Bu araştırmacılar izole etmek ve doku formu ve fonksiyonu için bireysel soy katkıları nın araştırılması için farklı hücre tipleri işlemek için izin verir, çünkü bizim yöntem önemlidir. Bu teknik hücre türlerini ayırmak için nazik ve verimli bir yöntemdir ve sonuç olarak, hücrelerin bütünlüğü 3B kültür için korunur. Bu teknik aynı zamanda iyi karakterize biyobelirteçleri olmayan hücreleri izole etmek için diğer sistemlere uygulanabilir.
10-14 haftalık dişi bir fareden iki, üç, dört ve beş meme bezini toplamak için önce iki arka bacak arasındaki orta hatta bir santimetrelik bir kesi yapın. Boynuna kadar kesim genişletin ve ekstremitelere doğru orta hat kesi küçük yanal kesikler yapmak. Daha sonra hayvanın her iki tarafında bir iğne ile sabitlemeden önce öğretilen deri germek.
Forseps kullanarak, sayısı dört bezleri lenf düğümleri toplamak. Meme bezlerini çıkarmak için, doku her bölge altında kesmek için keskin makas kullanın, onlar hasat olarak% 5 FBS ve antibiyotik-antimikotik ile desteklenen dört derece Santigrat DMEM-F12 50 mililitre dokuları yerleştirerek. Tüm dokular toplandığında, tüm dokuların eşit olarak kıydırılmak için gerekli plaka dönen bir mililitre lik pipet ucu ile kolayca sığabilecek kadar bezleri doğrayın.
Daha sonra üç mililitre sindirim ortamındaki parçaları, 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 14 saat boyunca altı iyi bir yapışma kabının tek bir kuyuya aktarın. Ertesi sabah, bir mililitrelik mikropipet le dokuları 10 kez hafifçe pipetle ve doku parçalarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Santrifüj ile doku toplamak ve taze DPBS beş mililitre pelet resuspend.
Süspansiyonu önceden ıslak 70 mikrometrelik naylon hücresüzden geçirin, süzgeçteki tüpü yıkama başına 10 mililitre 37 santigrat derece DMEM-F12 ile dört kez durulayın. Doku parçalarını serbest bırakmak için, eldivenli parmakları ile süzgeç sekmesini tutun ve 60 milimetrelik doku kültürü çanak üzerinde süzgeç ters. Süzgeç altından bakım ortamı dört bir mililitre aliquots geçirin ve hızlı bir şekilde tek hücreler için çanak incelemek, yağ damlacıkları, ve ters bir mikroskop altında doku kontamine.
Daha sonra doku parçaları çanak uymak ve çift katmanlı parçalar oluşturmak için izin vermek için 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Miyoepitelyal hücreleri luminal epitel hücrelerinden ayırmak için, hücrelere bir mililitre taze 0.5 tripsin-EDTA eklemeden önce bir mililitre DPBS ile bulaşıkyı durulayın. Ters bir mikroskop altında sindirimi dikkatle izleyin.
Miyoepitelyal hücrelerin dış tabakası üç ila altı dakika içinde kopmaya başlayacaktır. Miyoepitelyal hücreler ayrıldığında, dpbs% 10 FBS iki mililitre içeren 15 mililitrelik tüp içine supernatant aktarın. Luminal epitel hücrelerini rahatsız etmeden, kalan hücrelere taze bir mililitre tripsin-EDTA eklemeden önce yemeği iki mililitre DPBS ile hafifçe durulayın.
Yedi ila 15 dakika sonra, PBS%10 FBS'lik iki mililitre ile enzimatik reaksiyonu söndürün ve hücreleri 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Diferansiyel trippsinizasyon sırasında hücreleri yakından izlemek ve hücreleri sindirmek üzerinde değil çok önemlidir. Her iki kesir de toplandığında, hücreleri santrifüj edin izlenme reaktifini çıkarın ve tüp başına 250 mikrolitre bakım ortamı içinde peletleri yeniden askıya alın.
Sayma sonra, taze bakım orta iyi konsantrasyon başına dört hücre için 1,2 kat 10 her hücre popülasyonu seyreltin. DMEM-F12'de sekiz kuyulu bir hazne nin her kuyusuna fenol kırmızısı olmadan %50 ekstrasellüler matriks in 90 mikrolitre ekleyin. Tüm kuyular kaplandığında, hücre kültürü kuluçka makinesindeki taban tabakasını 30 dakika katılaştırdı.
Bu polimerizasyon sırasında, santrifüj ile hücre fraksiyonları toplamak ve kuyu başına% 90 büyüme orta% 10 ekstrasellüler matris 100 mikrolitre her popülasyon resuspend. Daha sonra, her bir kuyuya her hücre süspansiyonundan 100 mikrolitre ekleyin ve ortak kültürlerin hücre kültürü kuluçka makinesinde 20 dakika yada 20 dakika yerleşmesine izin verin. Kuluçka sonunda, dikkatlice her oda duvarının yan aşağı büyüme orta 100 mikrolitre ekleyin ve hücre kültürü kuluçka slayt dönmek.
Büyümelerini izlemek ve büyüme ortamını her 2-3 günde bir nazikçe yenilemek için hücreleri her 24 saatte bir görüntüleyin. İmmünoboyama için organoidleri onarmak için, uygun deneysel zaman noktasında, her slayttan ortayı dikkatlice aspire edin ve her kuyuda 200 mikrolitre DPBS ile durula. Organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4 santigrat derece paraformaldehit 200 mikrolitre ile düzeltin ve organoidleri DPBS'de %0,2 glisin 200 mikrolitre ile tedavi etmeden önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düzeltin.
Kuluçka sonunda, dpbs içinde %0.25 triton X-100 ile organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika geçirin ve ardından %5 eşek serumu veya DPBS'deki sekonder antikor türlerine bir saat boyunca uyan uygun serum ile spesifik olmayan bağlanmanın engellenmesi ni sağlar. Daha sonra hücreleri 125-200 mikrolitre uygun birincil antikorlarla etiketleyerek DPBS'de bir gecede %1'lik eşek serumuna ilgi gösteren uygun birincil antikorları dört derece santigrat derecede sallayın. Ertesi sabah, her iki kuyuyu 200 mikrolitre DPBS artı triton X-100 ile yıkayın ve organoidleri uygun floresan konjuge ikincil antikorlarla etiketlemeden önce 45 dakika oda sıcaklığında ışıktan korunan sallanan ikincil antikorlar ile yıkayın.
Daha sonra her iki kuyuyu taze DPBS artı triton X-100 ile yıkayın ve standart protokollere göre floresan mikroskopi ile organoidleri görüntüleyin. Kuluçka 24 saat sonra, saflaştırılmış epitel parçaları luminal epitel hücrelerinin bir iç tabakası çevreleyen miyoepitelyal hücrelerin bir dış tabakası ile düz gözleme benzeri yapılar oluşturan kültür çanak altına yapıştırılır. Tripsin tedavisi ilk olarak miyoepitelyal hücreler ayrıştırılır ve kalan kübik luminal epitel hücrelerinin çekirdeğini çevreleyen parlak yuvarlak hücreler olarak görünür.
İki hücre bölmesinin genel saflığı keratin-14 ve E-kadherin ekspresyonu tarafından değerlendirildiği gibi iki popülasyonda yaklaşık %90'dır. Gösterildiği gibi %50 ekstrasellüler matriks tabanında %10 ekstrasellüler matrikste 10 günlük kültürden sonra, miyoepitelyal luminal epitel hücre organoidleri iyi gelişmiş lümenlere sahip büyük dallı yapılar oluşturmuştur. Alveologenez ortamına eklenmesiyle beşinci günde farklılaşma, daha büyük, daha dallı süt içeren organoidlerin oluşumunu tetikler.
Stromal kirletici olmadığından emin olmak için epiteli toplarken süzgeçi dikkatlice yıkamayı unutmamak önemlidir. Gen ekspresyonundaki değişiklikleri sorgulamak için, araştırmacılar bir kurtarma çözeltisi kullanarak hücre dışı matris onları serbest bırakarak organoidler RNA toplayabilir. Paraformaldehit tehlikeli olarak kabul edilir ve araştırmacılar kişisel koruyucu ekipman kullanmalı ve bu reaktif kullanırken bir duman başlık içinde çalışmak.
