojisini muhafaza analizinde tek hücreler yer alır. Konsantrasyonları (örneğin, EGTA, iyonomisin) adapte edilmesi gerekebilir. Ca 2 + kalibrasyon hakkında daha fazla bilgi içinprotokol, 13,17 bkz. </li></ol></li><li> Veri analizi Not: İlgili mikroskop yazılımı ile uyumlu ve özel analiz komut çalıştırabilen bir görüntü işleme ve veri analiz yazılımı paketi kullanın. <ol><li> Bir görüntüleme veri dosyası yükleyin ve her koni terminali (Şekil 3A) çevresinde ilgi (ROI) bölgeleri çizin. ROI içindeki her bir çerçevede, ortalama floresans şiddeti ve FRET alıcı (sitrin) ve verici (eCFP) floresans (R = F A / F; Şekil 3B, C) ​​arasındaki oranı (R) hesaplamadan önce, arka plan floresanı çıkarılır. Bu oran genellikle göreceli hücre içi Ca2 + konsantrasyonu için bir vekil olarak kullanılır, ancak kalibrasyon (3.3) sonra, aynı zamanda mutlak konsantrasyonları (3.4.3 bakınız) tahmin edilebilir. Not: pediküller dış pleksiform tabakasında konumlarına tarafından kabul edilebilir ve bunların morfolojisi (biraz daha küçük koni daha &quot;lekeler&quot; düzleştirilmişsomata) koni akson sonunda yer. </li><li> Ortalama uyaran denemeleri (Şekil 4A). Cevap boyutu için önlemler olarak eğrisi (R A) altında ışık uyarımı, tepe genliği (R amp) ve bölgeye önce böyle Ca 2 + bazal seviyesi (R üssü) olarak ortalama izleri (Şekil 4B), yanıtı parametreleri ayıklayın. Ayrıca, bu tür tepki yükselişi (t artış) ve çürüme süresi (t çürüme) olarak ortalama izleri, yanıtı kinetiği ayıklamak (% 20 ve R amp% 80 arasında = ilgili zaman aralıkları Şekil 4B resme bakınız). Bu parametreleri belirlemek için nasıl hakkında daha fazla bilgi için, 10. görüyorum. </li><li> Adımlar 3.3.1-3.3.3 itibaren ölçümlere dayalı mutlak koni Ca2 + konsantrasyonu tahmini hesaplayın. Minimum ve maksimum Ca2 + konsantrasyonu, R ve R min max Ca, sırasıyla donör floresan için oranları kullanın 2+ </s&gt; TT-bağlı (F D, Ca-bound) ve -unbound kadar (F D, Ca-ücretsiz) devlet yanı sıra, in vivo ayrışma sabiti aşağıdaki TN-XL için (Kd = 0.77, 16 bakınız) denklem (27&#39;ye analog): </li></ol></li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse.">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+(CNG)+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa.">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li><li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse.">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li><li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat.">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li><li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse.">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2++concentration+in+salamander+cone+photoreceptors.">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse.">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li><li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors.">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors.">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li><li>Johnson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2++dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses.">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells.">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li><li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo.">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes.">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li><li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li><li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+retinal+domains:+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution.">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li><li>Kemmler, R., Schultz, k., Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina.">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina.">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li><li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina.">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Elektrofizyolojik tek hücreli kayıtları veya sentetik floresan göstergeler Ca 2 + görüntüleme kullanarak Önceden var olan protokoller teknik nedenlerle (bkz) bir dizi için fare koni fotoreseptör Ca 2+ dinamiklerini kaydetmek için mücadele ediyoruz. Burada açıklanan protokol Ca 2 + sinyalleri ve verimli ve nispeten basit bir şekilde bireysel, belirlenen fare koni terminalleri bile mutlak Ca 2 + düzeyleri ölçülebilir. Bu protokol zaten başarıyla sağlıklı fare retinadaki koni fonksiyonunun farklı yönlerini ele üç çalışmalarında kullanılmıştır. İlk çalışmada 10 yılında HR2.1: TN-XL fare Ca 2 + biyosensör koni özgü ifadesi engel olmadığını gösteren immünohistokimya, ERG kayıtları, iki foton Ca 2 + görüntüleme ve farmakoloji kullanılarak karakterize edildi koni anatomisi ve işlevi. İkinci çalışmada 21, kromatikve fare koni akromatik tepki özellikleri &quot;yeşil&quot; opsin hakim olduğu dorsal ve &quot;mavi&quot; opsin hakim olduğu ventral fare retina arasındaki koni fonksiyonu çarpıcı farklılıklar gösteren, retina üzerinde haritalanmıştır. Koni özelliklerinde Bu bölgesel farklılıklar fare kozalakları farklı spektral tipi dolayısıyla akromatik zıtlıkların (yakın) en uygun örnekleme sağlamak ve düşündüren, doğal ortamda diferansiyel kontrast dağılımı (yani, toprağa karşı gökyüzü) uyumlu bir sunabilir evrimsel bir avantaj. Koni akson terminalleri yatay hücrelerden aldığınız üçüncü çalışmada 22 karşılıklı geribildirim araştırıldı. Tüm önerilen yatay hücre geribildirim mekanizmaları koni akson terminallerinde 28 voltaj kapılı Ca 2+ kanalları üzerinde hareket gibi, koni terminali Ca 2 + yatay hücre-koni etkileşimleri için bir proxy olarak hizmet verebilir. Kemmler tarafından çalışma 22 destekler coworkersgörünüm yatay hücreler fotoreseptör glutamat salınımını kontrol etmek için çeşitli mekanizmalar içeren karmaşık bir geribildirim sistemi kullanmak olduğunu. Bu çalışmalar, tarif edilen protokol çok yönlülüğünü göstermekte ve bu koni fonksiyonu ve sinaptik devreleri ilgili sorular geniş bir şekilde adapte edilebilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, protokol koni fizyolojisinin daha iyi anlama yolunda, farklı koni bölümlerinde yerel Ca 2 + sinyalizasyon okuyan mümkün kılar. Böyle bir bilginin sonunda koniler etkileyen dejeneratif hastalıklar için özellikle potansiyel terapötik yaklaşımların rasyonel gelişimi için izin, dejenere koniler patofizyolojik süreçleri anlamak önemlidir. HR2.1 olarak: TN-XL, fare hattı, Ca 2 + biyosensör dış segmenti hariç olmak üzere, koni boyunca ifade edilir. Bu Ca 2 + dinamik doğrudan ve rasyometrik değerlendirilmesi için bir fırsat sağlarFarklı konik bölümlerinde s. Ca değişim yana dış segmente 2 + akımları membran potansiyeli ve voltaj kapılı Ca + 2 kanal elde edilen aktivasyonu yoluyla terminalleri yansıtılır, dış segmente işlemler dolaylı gözlenebilir. Potansiyel tuzaklar: retina diseksiyonu kritik bir adımdır: Fare, retina genellikle fotoreseptör dış segmentleri ve pigment epiteli arasındaki Göz yuvası ayrılır. Bu nedenle, izole retinanın ışığa duyarlı fotoreseptör dış segmentleri maruz kalır ve mekanik hasarlara karşı son derece duyarlı. Büyük bakım araçları ile fotoreseptör tarafı dokunarak veya yapışkan yüzeyinde yan (örneğin, bir filtre membran) doku taşıyarak zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Kaliteli retina dilim onların temiz kesim yüzeyi tarafından mikroskop altında kabul edilebilir veaçıkça tanımlanmış dış kesimleri ile iyi organize fotoreseptör tabakası ile. Dilim kalitesinin Fonksiyonel değerlendirme hızla (- 20 kozalakları 10 ile bir görüş alanı, örneğin), parlak ışık uyaranları yanıp sönen ve duyarlı koni yüzdesi belirlenerek yapılabilir. Burada, tepki kalitesi sinyal-gürültü oranı (S / N) (ışık tepkisi genliği vs ışık uyaran önce bazal gürültü genliği) hesaplanarak değerlendirilmelidir; S / 2 N - 3 minimum eşik olarak kabul edilmelidir. Tipik olarak, biz% 50&#39;den az duyarlı konik dilimleri atın. Ayrıca aşırı spontan spike davranışı (10&#39;a bakınız Şekil 4) atılmalıdır görüntüler kozalakları ile dilimler. Söz konusu anatomik ve fonksiyonel kriterlere uygun kayıt odasında Dilimler 1 için tutarlı tepkiler göstermek - 2 saat (yanıt tutarlılık ile ilgili ayrıntılar için, 10 bakınız). Dilimler saat hayatta Çünkütutma odasına bizimki, başarılı bir deney 6 saat kadar sürebilir. Bu dilimleme kaçınılmaz retina ağlarda yanal bağlantıları koparır olarak koni ve yatay hücreler arasında uzun değişen mekânsal etkileşimleri inceleyerek açısından bazı sınırlamalar vardır dikkat çekicidir. Ancak, 300&#39;e um retina dilim kalınlığını artırarak bu sorunu 22 iyileştirmektedir. Dikey retina dilimlerinin kullanımı, büyük ölçüde (10,21 bkz detaylı bir tartışma için) opsin ağartma önler ve böylece, uyarım lazer ile ışık duyarlı konik dış bölümlerin tarama önler ve. Bununla birlikte, kaydedilen Ca 2 + sinyalleri sadece hafif uyaranlara bağlı değil, aynı zamanda tarama uyarma lazer tarafından oluşturulan bir arka plan aydınlatması bileşeni tarafından etkilenen olsun. Aslında, bu tür iki-fotonlu görüntüleme deneylerde etkili bir arka plan aydınlatması dağınık lazer ışığı, kaydedilen CE tarafından yayılan flüoresans ışınlarının bir kombinasyonu olup,lls ve herhangi bir LED arka plan uyaran bileşeni. Kayıttan önce (çalışır durumda, ışık uyarısının arka bileşenle) lazer taraması 30 s - Bu nedenle, koniler, en az 20 adapte izin verilmelidir. Avantajları ve uygulamalar: Koniler sinyal yolları 2 + Ca doğrulayabilir konik Ca 2 + görüntüleme ile kombinasyon halinde farmakolojik çalışmaları ve şunlar olabilir: Bu koni Ca 2 + -imaging protokolü için bazı uygulamalar 10,21,22, yukarıda tarif edilmiş olsa da, diğer uygulamaları tasavvur edilebilir etkinlik ve Ca farklı oyuncular hedefleme ilaçların gücünü test etmek için kullanılır 2+ 10&#39;a -signaling. Ancak, anahtar uygulama koni işlevini etkileyen hastalıklar incelemek için olabilir. Insan hastalıkları taklit eden pek çok retina dejenerasyonu fare modelleri mevcuttur. Örneğin, koni fotoreseptör kaybı 1 (cpfl 1) fare primer koni dejenerasyon modeli acı olduğunuBir Pde6c mutasyon 29 arasında. Tersine, çubuk dejenerasyon 1 (rd 1) Fare Pde6b mutasyon muzdarip. Bu birincil çubuk fotoreseptör dejenerasyonu, 30 1&#39;de rd 1 çubuk kaybı tamamlandığında, ikincil koni dejenerasyon setleri neden olurken. HR2.1 bu hayvanların melezleme: TN-XL hat okuyan ve hem birincil hem de ikincil koni dejenerasyon Ca 2+ dinamiklerini karşılaştırarak izin ve koni hücre ölümü sırasında Ca 2+ rolüne dair değerli içgörüler sağlamaya muhtemeldir olacaktır. Ayrıca, farmakolojik koni dejenerasyon kaynaklı - örneğin seçici PDE6 inhibitörleri kullanan - koni dejenerasyon 10,29,31 aşağı mekanizmaları tanımlamak için hizmet edebilir. Özetle, protokol burada fare koni fotoreseptör hücre içi bölümlerinde Ca 2 + ölçmek izin verir ve geniş bir yelpazede altında koni fizyolojisini ortaya çıkarmak için büyük fırsatlar sunuyor tariffizyolojik ve patofizyolojik durumların. Buna ek olarak, bu protokol koni Ca 2 + -signaling müdahale ve böylece konik hastalıklar için yeni tedaviler kurmak için tasarlanmış farmakolojik maddelerin taranması için kullanılabilmektedir.

Görüş retina fotoreseptör fototransdüksiyon kaskadının ışık kaynaklı aktive olması ile başlar. Koni fotoreseptör renk ve yüksek çözünürlüklü gündüz vizyon aracılık oysa Rod fotoreseptör, düşük ışık seviyelerinde vizyon sağlar. Birçok fotoreseptör özgü genler bu hücrelerin dejenerasyonuna yol mutasyonlara karşı hassastır. Fotoreseptör kaybı ile ilişkili moleküler belirteçlerin bir dizi 1 tanımlanmıştır, ama şimdiye kadar ayrıntılı moleküler mekanizmaları ve olaylar dizisi belirsizliğini koruyor. Altered Ca2 + homeostazı fotoreseptör hücre ölümü, bir tetik, dejenerasyon süreci 2,3 sırasında Ca aktivitesi 2 + -bağımlı kalpain tip proteazların yukarı regülasyonu ile desteklenen bir hipotez olarak öne sürülmüştür. Ancak, bugüne kadar, bu hipotez Ca 2 + fizyolojik ölçümleri ile desteklenmemektedir. Re Ca 2+ kanal blokerleri etkisi üzerinde çeşitli çalışmalarda tutarsızlıklarintestinal hastalıklar daha doğrudan memeli koni fotoreseptör Ca 2+ değerlendirmek için yöntemler çağrısında hücre ölümü 4-6 Ca 2+ katılımı meydan okudu. Daha önce, en elektrik kayıt ve Ca 2+ görüntüleme çalışmaları nedeniyle koni 7-9 daha kolay erişim kurbağa ve sürüngen modellerinde yapılmıştır. Ancak, memeli fotoreseptör fizyolojisi olmayan memelilerde 10, özellikle de bu farklı olabilir, insan kalıtsal retinal dejenerasyon bağlamında memeli fotoreseptör fizyolojisi hakkında daha iyi bir anlayış yenilikçi tedavilerin geliştirilmesi için bir anahtardır. İnsan retina hastalıkları taklit eden pek çok fare modelleri mevcuttur, ancak küçük fare konileri 11 Ca 2+ dinamikleri hakkında bilinmektedir. Elektrik teknikler, özellikle olmayan farelerde,, koni yüksek verimli kayıtlar için uygun değildir burada çubuklar (~% 97) önemli ölçüde koni (~% 3) sayıca 12 </s&gt; yedekleyin. Ayrıca, bu tür tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gibi hassas elektrofizyolojik teknikler, hücre içi ortamını rahatsız ve mutlak hücre içi Ca + 2 konsantrasyonları Ca 2+ akımlar veri değil sağlar. Koni Ca 2 + dinamikleri hakkında sorular ele alırken Dolayısıyla, alt temporal çözünürlük rağmen, görüntüleme tercih edilen bir yöntemdir. görüntüleme ile önemli bir konu seçici bir floresan Ca 2 + göstergesi boya ile kozalakları etiketlemek için nasıl. Uygun bölmelere ve hücre özgüllüğü dokuya &quot;toplu yükleme&quot; sentetik Ca 2 + göstergesi boyalarla elde etmek zordur. Sonuç olarak, etiketli kozalakları olarak 13,14 çubukları ve Müller glial hücreler güvenilir ayırt edilemez. Ayrıca, sentetik boyalar tutarlı şartlar altında uzun süreli kayıtları önlenmesi, hücre dışına sızıntı eğilimindedir. O de gerektirir Dahası, onların AM-ester formunda sentetik Ca 2 + göstergeleri yükleme, sorunluTERGENTR (örneğin, DMSO) ve formaldehit 15 oluşturur. Mutlak Ca 2 + ölçümler için, rasyometrik göstergeler zorunludur. Ancak, en iyi mevcut sentetik rasyometrik göstergesi Fura-2 şiddetine bağlı olarak, kendi içinde koniler uyarır ve bu şekilde çalışmaları engelleyebilir, 760 nm ile 700 aralığında uyarma ışık (iki foton uyarılması için) gerektirir koni Ca fizyolojik aydınlatma koşullarında 2+ dinamiği. Sentetik boyalar farklı olarak, genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri bir hücre tipine seçici biçimde ifade edilebilir. Onlar hücre dışına sızıntı yok ve ağartma kaçınılması, bu nedenle, uzun süreli ve güvenilir rasyometrik ölçümler mümkündür. İki foton mikroskopi ile kombine edildiğinde Hücre tipi seçici Ca 2 + biyosensörler ifadesi, büyük ölçüde fizyolojik şartlar altında 13,16,17 Ca 2 + değerlendirmek ve hücre içi çalışmak için güçlü bir araç temsil </&gt; sup. Burada, biz ışık uyaran-uyarılmış koni Ca incelemek için bir protokol açıklar transgenik Ca 2 + biyosensör fare hattında 2+ dinamiği: FRET tabanlı Ca 2 + biyosensör TN-XL 18 ifade (HR2.1 TN-XL), seçici koniler, insan kırmızı opsin promotör HR2.1 19 altında. Koni terminallerini erişmek için, ex-vivo dilim hazırlık 20 kullanılmıştır. protokol zaten başarıyla sağlıklı farelerde 10,21,22 koni fonksiyonu üç çalışmalarında kullanılmıştır. Ayrıca, protokol koni Ca okuyan sağlar 2+ örneğin spesifik genetik koşullarda sinyalizasyon, HR2.1 ile kalıtsal retina dejenerasyonu için fare modelleri melezleme yoluyla: TN-XL fareler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for tissue chopper</td>
			<td>MARTOR KG</td>
			<td>ARGENTAX No. 1044</td>
			<td>0.25 mm; http://www.martor.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABG01300</td>
			<td>Filter type: 0.8 &#181;m; http://www.emdmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP</td>
			<td>CP pharma</td>
			<td>AP/DRUGS/220/96</td>
			<td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/green LED-based full-field stimulator</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>for details, see10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open source microprocessor board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software CfNT</td>
			<td>Custom-written</td>
			<td></td>
			<td>developed by Michael M&#252;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3-4 System focal perfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instrument</td>
			<td></td>
			<td>with 100 &#956;m-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td>
			<td>Newport Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Movable objective microscope (MOM), 
			Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPlanFL 20x/0.95w objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer 100 series</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Calcium salt</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I24222</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101191250</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ95</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

Retina koni fotoreseptör (koni) günışığı vizyon hizmet ve renk ayrımcılığı temelini oluşturur. Bunlar genellikle çok sayıda retinal hastalıklarda körlüğe yol açan, dejenerasyon tabidir. Kalsiyum (Ca2 +), fotoreseptör sinyal ve metabolizmada önemli bir ikinci mesajcı dolaylı çeşitli hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu ile bağlantılı olduğu ileri sürülmüştür. Sistematik koni fizyolojisinin bu yönlerini incelemek ve patofizyolojisi elektriksel retina çubuk fotoreseptör hakimdir fare, özellikle bu küçük hücrelerden kayıt zorluklar tarafından engellenmiştir. Bu sorunu aşmak için, biz kozalakları münhasıran genetik olarak kodlanmış Ca 2 + biyosensör TN-XL ifade ve fotoreseptör dejenerasyonu için fare modelleri ile melez edilebilir transgenik fare hattı kullanarak bir iki foton Ca 2 + görüntüleme protokolü kurdu. Burada açıklanan protokol dikey kesitler hazırlamak üzere şunları içerir: (R,20, fareler ve koni Ca 2 + seviyesinde hafif uyarıcı uyarılmış değişikliklerin optik görüntüleme gelen retina dilim &quot;). protokol aynı zamanda mutlak Ca 2 + konsantrasyonları &quot;in dilim Ölçümü&quot; sağlar; kayıtları kalibrasyon takip edilebilir. Bu protokol, fonksiyonel koni özellikleri içine çalışmalar sağlar ve koni anlayışı Ca 2 + sinyalizasyon yanı sıra fotoreseptör ölümü ve retina dejenerasyonu Ca 2+ potansiyel tutulumuna katkıda bulunması beklenmektedir.

Dikey dilimleri HR2.1 hazırlanan (Şekil 1) birleştirerek: İki foton görüntüleme (Şekil 2) ile TN-XL fare retinanın, biz koni fotoreseptör akson terminallerinde ışık uyaran-uyarılmış Ca 2 + sinyalleri rasyometrik ölçümler yapmak başardık . Bu yaklaşım erişme ve sentetik Ca 2 + göstergeleri ile önceden varolan optik görüntüleme yöntemleri üzerinde fare konileri görselleştirme önemli bir gelişmeyi temsil eder. Örneğin, genetik olarak kodlanmış rasyometrik Ca koni özgü anlatım 2+ biyosensör TN-XL ölçüde koni akson terminallerinin kimlik (Şekil 3A ROI bakınız) kolaylaştırdı. Bu nedenle, bizim protokol hem koni ve çubuk akson terminalleri katkılarıyla örnek &quot;karma&quot; sinyalleri olarak, belirsiz kökenli kayıt sinyallerinin riskini ortadan kaldırır. Bizim yaklaşımımız Indivi düzeyinde tek deneme yanıtları çözme veriyorÇift koni akson terminali. Koni terminalden Ca 2 ışık uyarılmış ekstrüzyon artış ve verici ve alıcı floresan sırasıyla (Şekil 3B), bir azalma ile işaretlenir. Flüoresans oranı (R) azalma koni ve voltaj kapılı Ca + 2 kanal daha sonra kapağın ışık kaynaklı hiperpolarizasyon kaynaklanan konik ucu (Şekil 3C), Ca ekstrüzyonu 2 + karşılık gelir. Birkaç koni akson terminalleri (Şekil 3A) aynı anda izlenebilir Çünkü, veri toplama çok verimli ve koni Ca 2+ yanıtları yüzlerce tek bir deneyde toplanabilir. (Şekil 4) kantitatif bu yanıtları değerlendirerek, koni Ca 2 + sinyalleri karşılaştırılabilir ve koşullar (Tartışma) aralığında değerlendirilmiştir. Bu FRET-alıcısı (sitrin) ve -donor (eCFP) floresan arasındaki oranı kullanmak genellikle yeterli olurHücre içi Ca 2 + seviyesinin göreceli bir önlem olarak; (F A / F D detaylar için, 3.4 bakınız). Oysa, gerektiğinde, bu oran mutlak hücre içi Ca 2 + konsantrasyonları ([Ca 2 +]) (Şekil 5) elde etmek için kalibre edilebilir. Bu protokolde kullanılan arka plan aydınlatması At (detaylar için, bkz 10&#39;a ve Şekil 3 efsane), kalibrasyon [Ca 2 +] in &quot;vahşi tip&quot; HR2.1 dinlenme mutlak bir tahmin vermiştir: TN-XL fare koni terminalleri 243 ± 159 literatür 11 fareleri için aralığında nM (ortalama ± SD). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Dikey retina dilim 1. Hazırlık Şekil. Retinanın (A) İzole ve retina dilimleme için hazırlanan basık. (B) Dikdörtgen parça (lerdilimleme sonra filtre kağıdı membran (koyu gri) üzerine monte edilmiş) A kırmızı kutu ee. (C) gres kullanarak bir cam lamel sabit zar monte retina dilim Üst görünümü. (D) retina dilim bir kısmının şematik çizimi (C kırmızı kutuya bakın). Koni fotoreseptör yeşil gösterilir. V, ventral; D dorsal; N, nazal; T, zamansal; OS dış segment; ONL, dış nuklear tabaka; OPL, dış pleksiform tabakasını içermektedir; INL, iç nuklear tabaka; IPL, iç pleksiform tabakası; GCL, ganglion hücre tabakası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Retina dilim Şekil 2. İki foton görüntüleme: Kayıt yapılandırma İllüstrasyon Üst:. Su daldırma objektif lens odaklama olacakTarama retina içine lazer (kırmızı aşağı ok) ve yayılan floresan (yukarı oklar) toplama am. objektif bir CCD kamerası kullanılarak bir dilim görüntülerken, belirli bir kondansatör altına monte edilmiş bir LED aydınlatma kızılötesi ışık iletilir toplar geçin.:., hücre dışı çözelti ile kayıt odasına monte edilir ve perfüze Retina dilim Alt: Kondenser mercek stimülasyon LED&#39;lerden gelen ışık odaklama (ve CCD kamera görüntüleme kızılötesi LED) retina dokusu içine kayıt odasının şeffaf altından geçerek. IR LED, kızılötesi ışık yayan diyot; CCD, şarj-kuplajlı aygıt; BP, bant geçiren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Şekil 3. Işık EvokeFare koni Fotoreseptörlerin akson terminallerinde d Ca 2+ cevapları. (A) Sol: Kayıtlar retina dilimleri koni fotoreseptörlerin (yeşil) sinaptik terminalleri (kırmızı kutu) üzerinde duruldu Sağ:. Örnek Kaydedilen bölge için 7 ayrı terminaller. Floresan iki kanal kullanılarak kaydedildi:. (; 535 BP 50 üst) ve FRET-verici eCFP için bir tane (alttan; 480 BP 32) FRET-alıcı sitrin için bir (B) sitrin Işık uyarılmış değişiklikler (F A) ve eCFP (F D) floresan tek ROI kaydedildi. (C) Ca 2+ yanıtları 5 sn aralıklarla 1 sn parlak ışık yanıp söner bir dizi için bir koni terminalinin (oran F A / F D gibi). ROI, ilgi bölgesi; BP, bant geçiren filtre; F, floresan yoğunluğu; keyfi birimler, au; FRET, Förster rezonans enerji transferi; eCFP, mavi floresan proteinin geliştirilmiş. Uyaran yoğunluğu (p. 13,0 ve bir arka plan düzeye ekleyerek sırasıyla M- ve S-opsins için 12.8, (içinde ~ 10 = LED&#39;ler kapalı, uyarma lazer tarama): 10 3 · P · s -1) koni başına içinde otoğraf-izomerizasyon oranı <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Işık uyarılmış koni Ca 2+ yanıtların Şekil 4. örnek olarak kantitatif analiz (A) tek bir koni terminalden (Ír gibi) Işık uyarılmış Ca 2 + yanıtları (tek denemeler: gri izleri, n = 16; ortalama:. Siyah iz ) (B) Parametreler ortalama Ca 2 + yanıtı için belirlenen:. önce ışık uyarısına bazal temsil eden) Ca 2 + seviyesi (R tabanını İstirahat, yanıt boyutu ar olarakEA-altında-eğrisi% 80 (R, A) ve tepe genliği (R amp), yanıt başlangıç ​​kinetikleri (t yükselmesi R amp% 20 ila% 80 arasında bir zaman aralığı) ve çıkıntı (t çürüme, zaman aralığı R amp% 20) kadar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Şekil 5. mutlak Ca 2 + konsantrasyonu tahmin. Dinlenme Ca 2 + konsantrasyonu ([Ca 2 +] oran F A / F D gibi) TN-XL fare 8 koni akson terminallerinde kaydedilen (çevrelerin, SD ± ortalama) Farklı hücre dışı solüsyonlar için: iki kez standart bir hücre dışı ortamda (Ctrl 1 ve 2), daha sonra en az (&quot;sıfır&quot;), [Ca2 +] (10 mM EGTA) ANYüksek [Ca 2 +] (2.5 mM) ile d dışı ve hücre içi Ca 2 + dengelenmeye iyonomisin 5 mcM varlığında son iki koşul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina at JoVE.com

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.5K Görüntüleme.  University of Tübingen.  Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...