We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Zellkultur (24-48 h vor der Transfektion) <ol><li> 24-48 h vor der Transfektion Samen eine ausreichende Menge HEK293T-Zellen basierend auf der Anzahl von Platten mit 96 Vertiefungen transfiziert. HINWEIS: Für die konsequente Transfektionen Platte Zellen mit einer ausreichenden Dichte schnelle Teilung zu begünstigen, noch nicht mehr als 70-90% Konfluenz werden zum Zeitpunkt der Transfektion. </li><li> Jede Platte mit 96 Vertiefungen erfordert 9 x 10 6 Zellen (75.000 Zellen pro Vertiefung, und 120 Vertiefungen pro Platte für die Verwendung von Vorratsbehälter und Mehrkanalpipette Konto). Berechnung der Verdopplungszeit von HEK293-Zellen (~ typischerweise 20 h), und Samen die geeignete Anzahl von Zellen, um mindestens 9 x 10 6 Zellen zur Zeit der Transfektion erhalten. A 145 mm Kreiskulturplatte ist in der Regel ausreichend für 3 96-Loch-Transfektionen, wenn sich zu ~ 90% Konfluenz, mit ~ 10% der Zellen verbleibende, um eine neue Platte reseed. </li></ol> 2. Vorbereitung vor der Transfektion _content &quot;&gt; HINWEIS: Die Herstellung der Puffer und die Plasmid-DNA in Schritt 2,0-2,2 sollte in den Tagen vor der Transfektion durchgeführt, da die Herstellung dieser Reagenzien können zeitaufwendig sein kann. <ol><li> Menschen 3&#39;UTR Klone, die mit dem Assay 3&#39;LIFE kompatibel sind, über ein öffentliches Plasmid-Repository 30 zur Verfügung. Reinigen DNA-Plasmid von Hand oder mit Liquid-Handling-Roboter. Verwenden Sie eine Transfektion Grade alkalische Lyse Mini-Prep 96-Loch-Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Resuspendieren der gereinigten Vektoren auf ~ 100 ng / ul pro Vertiefung. HINWEIS: Zu wenig Luciferase-Signal wird, wenn die Plasmid-Konzentration unter 40 ng / &amp; mgr; l. </li><li> Erhalten die pLIFE-miRNA-Vektoren 30 oder Klon mit der Rohrleitung in 1B 24. Resuspendieren der Vektoren in einer Konzentration von 500 ng / ul für jede miRNA und Blank Steuer Plasmide. </li><li> Aufgrund der Empfindlichkeit der Nukleofektion Pufferbedingungen, sicherzustellen, dassdas Gesamtvolumen der transfizierten Materialien (einschließlich Zellen und Plasmide), 10% der gesamten Flüssigkeit in jede Vertiefung der 96-Loch-Transfektion Platte nicht überschreiten. Um dies zu erreichen, konzentrieren die pLIFE-miRNA Plasmid-Lager in einer Konzentration von mindestens 500 ng / ul. </li><li> Vorbereitung 10x Glühwürmchenluciferase Pufferreagentien (Tabelle 1), und das 1X Renilla Luciferase Pufferreagentien (Tabelle 2), die für bis zu 6 Monate gelagert werden können. HINWEIS: Der DVB-T in der Glühwürmchen-Luciferase-Puffer muss in Lösung bei -20 ° C in den einmaligen Gebrauch Aliquots gelagert werden. </li></ol> 3. Bereiten Nach Artikel Unmittelbar vor der Transfektion <ol><li> Vorbereitung Transfektionspuffer enthaltenden PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Bereiten Sie diese frischen, auch wenn es für bis zu 1 Monat bei 4 ° C ohne merkliche Abnahme der Transfektionseffizienz gespeichert werden. Bei der Formulierung Puffer und Plasmid-DNA Bände, davon ausgehen, 120 Reaktionen für jede Platte mit 96 Vertiefungen zu sufficiently machen Fehler beim Pipettieren und Lautstärke mit Flüssigkeitsreservoirs und Mehrkanalpipetten verloren. Aliquot 18 ul pro Vertiefung Transfektionspuffer (120 Wells / 96-Well-Platte = 2,16 ml pro Platte), und beiseite stellen. HINWEIS: Die zell Elektroporationsvorrichtung ist extrem empfindlich auf die Pufferbedingungen verwendet, um Zellen zu transfizieren. Genauigkeit bei der Herstellung von Puffern wird eine konstante Leistung des Gerätes zu gewährleisten. Zusätzliche Vorsicht ist bei der Durchführung des Assays, um Verdunstung von Puffern zu verhindern, und zwar durch Minimieren der Zeit, daß der Puffer gelassen wird in Mikrozentrifugenröhrchen, Platten mit 96 Vertiefungen, Reservoirs und Elektrodenplatten aufgedeckt genommen werden. </li><li> Reserve vier Brunnen für die folgenden Kontrollen, keine pLIFE-3&#39;-UTR (zum Hintergrund der Luciferase-Assay zu messen), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (negative Zielkontrolle), Positivkontrolle für die miRNA # 1, positive Kontrolle für die miRNA # 2. HINWEIS: Diese Vektoren sind öffentlich zugänglich 30. Alternativ kann jede zuvor validierten Zielkann als eine Positivkontrolle verwendet werden. </li><li> Warmen Medien, Trypsin (0,25%) auf 37 ° C. </li><li> In jede Vertiefung der 96-Loch-Zellkulturplatte, 200 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 1% Pen / Strep und in einem 37 ° C Inkubator für die Verwendung nach der Transfektion platziert. </li><li> Schalten Sie alle Geräte Zelle Elektroporation, gefolgt von der unterstützenden Software. Verwenden Pulse Code FF120 für HEK293T-Zellen und PBS / HEPES-Puffer. </li></ol> 4. Herstellung von Plasmid-DNA und Zellgemisch HINWEIS: Die folgende Protokoll geht davon Transfektion drei Platten mit 96 Vertiefungen in einem Experiment für einen Bildschirm mit zwei miRNAs (miRNA # 1 und # 2 miRNA). Jede Platte wird auf die gleiche Platte mit 96 Vertiefungen von pLIFE-3&#39;UTR Plasmide entsprechen, und dreimal mit pLIFE-miRNA-blank, pLIFE-miRNA # 1, oder pLIFE-miRNA # 2 behandelt werden. <ol><li> Bereiten Sie 3 Bestände pLIFE-miRNA + Transfektionspuffer für jedes miRNA. Dieser Bestand sollte für 50% (10 ul) des Gesamtvolumens der jedes Kontogut, um 120 Brunnen multipliziert. Daher sollte jede Aktien 1,08 ml Puffer + 120 ul Plasmid-DNA (pLIFE-miRNA) enthalten. </li><li> Zellen aus 145 mm-Kulturplatte zu entfernen durch Eluieren Medien, wäscht vorsichtig mit PBS, und Behandeln mit ~ 5 ml 0,25% Trypsin für 5 min bei 37 ° C. Trypsin zu neutralisieren mit einem gleichen Volumen an Medium und Pellet-Zellen bei 300 g für 5 min. </li><li> Entfernen Trypsin / Medien und Pellet in ~ 5-10 ml Medium (je nach Zelldichte und genaue Bereich von Zellzähler). </li><li> Zählen von Zellen mit einem Zellzähler. Stellen Sie sicher, dass Zellen&gt; 95% lebensfähig und in exakte Reihe von Maschine. HINWEIS: Eine falsche Zellenzahl kann von extrem hohen Zellkonzentrationen (&gt; 6.0x 10 6 / ml) zur Folge haben. Transfektion zu viele Zellen drastisch zu reduzieren Effizienz der miRNA-Targeting durch Reduzierung Plasmid: Zellverhältnis und / oder abnehm Transfektionseffizienz. </li><li> Aliquot drei Röhren mit jeweils 9 x 10 6 Zellen, die den Zellen entsprechen rzur Transfektion von einer Platte mit 96 Vertiefungen equired. Spin-Zellen bei 300 × g für 3 min. </li><li> Medien zu entfernen. Achten Sie darauf, so viel wie möglich zu Medien mit minimaler Störung des Pellets zu entfernen, da überschüssige Medien Transfektionseffizienz beeinflussen. </li><li> Die Zellen in 1,2 ml Transfektionspuffer / miRNA Plasmid-Gemisch, und beiseite stellen. </li><li> Die folgenden Schritte detailliert Resuspension pLIFE-3&#39;UTR Plasmid in Transfektionspuffer. Da dies in 96-Well-Platten auf, achten Sie darauf, Verdampfung von Puffer durch Abdeckplatten zu allen Zeiten zu vermeiden. <ol><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, bewegen 32,4 ul Transfektionspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte (9 ul [pro Transfektion] * 3 [Platten] * 1.2 [für Pipettenfehler Konto]). </li><li> In 3,6 &amp; mgr; l (~ 100 ng / ul) von Mini-prepped pLIFE-3&#39;UTR Plasmid in jede Vertiefung geben und gut mischen. </li><li> Je 10 &amp; mgr; l dieser Mischung in jede Vertiefung der 96-Loch-Transfektion Platte und Abdeckung. </li></ol></li></ol><ol><li> Bewegen 1.2 ml der ersten Zelle / Puffer / pLIFE-miRNA Plasmid-Gemisch in das Reservoir. Gut mischen. </li><li> Zugabe von 10 ul dieser Mischung in der ersten 96-Well-Transfektion Platte 10 ul Transfektionspuffer / pLIFE-3&#39;UTR bereits enthält. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. HINWEIS: Equal Suspension von Zellen in dem Puffer wird auch sichergestellt und gründliche Durchgang des elektrischen Stroms durch die Küvette und maximieren Transfektionseffizienz. </li><li> Platzieren Sie 96-Loch-Transfektion Platte auf der Zell Elektroporationsvorrichtung und initiieren Transfektion. </li><li> Nach Transfektion abgeschlossen ist, fügen Sie 100 ul der vorgewärmten Medien von 96-Well-Kulturplatte in jedes Well der 96-Well-Platte Transfektion und gut mischen. Bewegen Sie 100 ul von jeder Vertiefung in die 96-Loch-Kulturplatte. </li><li> Mischen Zellen in Kulturplatten mit Pipette vertikal in der Mitte der Vertiefung angeordnet ist, die als Zellen dazu neigen, an den Seiten des w aggregierenell, wenn richtig gemischt. </li><li> Wiederholen 5,1-5,5 für die verbleibenden zwei Platten. </li><li> Reinigung 96-Well-Platte Transfektion <ol><li> Die 96-Well Platten Transfektion kann durch Waschen mit 70% EtOH geführt werden, um keinen Übertrag von Nukleinsäuren zwischen den Experimenten zu gewährleisten. Führen Sie zwei 70% EtOH wäscht mit einer Sprühflasche, um vollständig zu füllen jedes Loch, gefolgt von Abwischen überschüssigen EtOH auf den Elektrodenstreifen (Unterseite) und ermöglicht die Transfektion Platten vollständig trocknen in der Kultur Kapuze. Anmerkung: Wir haben für Carry-over DNA-Kontamination durch Transfizieren 12 Vertiefungen mit 2 &amp; mgr; pmaxGFP jeweils in HEK293T-Zellen Plasmid getestet, gefolgt von einem einzelnen Waschschritt mit 70% EtOH und eine zweite Transfektion ohne Plasmid-DNA. Mit diesem extrem hohen Plasmidkonzentration, extrem helle Reporter und einem einzigen Wasch, gab es keine beobachtbaren Fluoreszenz in einem der 12 Transfektionen replizieren. </li></ol></li><li> Kulturzellen für 48-72 h bei 37 ° C, gefolgt von der doppelten luciflöschen Assay. </li></ol> 6. Zelllysat Vorbereitung für Luciferase Assay <ol><li> Verdünnen Sie Lysepuffer mit 4 Teilen Wasser, 1 Teil 5x passive Lysepuffer in einem Reservoir. Berechnen Sie 26 ul / Vertiefung, Hinzufügen ~ 20 zusätzliche Mengen, um den Verlust in dem Behälter zu berücksichtigen. HINWEIS: Der Puffer wird bei -20 ° C gelagert und können äußerst dickflüssig und damit vor so dass der 5-fach-Puffer auf Raumtemperatur zu nähern wird Pipettiergenauigkeit verbessern. </li><li> Analysieren Sie jede Vertiefung für Transfektionseffizienz mittels Fluoreszenzmikroskopie. Beachten Sie, etwaige Unstimmigkeiten in Brunnen, die nicht effizient transfizieren haben (&gt; 90% Transfektionseffizienz) oder äußern niedrigen RFP Hinweis auf Überfüllung oder Medien Erschöpfung. Entfernen Sie diese Brunnen aus der Analyse. </li><li> Vollständig zu entfernen Sie das Medium aus den Zellen, man aufpassen, nicht zu schnell zu eluieren, welche dazu führen, Zellen zu lösen wird. HINWEIS: Verbleibende Medien werden das Lysat und verursachen Schwankungen der Werte über Experime verdünnennts. </li><li> In 26 &amp; mgr; l Lysepuffer in jede Vertiefung, und auf einem Plattenschüttler / Wippe bei niedriger / mittlerer Geschwindigkeit für ca. 20-30 min. Nutzen Sie diese Zeit, um die Luciferase-Puffer vorzubereiten, waschen und prime das Luminometer (n), und übertragen Lysat bis opak Messplatten. </li></ol> 7. Doppel Luciferase Assay Hinweis: Wenn mehrere Platten werden der Reihe nach auf einem Luminometer gemessen, erstellen Puffermastermixen mit alles außer ATP und Substrate, das Hinzufügen dieser Reagenzien, gefolgt von pH-Einstellung unmittelbar vor der Anwendung mit jeder Platte. ATP und Substrate können im Laufe der Zeit verschlechtern; Kohärenz der Zeit sind diese Reagenzien im Puffer Konsistenz über mehrere Platten zu verbessern. <ol><li> Bereiten 1x Luciferase-Puffer (Tabelle 1): <ol><li> Wickeln Sie zwei Rohre (in der Regel 15/50 ml Zentrifugenröhrchen) mit der Firefly und Renilla-Puffer mit einer Aluminiumfolie, die als Substrate können lichtempfindlich sein. </li><li>Bereiten 1x Firefly Luziferase-Puffer. 1 ml von jeder der fünf 10x Glühwürmchenluciferase Reagenzien Zugabe EGTA letzten, auf 5 ml H 2 0 zu einer endgültigen Konzentration 1x. <ol><li> Hinzuzufügen 0,025 g ATP auf 10 ml 1x firefly Puffer. Mischen Sie durch mehrmaliges Wenden. Halten ATP auf Eis zu allen Zeiten. ATP wird abgebaut, so dass, wenn mehr als eine Platte nacheinander messen, müssen Puffer neuen Anfang gemacht werden in diesem Schritt für jede weitere Platte. </li><li> 100 l 100 Käfer-Luciferin (Substrat) (Tabelle 1) Buffer sollte gelbliche Farbe auf Basis von pH ändern. </li></ol></li><li> 1x Renilla-Luciferase-Puffer Rekonstitution: Per 96-Well-Platte, aliquote 10 ml 1 &quot;Renilla Puffer&quot;. <ol><li> 100 l BSA (44 mg / ml Stamm). </li><li> Wenn Screening mehr als eine Platte, separate Master-Mix in 10 ml-Teilmengen. </li><li> Fügen Sie 100 ul Coelenterazin zu Puffer (bisher aufgeteilt und bei 100x konz gespeichert.) </li></ol></li> &lt;li&gt; Einstellen des pH auf 8,0 firefly 1x Puffer, gefolgt von dem 1x Renilla-Puffer auf 5,0 unter Verwendung von NaOH und HCl. HINWEIS: Die Aktivität von jedem Puffer und die Fähigkeit des Renilla Puffer, um die Firefly-Luciferase-Aktivität zu quenchen ist stark abhängig vom pH-Wert. Für gleichbleibende Ergebnisse als äußerst präzise in diesem Schritt. </li><li> Bringen Volumen jedes Puffers (entsprechend 1 96-well-Platte) auf 10,5 ml für Luminometer Priming unterzubringen. </li></ol></li><li> Übertragen Lysat bis opak weißen Platten: An dieser Stelle sollten die Zellen in Lysepuffer für ~ 20 min. 25 &amp; mgr; l aus jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, lesen Sie auf- und abpipettieren gründlich zum Aufbrechen der Zellklumpen und homogenisieren Sie das Lysat. </li><li> Bereiten Sie das Luminometer. Schalten Sie das Luminometer und wählen Sie das Protokoll in der DLR-Ordner namens &quot;DLR mit zwei Injektionen&quot;. Andere Formate sind nicht mit der Datenanalyse-Pipeline (unten) kompatibel. <ol><li> Wählen Sie die Brunnen zu sein tinteressiert (alle Vertiefungen ist die Standardeinstellung). </li><li> Verlängern Sie die &#39;Verzögerung vor der Messung &quot;Einstellung auf 5 Sekunden, mit einer 10 sec Messzeit (siehe 29 für nähere Information). </li><li> Kapillar-Waschschritte: 3x Wasser, EtOH 3x, Wasser 3x, trocken 3x. Prime Puffer einmal in den Abfall, und dann ein zweites Mal prime zurück in den Adern, um sicherzustellen, Mischen. Spritzen Sie die Glühwürmchen Puffer ersten und prime es in der linken Kapillare, gefolgt von Renilla in der rechten Kapillare. </li></ol></li><li> Initiieren Sie die Luciferase-Assay. Jede Platte sollte 48 min nehmen ~ zu lesen. Nach Beendigung speichern Sie die Datei zuerst, und dann wiederholen Sie die Waschschritte und schaltete den Luminometer. HINWEIS: Mehrere Platten können gelesen werden und Daten auf dem gleichen Excel-Datei gespeichert, aber Probleme können mit mehreren Platte auftreten, wo das Luminometer liest Programm abstürzen. Achten Sie darauf, alle Daten zwischen den Messungen speichern und Screenshots, wenn Programm stürzt vor Speichern möglich ist. <ol><li> Ersetzen Sie alte Puffermit neuen, wobei Sie auf prime mindestens zweimal mit neuen Puffer vor dem Start der neuen Platte. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Nutzen Sie Excel-Tabellen &quot;3&#39;LIFE - Einzelplattenanalyse&quot; und &quot;3&#39;LIFE - Mehr Analyse&quot;, erhältlich von <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Kopieren Sie Rohdaten für Firefly und Renilla-Luciferase-Messungen von Luminometer Ausgabedatei in die entsprechenden Stellen an den negativen Zustand, miRNA # 1, # 2 und miRNA in das &quot;3&#39;LIFE - Einzelplattenanalyse&quot; Tabellenkalkulation. </li><li> Das Spreadsheet berechnet automatisch Firefly / Renilla-Verhältnis und normalisieren jede miRNA auf die entsprechende negative Kontrolle und Repression zu normalisieren Werte in jeder Platte. HINWEIS: Diese Tabelle wird automatisch Brunnen mit geringer Luciferase-Signal zu identifizieren, markieren Sie deutlich unterdrückte Vertiefungen und bieten Maßnahmen repressiauf über die gesamte Platte. Siehe 24 für eine detaillierte Erläuterung der statistischen Analyse. <ol><li> Kopieren Sie die Werte aus der &quot;Normalized RI Index&quot; Box, in die entsprechenden Zellen in der &quot;3&#39;LIFE - Mehr Analyse&quot; Tabellenkalkulation an der Position, die für jedes miRNA getestet replizieren # 1. Wiederholen Sie dies für alle biologischen Replikaten an verschiedenen Tagen durchgeführt. </li></ol></li><li> Falls gewünscht, legen Sie die Gennamen und Zielvorhersagestatus in Spalten B und D auf. <ol><li> Lassen Sie die Tabelle, um den Durchschnitt aller Platte automatisch zu berechnen. Beachten Sie die Daten in 96-Well-Format als Wärme Karte (Abbildung 2). Die Datei organisiert auch die Daten in Listenform (Abbildung 2). HINWEIS: Die Repression Index ist die verwendet werden, um mutmaßlichen miRNA Targets zu identifizieren Maßnahme. Verschiedenen Stringenzbedingungen Parameter verwendet werden, basierend auf individuellen Vorlieben. Im Durchschnitt sehen wir wahrscheinlich Treffern unter Repression Index 0.8 und durch t-Test (p -Wert &lt;0,05) statistisch signifikant. Wie in Abbildung 3 potentielle Ziele auf der Grundlage dieser Kriterien wird in rot hervorgehoben. </li></ol></li></ol>

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C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'LIFE:+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput.">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li><li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+C.+elegans+3'UTRs.">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li><li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

Die 3&#39;LIFE Assay identifiziert Funktions miRNA Ziele in 3&#39;UTRs in Hochdurchsatz. Dieser Assay ist nützlich für Forscher, die experimentell Identifizierung einer großen Anzahl von mutmaßlichen Ziele für deren miRNA interessiere möchten. Die 3&#39;LIFE Assay ein leistungsfähiger Ansatz zur 3&#39;UTR angetrieben Regulierung abzufragen, indem der Assay stellt ein funktionelles Maß miRNA Targeting und die binäre Testen eines einzelnen Reporter :: 3&#39;UTR gegen eine einzelne miRNA vertrauens adressieren das...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu erkennen und zu microRNA (miRNA) Ziele präzise Karte im Hochdurchsatz. MiRNAs endogenen nicht-kodierenden RNAs ~ 22 Nukleotide lang. Nach der Transkription und Verarbeitung, sind reife miRNAs in einem Proteinkomplex eingebaut namens RNA induced silencing complex (RISC). Jedes miRNA führt die RISC auf Zielelemente vor allem in den 3&#39;-untranslatierte Regionen (3&#39;UTRs) von Boten-RNAs (mRNAs) gelegen, was entweder Übersetzung Repression oder mRNA-Spaltung 1. MiRNA erkennen, Zielorte basierend auf Standard-Watson-Crick und G: U Wobble-Basenpaarung und entartet in der Natur, mit mehreren fehlgepaarten Basenpaaren und ausgebeult Regionen. Viele miRNAs sind im Großen und Ganzen aus Pflanzen auf den Menschen 2,3, wo sie eine breite Palette von biologischen Rollen spielen konserviert. In Metazoen können miRNAs mehrere biologischen Prozessen einschließlich Zellschicksal Entscheidungen 4, Entwicklungszeit 5 beeinflussen </sup&gt;, Und weisen häufig gewebespezifische Expressionsmuster 6,7. MiRNA misexpression kann auch aberrante Genregulation, die wesentlichen Einfluss auf das Zellverhalten ausschließlich auf die Funktion der Zielgene Portals resultieren. Als solche sind miRNAs zu einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Neurodegeneration 8,9, Diabetes und Krebs 10 11. Bioinformatic und Nassbank Ansätze vorschlagen, dass jeder miRNA kann in der Lage gezielt Hunderte bis Tausende von verschiedenen mRNAs 12-14 sein, die anzeigt, dass Hochdurchsatz oder genomweite Ansätze sind erforderlich, um diese großen Pool von potentiellen Wechselwirkungen zu untersuchen. Identifizierung von Zielgenen ist eine kritische Komponente des mechanistisch definieren miRNA-Funktion, und dazu müssen die Forscher in der Lage, Ziele in großem Maßstab zu offenbaren. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um miRNA Ziele, einschließlich bioinformatische Vorhersage-Algorithmen zu identifizieren, Hochdurchsatz-Sequenzierunggezielte mRNAs und Reporter basierte Assays. Jeder dieser Ansätze hat inhärente Stärken und Schwächen. Da miRNA Targeting durch Sequenzspezifität geführt, insbesondere von Nucleotiden 2-6 der miRNA (der so genannten Seed-Region), mehrere Algorithmen entwickelt, um miRNA gesamten Genom vieler Organismen vorherzusagen. Diese Algorithmen werden mit den beobachteten Basenpaarung Motive validierter miRNA Targets ausgebildet und häufig nutzen, Parameter wie stringent seed Paarung Website Erhaltung und / oder thermodynamische Stabilität 15. Obwohl diese Filter zu verfeinern, die große Anzahl von mutmaßlichen Ziele mit ausreichender Komplementarität zu nur hohen Vertrauens Ziele können sie artspezifisch nichtkanonische miRNA Zielstellen, die den letzten Beweis schlägt sind weit verbreitet 16-24 ausschließen. Darüber hinaus sind diese Prognosen nicht berücksichtigt Mechanismen der mRNA-Prozessierung, die miRNA-Zielstellen, wie zum Beispiel alternative Polyadenylierung ausschließen nehmen25, 26 RNA-Editing, RNA-Methylierung 27 und kooperative Bindung. Als solche haben hohen falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse für viele Algorithmen 22,24,28 gemeldet. Während diese Algorithmen sind nützlich, um Kandidaten miRNA Ziele für nachfolgende experimentelle Validierung zu identifizieren, diese hohen Fehlerquoten begrenzen die Wirksamkeit von Bioinformatik-Ansätze für die systematische miRNA Zielerfassung. Systematisch nach Wechselwirkungen zwischen einem bestimmten miRNA und möglicherweise gezielt 3&#39;UTRs Sonde haben wir ein Hochdurchsatz-Assay genannt Leucht Identifizierung von Funktionselementen in 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24 entwickelt. Dieser Assay misst direkte Interaktionen und translationale Repression des Test 3&#39;UTR von einer Abfrage miRNA mit einem Dual-Luciferase-Reportersystems. In diesem System wird die 3&#39;UTR eines Gens von Interesse stromab des Leuchtkäfer-Luciferase (fluc) Reporter-Leserahmen kloniert. Die Reporter construct ist mit einer Abfrage miRNA in HEK293T-Zellen cotransfiziert. MiRNA-Targeting wird durch Messung der relativen Änderung zwischen dem Test Fluc :: 3&#39;UTR-Reporter und eine zweite nicht-spezifische Renilla Luciferase-Reporter bestimmt. Wichtig ist, dass die Luciferaseassays detektieren miRNA / mRNA-Wechselwirkungen, die die Translations Ausgang des Reporter beeinflussen. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, um miRNA Regulation, wie RT-qPCR und Western-Blots zu erkennen, daß diese umgeht Unterschiede in mRNA-Abbau und translationale Repression, sowie Änderungen in Proteinmenge unabhängig von 3&#39;UTR basierte Regulierung. Luciferase-Assays werden häufig genutzt, um direkten miRNA Ziele wegen ihrer relativen Einfachheit und Sensibilität, aber ihre Verwendung in Hochdurchsatz-Screens zu validieren ist von hohen Kosten, die mit verbrauchende Reagenzien Dritter, das Fehlen von 3&#39;UTR Bibliotheken aus öffentlichen Quellen, und das Fehlen standardisierter Luciferase protocols, zu Schwierigkeiten führen beim Vergleich funktionelle Unterdrückung in mehreren Datensätzen. Um die Verwendung des 3&#39;LIFE Assay zu erleichtern, haben wir Wert auf eine Vereinfachung der Versuchsplanung, Nutzung von nicht-kommerziellen Transfektion 24 und Luciferase Reagenzien 29 gestellt haben, die Schaffung einer 3&#39;UTR-Bibliothek, die regelmäßig aktualisiert und erweitert wird, und ist durch die verfügbaren eine öffentliche Plasmid-Repository 30. Die Skalierbarkeit der 3&#39;LIFE Assay ermöglicht Screening einer großen 3&#39;UTR Bibliothek für die Ausrichtung von einem bestimmten miRNA ohne Vorspannen des Bildschirms in Richtung bioinformatisch identifizierten Gene. Neben der Prüfung kanonischen und vorhergesagten Wechselwirkungen ermöglicht diese systematischen Ansatz die Identifizierung von neuen Targets über nicht-kanonischen und / oder Spezies-spezifische Wechselwirkungen angetrieben. Wichtig ist, dass die Wirkung von miRNA gezielt auf die Proteinproduktion versteht man im allgemeinen in bescheidenen translationale Repression 15,31 &lt;führen/ Sup&gt;, was darauf hindeutet, dass eine primäre Rolle der miRNA Regulation ist die Feinabstimmung Protein-Ausgang, Schutz vor abweichenden Genexpressionsniveaus und bieten Robustheit auf bestimmte Programme 32,33 Zelle. Die Empfindlichkeit des Luciferase-Assay in Kombination mit der Natur Vielzahl negativer miRNA / mRNA-Wechselwirkungen im 3&#39;LIFE Bildschirm erlaubt den Nachweis von subtile Effekte der miRNA-Targeting auf einer großen Anzahl von Genen und die Identifizierung von mehreren Komponenten der Gen Netzwerken, werden durch eine miRNA 24 geregelt. Hier beschreiben wir die 3&#39;LIFE Protokoll, und zeigen es Machbarkeit durch Screening von zwei gut charakterisierten miRNAs, miR-10b und lassen-7c gegen eine Auswahl von 275 menschlichen 3&#39;UTRs (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycylglycine</td><td>Sigma</td><td>G1127-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kx PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>FLAAS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma</td><td>E0399</td><td></td></tr><tr><td>K H2 P O4</td><td>Sigma</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Sigma</td><td>C3230</td><td></td></tr><tr><td>PBS/HEPES</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Pennicilin/Streptomicin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td>T2600000</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxiPrep Kit</td><td>Promega</td><td>A2392</td><td></td></tr><tr><td>96-well miniprep plate</td><td>Pall</td><td>8032</td><td></td></tr><tr><td>96-well shuttle plates</td><td>Lonza</td><td>V4SP-2096</td><td></td></tr><tr><td>5x Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>E1941&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well GloMax Plate Reader</td><td>Promega</td><td>E9032</td><td></td></tr><tr><td>Biomech FX Liquid Handler Robot</td><td>Beckmann</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001</td><td></td></tr><tr><td>96-well Shuttle System</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

Lumineszierende Bezeichnung von Funktionselementen in 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) erlaubt die schnelle Identifizierung von Zielen bestimmte miRNAs innerhalb einer Anordnung von hunderten abgefragt 3&#39;UTRs. Zielidentifizierung basiert auf dem Dual-Luciferase-Assay, das die Bindung erkennt auf mRNA-Ebene durch Messung translationale Ausgang, so dass ein funktions Auslesen von miRNA gezielt beruht. 3&#39;LIFE nutzt nicht-proprietäre Puffer und Reagenzien, und öffentlich zugängliche Bibliotheken Reporter, dass genomweite Screens durchführbar und kostengünstig. 3&#39;LIFE kann in einem Standard-Testumgebung durchgeführt werden, entweder mit oder up Liquid-Handling-Roboter und andere Hochdurchsatz-Instrumentierung skaliert. Wir veranschaulichen die Vorgehensweise unter Verwendung eines Datensatzes der menschlichen 3&#39;UTRs in 96-Well-Platten kloniert und zwei Test miRNAs, let-7c und miR-10b. Wir zeigen, wie man DNA-Präparation, Transfektion, Zellkultur und Luciferaseassays in 96-Well-Format durchführen, und bieten Werkzeuge zur DatenAnalyse. Abschließend 3&#39;LIFE ist sehr gut reproduzierbar, schnell, systematisch und identifiziert hohes Vertrauen Ziele.

Das Luminometer Ausgabedatei enthält Rohmessungen für beide Firefly und Renilla-Luciferase-Proteine. Das RAW-Format ist mit dem &quot;3&#39;LIFE - Einzelplattenanalyse&quot; kompatibel &quot;3&#39;LIFE - Mehr Analyse&quot; Arbeitsblätter zur Verfügung von der Mangone lab Website ( <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). Die einzelne Platte Analyse Tabellenkalkulation berechnet automatisch Firefly / Renilla-Verhältnis, normalisiert jeweils miRNA an die entsprechende Negativkon...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Aufrufe.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Serie: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Forschung

Biotechnik

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Entwicklungsbiologie

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Krebsforschung

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biochemie

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Biologie

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3'LIFE Assay

Zusammenfassung

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