We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Hücre Kültürü (24-48 saat transfeksiyondan önce), <ol><li> Transfeksiyon öncesi tohuma 24-48 saat 96 oyuklu plakalar sayısına göre HEK293T hücrelerin yeterli bir miktarı ile transfekte edilir. NOT: tutarlı transfeksiyonlar için, yeterli bir yoğunlukta plaka hücreleri hızlı bir şekilde bölünme lehine, ancak transfeksiyon zamanı en fazla% 70-90 konfluent olarak vermeye. </li><li> Her 96 oyuklu plaka (rezervuar ve çok kanallı pipet kullanımı için hesap oyuk başına 75,000 hücre, plaka başına 120 kuyu) 9 x 10 6 hücre gerektirir. HEK293 hücreleri (tipik olarak ~ 20 saat) iki katına çıkma süresi hesaplayın ve hücreler uygun sayıda transfeksiyon zamanı en az 9 x 10 6 hücre elde etmek üzere tohum. Yeni bir levha reseed kalan hücrelerin ~% 10, ~% 90 konfluansa kadar yetiştirilen bir 145 mm&#39;lik dairesel kültürü plakası, tipik olarak 3 96 oyuklu Transfeksiyonlar için yeterlidir. </li></ol> Transfeksiyondan 2. Hazırlık Önceki _content &quot;&gt; Not: bu reaktiflerin hazırlanması zaman alıcı olabilir çünkü aşama 2.0-2.2 tamponların ve plazmid DNA hazırlanması, transfeksiyondan önce günde yapılmalıdır. <ol><li> 3&#39;LIFE testi ile uyumlu İnsan 3&#39;UTR klonları kamu plazmid deposu 30 edinilebilir. Elle veya sıvı taşıma robotlar ile DNA plazmid arındırın. Bir transfeksiyon dereceli alkali lizis mini hazırlık 96-kuyu kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun. Kuyuya ~ 100 ng / ml başına saflaştırılmış vektörler süspanse. NOT: plazmid konsantrasyonu aşağıda 40 ng / ul düşerse yetersiz lusiferaz sinyali neden olacaktır. </li><li> PLIFE-miRNA Şekil 1B 24 boru hattını kullanarak 30 veya klon vektörleri elde edilir. Her miRNA ve boş kontrol plasmidler için 500 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyonda vektörleri yeniden süspanse edin. </li><li> Nucleofection tampon koşulları hassasiyeti nedeniyle, sağlamak(hücreler ve plasmidler de dahil olmak üzere), transfekte edilmiş malzemelerin toplam hacmi 96 çukurlu transfeksiyon plakanın her bir toplam sıvı% 10 geçmez. Bunu elde etmek için, en az 500 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyonda pLIFE-MiRNA plazmid stok konsantre edilir. </li><li> 10x ateşböceği lusiferaz tampon reaktifleri (Tablo 1) ve 6 aya kadar saklanabilir 1x Renilla lusiferaz tampon reaktifleri (Tablo 2), hazırlayın. Not: ateşböceği lusiferaz tampon çözeltisi içindeki DTT, tek kullanımlık parçalar halinde -20 ° C&#39;de çözelti içinde saklanabilir olması gerekir. </li></ol> 3. Transfeksiyonu için hemen öncesinde ardından Ürünleri hazırlayın <ol><li> PBS ihtiva eden transfeksiyon tamponu,% 1.5 HEPES, pH 7.0 hazırlanır. Bu Transfeksiyon etkinliğindeki fark düşüşler olmadan 4 ° C&#39;de en fazla 1 aya kadar saklanabilir, ancak, bu taze hazırlayın. Tampon ve plazmid DNA hacimleri formüle ederken, su için her 96 oyuklu plaka için 120 reaksiyonlar kabulfficiently pipetle sıvı rezervuarları ve çok kanallı pipet kullanarak kayıp hacim hataları oluşturmaktadır. Kısım kuyu transfeksiyon tamponu başına 18 ul (/ 96-plaka 120 kuyu = plaka başına 2.16 ml) ve bir kenara koyun. NOT: hücre elektroporasyon cihazı hücrelerini transfekte etmek için kullanılan tampon koşulları son derece duyarlıdır. Hazırlama tamponlar ekipman tutarlı performans sağlayacak Doğruluk. Özellikle bu tampon mikrosantrifüj tüpleri, 96-yuvalı plakalar, rezervuar ve elektrot plakaları içinde ortaya kalan zamanı en aza düşürülmesiyle, tamponlar buharlaşmasını önlemek için tahlil yapmak azami dikkat edilmelidir. </li><li> Rezerv Aşağıdaki denetimler için dört kuyu, hiçbir pLIFE-3&#39;UTR (lusiferaz tahlil arka ölçmek için), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (negatif hedef kontrolü), miRNA # 1 için pozitif kontrol, miRNA # için pozitif kontrol 2. NOT: Bu vektörler 30 kamuya mevcuttur. Alternatif olarak, daha önce onaylanmış bir hedefBir pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. </li><li> Sıcak ortam, 37 ° C tripsin (% 0.25). </li><li> DMEM,% 10 FBS,% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş 96 oyuklu hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna, 200 ul ve transfeksiyonu takiben kullanılmak için bir 37 ° C kuluçka makinesi içine yerleştirilmiştir. </li><li> Destek yazılımları tarafından takip tüm cep elektroporasyon aygıtları açın. HEK293T hücreleri ve PBS / HEPES tamponu için Darbe kod FF120 kullanın. </li></ol> Plazmid DNA ve hücre karışımı 4. hazırlanması Not: Aşağıdaki protokol, iki miRNA&#39;ların (miRNA- # 1 ve miRNA- # 2) ile birlikte, bir ekran için bir deneyde, üç, 96 gözlü levhalar transfekte varsayar. Her bir plaka pLIFE-3&#39;UTR plasmidlerin, aynı 96-yuvalı plaka karşılık gelir, ve pLIFE-miRNA boş pLIFE-miRNA- 1. veya pLIFE-miRNA- # 2 ile üç kez tedavi edilebilir. <ol><li> Her miRNA için pLIFE-miRNA + transfeksiyon tamponu 3 stokları hazırlayın. Bu stok her birinin toplam hacminin% 50&#39;si (10 ul) ayarlanabilmelidiriyi, 120 kuyular ile çarpılır. Böylece, her bir hisse senedi 1.08 ml tampon + 120 ul plazmid DNA (pLIFE-miRNA) içermelidir. </li><li> Medya elüsyon PBS ile hafifçe yıkanır ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca ~ 5 mi,% 0.25 tripsin ile muamele etmek suretiyle 145 mm kültür hücreleri plakadan çıkarın. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de eşit medya hacmi ve pelet hücreleri ile tripsin nötralize eder. </li><li> 5-10 ml medya (hücre yoğunluğu ve hücre sayacın doğru aralığına bağlı olarak) ~ tripsini / medya ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Bir hücre sayacını kullanarak hücreleri saymak. % 95 canlı ve makinenin doğru aralığında&gt; hücreler olduğundan emin olun. NOT: tutarlı hücre sayısı, son derece yüksek hücre konsantrasyonlarında (&gt; 6.0x 10 6 / ml) bir sonucu olabilir. Hücre oranı ve / veya transfeksiyon verimliliği azalan: transfecting çok hücre ölçüde plazmid azaltarak hedef miRNA verimliliğini azaltabilir. </li><li> Kısım üç tüp her biri 9 x 10 6 hücre, hücrelere karşılık gelen rBir 96-yuvalı plaka transfeksiyonu için equired. 3 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri Spin. </li><li> Ortamı çıkarın. Aşırı medya transfeksiyon etkinliğini etkileyebilir olarak pelet minimal rahatsızlık ile mümkün olduğunca çok ortamı çıkarmak için emin olun. </li><li> 1.2 ml transfeksiyon tamponu / miRNA plazmid karışımı ve bir kenara yeniden süspanse hücreleri. </li><li> Aşağıdaki transfeksiyon tamponunda pLIFE-3&#39;UTR plazmid detay tabanda yineleyin. Bu 96 kuyucuğu oluşur gibi, her zaman plakaları kaplayarak tampon buharlaşmasını önlemek için özen gösterin. <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, 96 PCR plakanın her oyuğuna transfeksiyon tamponu ul 32,4 hareket ([transfeksiyon başına] 9 ul * 3: [plakaları] * 1.2 [pipet hata için hesap]). </li><li> Her kuyuya 3.6 ul mini prepped pLIFE-3&#39;UTR plazmid (± 100 ng / | il) ilave edin ve iyice karıştırın. </li><li> Pipet 96 oyuklu transfeksiyon levhasının ve kapağın her oyuğuna Bu karışımın 10 ul. </li></ol></li></ol><ol><li> Rezervuar içine ilk hücre / tampon / pLIFE-miRNA plazmid karışımı 1.2 ml taşıyın. Iyice karıştırın. </li><li> Önce 10 ul transfeksiyon tampon / pLIFE-3&#39;UTR içeren birinci 96 oyuklu transfeksiyon plaka içine bu karışımın 10 ul ekle. Yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın. NOT: tamponunda hücrelerin Eşit süspansiyon bile emin ve küvet ile elektrik akımının geçişi kapsamlı ve transfeksiyon verimliliği maksimize edecek. </li><li> Hücre elektroporasyon cihazda 96-iyi transfeksiyon plaka koyun ve transfeksiyon başlatmak. </li><li> Transfeksiyon tamamlandıktan sonra, 96-çukurlu transfeksiyon plakanın her oyuğuna 96 oyuklu bir kültür plakasına gelen önceden ısıtılmış ortam 100 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 96-çukurlu kültür plakasına her bir göze 100 ul taşıyın. </li><li> Hücreler w yanlarındaki topaklaşma eğilimi gibi, iyi merkezinde dikey olarak yerleştirilmiş pipetle kültür plakasına hücreleri karıştırınell düzgün karışık sürece. </li><li> Geri kalan iki tabak 5,1-5,5 tekrarlayın. </li><li> Temizleme 96-kuyu transfeksiyon plaka <ol><li> 96 oyuklu plakalar, transfeksiyon deneyler arasında, nükleik asitlerin üzerinde hiçbir yürütülmesini sağlamak üzere,% 70 EtOH ile yıkanarak geri dönüştürülebilir. Tamamen elektrot şeritler aşırı EtOH silerek (alt taraf) ve kültürü kaputu tamamen kuru transfeksiyon plakaları izin vererek, ardından her iyi doldurmak için bir sprey şişesi kullanarak iki% 70 EtOH yıkar gerçekleştirin. NOT: bir plazmid DNA ile% 70 EtOH ile tek bir yıkama ve bir ikinci transfeksiyon, ardından HEK293T hücrelere her biri, plazmid pmaxGFP 2 ug ile 12 kuyu transfekte edilmesiyle carry-over DNA kontaminasyonu için test edilmiştir. Bu, son derece yüksek bir plazmid konsantrasyonu, son derece parlak muhabir ve tek bir yıkama ile, 12 kopya transfeksiyonlar herhangi gözlenebilir bir floresan olmasıdır. </li></ol></li><li> Çift lucif ardından 37 ° C&#39;de 48-72 saat süre ile kültür hücreleri,tahlil silebilirsiniz. </li></ol> 6. Hücre Lusiferaz Assay için Lizat hazırlanması <ol><li> 4 kısım su, bir rezervuar pasif lizis tamponu 5x 1 parça ile lizis tamponu ile seyreltilir. 26 ul / kuyu, ~ 20 ekstra hacimleri ekleyerek rezervuar kaybı hesaba hesaplayın. NOT: Tampon -20 ° C&#39;de saklanır ve pipetleme doğruluğu artıracak oda sıcaklığını yaklaşım 5x tampon izin böylece önce, son derece viskoz olabilir. </li><li> Floresan mikroskopi kullanılarak transfeksiyon etkinliği için de her bir analiz edin. Verimli transfect vermedi kuyularda tutarsızlıkları (&gt;% 90 transfeksiyon verim) Not veya kalabalık ya da medya bitkinlik göstergesidir RFP düşük seviyelerde ifade edilir. Analizden Bu kuyu çıkarın. </li><li> Tamamen hücreler ayırmak neden olan çok hızlı Zehir için dikkatli olmak, hücrelerden ortamı çıkarın. NOT: Kalan medya experime genelinde değerleri lizat ve neden dalgalanmaları sulandırmakNTS. </li><li> 20-30 dk ~ düşük / orta hızda bir plaka çalkalayıcı / rocker her iyi ve yere lizis tamponu 26 ul ekleyin. Lusiferaz tamponlar hazırlamak lüminometre (ler) yıkayın ve prime ve opak ölçüm plakalarına lizat aktarmak için bu kez kullanın. </li></ol> 7. Çift Lusiferaz Deneyi NOT: Birden plakaları tek lüminometre üzerinde sırayla ölçülen yapılıyorsa, hemen her plaka kullanmadan önce pH ayarlaması ardından bu reaktif ekleyerek, ATP ve yüzeylerde hariç her şeyi ile tampon ana karışımları oluşturun. ATP ve yüzeyler zamanla düşebilir; Bu reaktifler tampon içinde olan süreyi tutarlılık birden plakalar arasında tutarlılık artıracaktır. <ol><li> 1x lusiferaz tamponlar hazırlanması (Tablo 1): <ol><li> Yüzeyler ışığa duyarlı olabileceğinden, alüminyum folyo ile ateşböceği ve Renilla tamponlar içeren iki tüpleri (genellikle 15/50 ml santrifüj tüpleri) sarın. </li><li>1x Firefly lusiferaz tampon hazırlayın. Nihai 1x konsantrasyonu 5 ml H 2 0, EGTA son ekleme, her beş 10x ateşböceği lusiferaz reaktif 1 ml ekleyin. <ol><li> Ateşböceği tampon 1x 10 ml, 0.025 gr ATP ilave edin. Birkaç kez baş aşağı çevirerek kanştınn. Her zaman buz üzerinde ATP tutun. ATP düşer, bu nedenle birden fazla plaka sekans ölçülmesi halinde, tampon her bir ek plaka için bu adımda taze başlangıç ​​yapılmalıdır. </li><li> Tampon pH dayalı sarımsı renk değiştirmek gerekir 100 böceği luciferase (alt tabaka) (Tablo 1) 100 ul ekleyin. </li></ol></li><li> 1x Renilla lusiferaz tamponu sulandırma: 96 oyuklu bir plaka, kısım 1, 10 ml başına &quot;Renilla tampon&quot;. <ol><li> BSA, 100 ul (44 mg / ml stok) ilave edilir. </li><li> Birden fazla tabak, 10 ml&#39;lik içine ayrı ana karışımı tarama edin. </li><li> Tampon koelenterazin 100 ul ekle (daha önce bölünüp 100x konsantre C&#39;de saklandı.) </li></ol></li> &lt;li&gt; NaOH ve HCI kullanılarak 5.0 1x Renilla tamponu ardından, ateşböceği 8.0 tampon 1x pH ayarlayın. NOT: Her tampon aktivitesi, ve ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için Renilla tampon kabiliyeti pH değerine oldukça bağlıdır. Tutarlı sonuçlar için bu adımda son derece doğru. </li><li> Luminometre astarlanması için yerleştirmek için 10.5 ml (1, 96 oyuklu plakaya tekabül eden) her bir tampon hacmi getirin. </li></ol></li><li> Opak beyaz plakalara lizat transfer Bu noktada hücreler, 20 dakika için ~ liziz tamponu içinde olmalıdır. Her bir kuyunun çok kanallı pipet kullanarak 25 ul alın, hücre kümeleri break up ve homojenleştirin aşağı iyice yukarı pipetlemeyin emin ve olmayacak. </li><li> Lüminometre hazırlayın. Lüminometre açın ve &quot;iki enjeksiyonları ile DLR&quot; adlı DLR klasöründe protokolü seçin. Diğer formatlar veri analizi boru hattı (aşağıda) ile uyumlu değildir. <ol><li> T olmak kuyuları seçinested (bütün kuyular varsayılan). </li><li> (Açıklama için 29 bakınız) 10 sn ölçüm süresi, 5 saniye ayarı &#39;ölçümden önce Delay&#39; uzatın. </li><li> Kılcal yıkama adımları: Su 3x, EtOH 3x, su 3x, kuru 3x. Arka tampon tüpleri içine bir kez atık haline Başbakan tamponlar ve daha sonra başbakan ikinci kez karıştırma sağlamak. Sağ kılcal Renilla ardından sol kılcal, ilk ve Başbakan ateşböceği tampon enjekte edilir. </li></ol></li><li> Lusiferaz deneyi başlatın. Her plaka okuma ~ 48 dk almalıdır. Tamamlanmasından sonra ilk dosyayı kaydedin ve sonra yıkama adımları tekrarlayın ve lüminometre kapatın. NOT: luminometre programı çökmesine nerede Çoklu plakalar okuma ve aynı saklanan veriler excel dosyası olabilir, sorunları birden plaka ile karşılaştı olabilir ancak okur. Ölçümlerin arasındaki tüm verileri kaydetmek ve kaydetme mümkün önce program çökerse ekran görüntüleri almak için emin olun. <ol><li> Eski tamponlar değiştirinYeni ile yeni plaka başlamadan önce en az iki kez yeni tamponlar ile Başbakan emin olmak. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Edinilebilir - ve &quot;multiplate analizi 3&#39;LIFE&quot; - excel tabloları &quot;tek plaka analizi 3&#39;LIFE&quot; yararlanın <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Elektronik tablo - &quot;tek plaka analizi 3&#39;LIFE&quot; içine negatif durum, miRNA 1. ve miRNA 2. tekabül yerlere luminometre çıktı dosyasından ateş böceği ve Renilla lusiferaz ölçümleri için ham veri kopyalayın. </li><li> Elektronik tablo otomatik ateşböceği / Renilla oranını hesaplamak ve uygun negatif kontrol her miRNA normalleştirmek ve her plaka üzerinde baskı değerleri normale olacaktır. NOT: Bu e-tablo otomatik olarak anlamlı bastırılmış kuyu vurgulayın düşük lusiferaz sinyali ile kuyu tespit ve repressi tedbirlerini sağlayacaktüm plaka üzerinde üzerinde. İstatistiksel analiz detaylı açıklama için 24 Bkz. <ol><li> Test edilen her miRNA için 1. çoğaltmak tekabül eden konumda - &quot;multiplate analizi 3&#39;LIFE&quot; e-tabloda karşılık gelen hücrelere, &quot;Normalize RI Endeksi&quot; kutusundan değerleri kopyalayın. Farklı günlerde yapılan tüm biyolojik çoğaltır için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Arzu edildiği takdirde, sırası ile, sütun B ve D gen isimleri ve hedef tahmini durumunu yerleştirin. <ol><li> Elektronik tablo otomatik olarak tüm plaka ortalamasını hesaplamak için izin verin. Bir ısı haritası olarak 96 sıra formatta (Şekil 2) verileri dikkate alınmalıdır. dosyası da liste biçiminde veri (Şekil 2) düzenler. NOT: baskı endeksi, farazi miRNA hedeflerini tanımlamak için kullanılan bir ölçüdür. Farklı sertlikteki parametreler tek tek tercihlerine bağlı olarak, kullanılabilir. Ortalama olarak biz 0 baskı endeksi altında muhtemel hit düşünün.8 ve t testi (p-değeri &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı. Şekilde gösterildiği gibi, bu kriterlere göre 3 potansiyel hedefler kırmızı vurgulanır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA.">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li><li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).</li><li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Wienholds, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+zebrafish+embryonic+development.">MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.</a> Science. 309 (5732), 310-311 (2005).</li><li>Darnell, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+during+chick+embryo+development.">MicroRNA expression during chick embryo development.</a> Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).</li><li>Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+and+microRNAs+in+fragile+X+mental+retardation.">RNA and microRNAs in fragile X mental retardation.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MicroRNA+feedback+circuit+in+midbrain+dopamine+neurons.">A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons.</a> Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).</li><li>Poy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreatic+islet-specific+microRNA+regulates+insulin+secretion.">A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.</a> Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Paraskevopoulou, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-microT+web+server+v5.0:+service+integration+into+miRNA+functional+analysis+workflows.">DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3'UTR.">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li><li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2,+MYC,+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+'seedless'+3'UTR+microRNA+recognition+elements.">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li><li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans.">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+microRNA+targeting+code:+functional+sites+with+centered+pairing.">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li><li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis.">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma.">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li><li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition.">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li><li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors.">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).</li><li>Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'LIFE:+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput.">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li><li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+C.+elegans+3'UTRs.">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li><li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

3&#39;LIFE deneyi yüksek throughput 3&#39;UTRs fonksiyonel MiRNA hedefleri tanımlar. Bu deney, kendi ilgi miRNA için farazi hedef çok sayıda tespit etmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. 3&#39;LIFE tahlil miRNA hedefleme fonksiyonel bir ölçü ve güvenle hitap edebilecek tek bir miRNA karşı 3&#39;UTR&#39;sinden :: tek muhabir ikili test sağlar ki 3&#39;UTR tahrik düzenlenmesi için sorgulamak için güçlü bir yaklaşımdır Bireysel genlerin hedef durumu. Bu yaklaşımı doğrulamak için, 275 ...

Bu yöntemin genel amacı algılamak ve hassas yüksek throughput microRNA (miRNA) hedefleri harita etmektir. MiRNA ~ uzunluğu 22 nükleotid endojen kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar bulunmaktadır. Transkripsiyonu ve işleme sonrasında, olgun miRNA&#39;lar bir protein kompleksi içinde dahil edilmiştir kompleksi (RISC) susturulması kaynaklı RNA çağırdı. Her miRNA çeviri baskıya veya mRNA bölünme 1 ya sonuçlanan öncelikle haberci RNA&#39;lar 3 &#39;çevrilmemiş bölgelerine (3&#39;UTRs) (mRNA)&#39; de yer alan unsurları hedef RISC yönlendirir. U baz eşleşmesi sallanmak ve olan dejenere doğada, birden eşleşmeyen baz çifti içeren ve bölgeler şişti: Mirna standart Watson-Crick ve G dayalı hedef siteleri tanır. Birçok miRNA&#39;lar geniş biyolojik rolleri çeşitli bir yelpazede oynamak insanlarda 2,3 için bitkilerden muhafaza edilir. Metazoan&#39;da ise miRNA&#39;lar hücre kaderinin kararları 4, gelişimsel zamanlama 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri etkileyebilir </sup&gt; Ve çoğu zaman dokuya özgü ekspresyonu 6,7 sergiler. MIRNA misexpression aynı zamanda, hedef genlerin işlevine yalnızca temel hücre davranışı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir olarak anormal gen regülasyonu, neden olabilir. Bu nedenle, miRNA&#39;ların nörodejenerasyon 8,9, diyabet 10 ve kanser de dahil olmak üzere 11, hastalıkların geniş bir bağlantılıdır. Biyoinformatik ve ıslak tezgah yaklaşımları her miRNA yüksek verimli veya genom yaklaşımlar potansiyel etkileşimler bu büyük bir havuz soruşturma için gerekli olduğunu belirten farklı mRNA 12-14 binlerce yüz hedefleme yeteneğine sahip olabileceğini düşündürmektedir. Hedef genlerin belirlenmesi mekanistik tanımlayan miRNA fonksiyonunun kritik bir bileşenidir, ve bunu yapmak için araştırmacılar büyük çapta hedeflerini ortaya gerekir. Çeşitli yaklaşımlar biyoinformatik tahmin algoritmaları da dahil olmak üzere miRNA hedefler, tanımlamak için geliştirilmiştir, yüksek hacimli dizilemebir mRNA&#39;ları hedeflenen ve raportör deneyleri tabanlı. Bu yaklaşımların her biri doğal güçlü ve zayıf yanları vardır. MiRNA hedefleme sekansı özgüllük tarafından yönlendirilir olduğu göz önüne alındığında, özellikle nükleotid miRNA 2-6, çeşitli algoritmalar birçok organizma genomu boyunca MiRNA hedefleri tahmin etmek için geliştirilmiştir (tohum bölge olarak da adlandırılır). Bu algoritmalar valide miRNA hedeflerinin gözlenen baz eşleşmesi motifleri kullanılarak eğitimli ve sık sık bu tür sıkı tohum eşleştirme, site korunması ve / veya termodinamik stabilite 15 gibi parametreleri kullanan vardır. Bu filtreler sadece yüksek güven hedefleri için yeterli tamamlayıcılık ile olası hedeflerin çok sayıda rafine ederken, onlar son kanıtlar 16-24 yaygın olduğunu düşündürmektedir türe özel ve kanonik olmayan miRNA hedef siteleri, dışarıda olabilir. Ayrıca, bu tahminlerin gibi alternatif poliadenilasyonu olarak miRNA hedef siteleri, dışarıda mRNA işleme hesap mekanizmaları yapmayız25, RNA düzenleme 26, RNA metilasyonu 27 ve kooperatif bağlama. Bu nedenle, yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları birçok algoritmalar 22,24,28 için rapor edilmiştir. Bu algoritmalar sonraki deneysel doğrulama için aday miRNA hedefler belirlemek için yararlı olmakla birlikte, bu yüksek hata oranları sistematik miRNA hedef tespiti için biyoinformatik yaklaşımların etkinliğini sınırlamaktadır. Sistematik belirli bir miRNA arasındaki etkileşimler ve potansiyel olarak hedeflenmiş 3&#39;UTRs problanması için biz 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24 fonksiyon elementleri arasında Lüminesans tanımlanması adı verilen bir yüksek verimli bir deney geliştirilmiştir. Bu tahlil ölçer doğrudan etkileşimleri ve çift lusiferaz haberci sistemini kullanarak bir sorgu miRNA test 3&#39;UTR&#39;sinden translasyon baskı. Bu sistemde, ilgi konusu bir genin 3&#39;UTR ateşböceği lusiferaz (Fluc) raportör okuma çerçevesinin alt klonlanır. muhabir eksilerinitruct HEK293T hücrelerinde bir sorgu miRNA ile kotransfekte edilir. MIRNA hedefleme Test Fluc :: 3&#39;UTR muhabir ve ikinci bir non-spesifik Renilla lusiferaz raportör arasındaki nispi değişimin ölçülmesi ile tespit edilir. Önemli olarak, lusiferaz deneyleri, raportör translasyon çıkış etkileyen fonksiyonel MiRNA / mRNA etkileşimlerini tespit eder. Bu bu 3&#39;UTR tabanlı düzenlemenin bağımsız protein bolca mRNA bozulması ve translasyonel baskıya farklılıkları yanı sıra değişiklikleri atlar, bu tür RT-qPCR ve Western lekeleri olarak miRNA düzenleme, tespit etmek için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantajdır. Lusiferaz deneyleri, yaygın olarak tüketilebilir reaktifler ile ilişkili yüksek maliyetler ile sınırlıdır, çünkü göreceli basitlik ve hassaslık, ancak, yüksek verimli taramalara kullanımları doğrudan MiRNA hedeflerini doğrulamak için kullanılır, kamu kaynaklarından 3&#39;UTR kütüphanelerinin eksikliği ve yokluğu standart lusiferaz prot arasındaocols, birden veri setleri üzerinde fonksiyonel baskıya karşılaştırılmasında zorluklara yol açmaktadır. 3&#39;LIFE testinin kullanımını kolaylaştırmak için, düzenli olarak güncellenen ve genişletilmiş bir 3&#39;UTR kütüphane oluşturarak, deneysel tasarım, ticari olmayan transfeksiyon 24 ve lusiferaz reaktif 29 kullanımı basitleştirilmesi vurgu ve yoluyla kullanılabilir var kamu plazmid deposu 30. 3&#39;LIFE testinin ölçeklenebilirlik bioinformatically belirlenen genler doğru ekranı eğme olmadan belirli bir miRNA tarafından hedef için büyük bir 3&#39;UTR kütüphanenin tarama sağlar. Kanonik ve tahmin edilen etkileşimleri test etmek için ek olarak, bu sistematik bir yaklaşım, kurallı olmayan ve / veya tür spesifik etkileşimler yoluyla tahrik edilen yeni hedeflerin tanımlanmasına izin verir. Önemli olarak, protein üretimi ile ilgili hedef miRNA etkisi, genel olarak mütevazi bir translasyon baskı 15,31 &lt;neden anlaşılmalıdır/ Sup&gt;, miRNA düzenlemenin bir birincil rolü, protein çıkışı ince ayar gen ifadesinin anormal düzeylerde karşı koruma ve belirli programları 32,33 hücre sağlamlık sağlamak olduğunu düşündürmektedir. 3&#39;LIFE ekranında negatif MiRNA / mRNA etkileşimlerin doğal sayıda kombine lusiferaz deneyi duyarlılığı MiRNA genlerinin bir çok sayıda hedef ince etkilerinin belirlenmesine ve gen ağlarının birden çok bileşenden tanınmasını sağlar Belirli bir miRNA 24 düzenlenir. Burada 3&#39;LIFE protokol açıklar ve 275 insan 3&#39;UTRs (Şekil 1) &#39;in bir paneline karşı iyi karakterize edilmiş iki miRNA&#39;lar, miR-10b ve izin-7c taranmasıyla, fizibilite olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycylglycine</td><td>Sigma</td><td>G1127-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kx PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>FLAAS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma</td><td>E0399</td><td></td></tr><tr><td>K H2 P O4</td><td>Sigma</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Sigma</td><td>C3230</td><td></td></tr><tr><td>PBS/HEPES</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Pennicilin/Streptomicin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td>T2600000</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxiPrep Kit</td><td>Promega</td><td>A2392</td><td></td></tr><tr><td>96-well miniprep plate</td><td>Pall</td><td>8032</td><td></td></tr><tr><td>96-well shuttle plates</td><td>Lonza</td><td>V4SP-2096</td><td></td></tr><tr><td>5x Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>E1941&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well GloMax Plate Reader</td><td>Promega</td><td>E9032</td><td></td></tr><tr><td>Biomech FX Liquid Handler Robot</td><td>Beckmann</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001</td><td></td></tr><tr><td>96-well Shuttle System</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

3&#39;UTRs fonksiyonel Elementlerin Lüminesans Tanımlama (3&#39;LIFE) sorgulanan 3&#39;UTRs yüzlerce bir dizi içinde spesifik miRNA&#39;ların hedefleri hızlı tanımlanmasını sağlar. Hedef tespiti MiRNA hedefleme işlevsel bir okuma verir translasyon çıkışının ölçülmesi mRNA düzeyinde bağlanmasını saptayan çift lusiferaz deneyi, dayanmaktadır. 3&#39;LIFE genom ekranlar yapma tescilli olmayan tamponlar ve reaktifler ve kamuya açık muhabiri kütüphaneleri kullanır uygulanabilir ve maliyet-etkin. 3&#39;LIFE standart laboratuar ortamında ya yapılmış ya da sıvı taşıma robotlar ve diğer yüksek verimli enstrümantasyon kullanılarak ölçeklendirilebilir. İnsan 96-yuvalı plakalar içinde klonlanmış 3&#39;UTRs ve iki test miRNA&#39;ların bir veri kümesi kullanılarak bir yaklaşımı göstermektedir, salma 7c ve miR-10b. Bu 96 gözlü bir formatta DNA hazırlama, transfeksiyon, hücre kültürü ve lusiferaz tahlilleri yerine ve veri için araçlar temin etmek gösterilmektedirAnaliz. Sonuç olarak 3&#39;LIFE yüksek, tekrarlanabilir hızlı, sistematik ve yüksek güven hedeflerini belirler.

luminometre çıktı dosyası hem ateş böceği ve Renilla lusiferaz proteinleri ham ölçümlerini içerir. Ve - Mangone laboratuvar web sitesinden (edinilebilir &quot;3&#39;LIFE multiplate analizi&quot; tabloları - Bu ham biçimi &quot;tek plaka analizi 3&#39;LIFE&quot; ile uyumludur <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). Tek plaka analizi tablo otomatik ateşböceği / Renilla oranını hesaplar uygun negatif kontrole her miRNA normalleştirir ve her plaka üzerinde baskı d...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay at JoVE.com

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Görüntüleme.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Video: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Biyomühendislik

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Gelişim Biyolojisi

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Kanser Araştırmaları

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biyokimya

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Biyoloji

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

3'LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler