The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Not: Bu protokol Araştırma Sorumlu Davranış Arizona Ofisi Üniversitesi kuralları takip ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır 1. Zebra balığı Islahı ve Embriyo Bakım <ol><li> E3 embriyo orta 8 hazırlayın. 60x stok solüsyon To Make, 1.95 L ddiH 2 O. içinde 34.8 g NaCl, 1.6 gr KCI, 5.8 g CaCl2 ● 2H 2 O ve 9.78 g MgCl2 ● 6H 2 O çözülür DdiH 2 O. kullanarak 2 L ses seviyesini ayarlama NaOH ve HCI kullanılarak 7.2 pH ayarlayın </li><li> 1 L ddiH20 16,5 ml 60x stok sulandırmak, 1x E3 embriyo orta hazırlamak. 100 ul% 1 metilen mavisi ekleyin. </li><li> Yetiştirme <ol><li> Ev Erkek ve Dişi anaç (7 - yaş 18 ay) ayrı ayrı doğurganlığı artırmak için. </li><li> Yumurtalar istenen gün önce önce 2 saat - 1 ışıklarını kapatın. C - Set up çiftleşme (2 kadın 1 erkek ve 1)Rossing kafesleri, daha önce 9 nitelendirdi. Onlar yetişkin balıklar tutuldukları tank ucun delikli tabanı üzerinden geçerken yumurta predationu kaçmak için kapısı kafesleri izin verir. </li><li> İsteğe bağlı. Zamanlı ıslahı için, (morfolino enjeksiyonunu içeren çalışmalar için gerekli olacak gibi), şeffaf bir plastik bölücü erkek ve kadın balık ayırmak, yumurta ve gübreleme zamanlı döşenmesi sonucu sabah bu çıkartın. Morfolino çalışmalar için, tedavi başına gereken embriyonik balık sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirmek. Etki ya da varyasyon büyüklükte bir tahmin olmaksızın, bir ön deneme, bir n = 8 ile çalıştırılabilir. </li></ol></li><li> (- 150 embriyolar / 10 cm petri 100) bir petri kabına geçiş kafesten yumurta dökün. Yumurta çanak dibe ve su kapalı dökmek için izin verin. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak kalan suyu çıkarın. Adım 1.1 yapılan E3 embriyo orta geri ekleyin. </li><li> Af olunGelecekteki yumurta ve balık transferi için topal cilalı tek kullanımlık pipet. Makas kullanarak, 0.25 ml mezuniyet dereceli atılabilir bir transfer pipet kesti. Pürüzlü kenarları, alev lehçe Bunsen beki üzerinde kesik ucu kaldırın. </li><li> Zebra balığı E3 embriyo orta petri 28.5 ○ C&#39;de post-fertilizasyon 10 cm (dpf) 4 gün embriyonik balık koruyun Twice her gün, bir alev herhangi gübresiz yumurta veya ölü embriyolar (opak beyaz görünümü) kaldırmak için atılan transfer pipet mezun cilalı kullanın. Her gün bir kez, E3 embriyo orta yerine. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak, kalan sıvıyı çıkarmak, E3 embriyo orta kapalı dökün ve önceden ısıtılmış (28.5 ○ C) E3 embriyo orta geri ekleyin. </li></ol> 2. Deney çözeltisi hazırlayın <ol><li> 0.22 uM filtre kullanılarak Tablo 1. Steril filtre deney solüsyonuna göre olan bir deney çözeltisi hazırlayın. Bir 28.5 ○ C steril tahlil çözümü, inisiyasyonu tahlil sıcak öncesindesu banyosu. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Toplam% </td><td> Cilt (ul / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embriyo Orta </td><td> 1,667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Çift deiyonize (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9623,3 </td></tr><tr><td> Alamar Mavisi </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Analiz Ortamı 3. Testi gerçekleştirmek <ol><li> Zebra balığı embriyolar steril süzülmüş E3 embriyo orta ile 3 kez durulayın. Bir behere debriyaj tüm canlı zebrafish embriyolar birleştirin. Steril filtre 75 ml E3 embriyo orta. Ince bir ucu tek kullanımlık transfer pipet kullanarak yenidenmümkün olduğunca Zebra balığı embriyolarının gelen E3 embriyo orta kadar hareket ettirin. 20 ml steril süzülmüş E3 embriyo orta geri ekleyin. Çıkarın ve E3 embriyo orta 3 kez değiştirin. </li><li> 96-iyi siyah 93 kuyuların her birine Levha 1 balık net alt plaka taraflı. Alev plastik tek kullanımlık transfer pipet mezun cilalı içinde ayrı ayrı (1.5 adım) bir embriyo yakalama ve yavaşça kuyunun içine püskürtülmesiyle plakaya embriyonik balık aktarın. 3 boş kuyulara durulanır balık içeren beher alınan E3 embriyo orta aktarın. Bu boş kuyular balıklar içerdikleri kuyuların tam olarak aynı suya maruz kalmış olmasını sağlar. Balık ve boş kuyular içerirler Her iki kuyu, bu aşamada bitiminde (200 ul), en az ½ dolu olmalıdır. </li><li> Boş kuyular da dahil olmak üzere 96 kuyu, içinde tahlil çözeltisi ile E3 embriyo orta değiştirin. Bu kademe, bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde 12 her sütun için bir seferde 1 sütun yapılmalıdır. Ince ucunu kullanarak atılabilir transfer pipet, plakanın (8 kuyu) bir sütunda her kuyudan E3 embriyo orta kaldırmak. Zebra balığı embriyo dokunmayın özen gösterin. Su çıkarıldı kuyuya her deney çözeltisi 300 ul ekle. Plaka 12 sütunlar için tahlil çözümü ile E3 embriyo orta ve değiştirme kaldırılmasını tekrarlayın. </li><li> İsteğe bağlı: Bir bileşik cevaben metabolizma hızı değişikliği sınamak için, 100 kez (100X) istenen tedavi konsantrasyonu bir çözüm yapmak. Dikkat çekici bir şekilde, 100x çözeltisi,% 0.1 daha fazla nihai DMSO konsantrasyonunu sınırlandırmak için% 10 DMSO aşmamasını sağlamak. Tedavi bölümlerinin her birine 100x çözeltisi 3 ul ekleyin. NOT: Tedavi kuyu sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirin. Bununla birlikte, yanıt veya varyasyonun büyüklükte bir tahmini olmadan, bir ön deneme tedavi 8 bileşiği ve balık içeren 8, araçla tedavi edilen kontrol oyuklarında çalıştırılabilir. <ol><li> (Kontrol hiçbir dru araç kontrolünün 3 ul ekleying tedavisi) balıklar içerdikleri kuyular. Bileşiğe fluoresan yanıt balıkta eylemlerinin bir sonucu olduğundan emin olmak için, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 3 Boş oyuklara ilaç ve araç tedavileri uygulanır. </li></ol></li><li> 590 nM&#39;de 530 nM uyarma dalga boyunda ve emisyon dalga boyu ile floresan plaka okuyucusu üzerinde balık dolu plaka okuyun. </li><li> Nemlendirilmiş inkübatör içine yerleştirin plakası 28.5 ○ C (tahlil çözeltinin photobleaching önlemek için tahlil boyunca karanlıkta plaka korumak) olarak ayarlanır. Deney 1 saat ila 24 saat arasında değişir zaman süreleri için çalıştırılabilir. Deneyin süresi çalışmanın amacı bağlıdır. Bir kısa süreli en uygun olabilecek bir kısa etkili olmayan kararlı bir bileşik yanıtı test için. Yine, stabil bir bileşik testleri veya genetik etkileri testleri için, deney süresi maksimize kümülatif sinyali ile ilgili avantajlar yararlanmak için tercih edilir. </li><li> Önceden belirlenmiş bir zaman noktasında (zamanlama belirlemenize yardımcı olması için 3.6 adıma bakınız)adım 3.5 ile aynı ayarlarla tekrar balık dolu plaka floresan okuyun. </li></ol> 4. Tedavi ile Floresans İlişkili Bağıl Değişim değerlendirin <ol><li> De çalışma sonucunda floresan zaman 0 floresan çıkarılarak her floresan değişimi hesaplanır. Balık (boşluklar) olmadan Wells balıklar içerdikleri kuyulardan uzak değerlerinin altında, 0&#39;a yakın değerlere sahip olmalıdır. Sonuca Floresans = Floresan değişim - Floresan 0 zamanında </li><li> Kontrol Kaynaklar akabinde kontrol kuyularının floresan ortalama değişiklik ile her çukurun fluoresans değişikliği bölmek için floresans nispi değişikliği tespit etmek için, floresans ortalama değişimi hesaplamak. Unutmayın ki, kontroller, araç kontrolleri veya genetik kontrolleri ya olabilir. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile.">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li><li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish.">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li><li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals.">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li><li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish.">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A practical approach. , (2002).</li><li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature.">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li><li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner.">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li><li>Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549 (2012).</li><li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Bakteri veya mantar ile kontaminasyon büyük ölçüde bu testin uygulanmasını sınırlayacaktır. E3 embriyo orta metilen mavisi fungal bulaşma olasılığını sınırlandırır. Embriyo boyunca bu bakım iki kez her gün ölü embriyolar kaldırmak için alınması çok önemlidir yetiştirme. Buna ek olarak, iyice deney başlatma gün steril E3 embriyo ortamı ile embriyolar durulanması gereklidir. Bu 2 adım embriyoların bakteriyel kontaminasyon potansiyelini sınırlar. Aşama 3.2 &#39;de tarif edilen Boş o...

Fare şu anda obezite araştırmaları için baskın modeldir. Kısa nesil aralığı ve fare kullanılabilir genetik araçları bugüne kadar eşsiz olmuştur. Ancak, Zebra balığı da kısa bir nesil aralığı vardır (3-4 ay) ve genetik manipülasyon 1,2 kolaylığı hatta fare geçti. Kadar genetik ve ilaç ekranlar 3 kullanım için yavruları ve potansiyeli sayıda fare üzerinde gerçekleşmiştir zebra balığı memeli genlerinin yaklaşık% 90 tutar. Obezitede çalışmalar için zebrabalıkları modelinin potansiyelini, tahliller enerji harcaması da dahil olmak üzere vücut ağırlığı regülasyonu, etkileyen faktörleri araştırmak amacıyla geliştirilmesi gerekmektedir. Metabolitler β-oksidasyon ve trikarboksilik asit döngüsü oksijenle işlenir zamanda tüketilir ve NADH 2 üretilir. Bu nedenle, NADH 2 metabolik yolların (metabolit oksidasyonu) ile metabolitlerin akış doğrudan bir göstergesidir. Poikil olarakhomotermlere 4 5&#39;ten kat daha düşük - otherms, H +, ATP sentezi gelen NADH 2 oksitlenmeyi koparan 4&#39;tür iç mitokondrial membran aracılığıyla kaçak. Bu duruma göre, zebra balığı NADH 2 çok sıkı bir şekilde, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi ile bağlantılıdır. Bu yazıda, enerji harcaması 5 için bir proxy olarak larva Zebra balığı NADH 2 üretimini ölçen bir tahlil açıklar. Oksijen tüketimi enerji tüketimini ölçmek için altın standarttır. Ancak, en iyi zebrafish yüksek verimlilik potansiyelinin yararlanmak, enerji harcama tahliller yüksek verimlilik için uygun olmalıdır. Sirkülasyon sistemi, kapalı bir bölme bağlıdır Oksijen tüketimi sistemleri 6 mevcuttur bölmelerin sayısına göre hacmi sınırlıdır. Açık hava O 2 tüketimi / CO2 üretim deneyleri de zebrabalıkları 5,7 uygulanmıştır. Bu açık hava 96 oyuklu levha temeld sistemleri, yüksek verim için uygun. Ne yazık ki, çevre ile gaz değişimi Bu tahlillerin duyarlılığını sınırlar. Biz son zamanlarda redoks göstergesi AlamarBIue 5 ile NADH 2 izler bir testin uygulanmasını yayınladı. Bu deney hacmi ve zebrabalıkları oksijen tüketimi analizler için ortak hassasiyetindeki sınırlamaların üstesinden gelmektedir. Zebra balığı tüm vücut enerji homeostazı çalışmaları için giderek önemli bir model haline geliyor. Bölümünde, Zebra balığı nedeniyle ileri genetik ekranlar ve ilaç ekranlarında kullanmak için uygun. Ayrıca, demonte ve knock-in, hızlı bir şekilde uygulanabilir dahil genetik manipülasyon hedef aldı. Daha önce bu deney bileşikleri ve metabolik oranı 5 değiştiren genleri tanımlamak için banyo ilaç uygulaması ve genetik devirme veya nakavt ile kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu deney zebrabalıkları doğasında yüksek kapasiteli avantajları yararlanmak için tasarlanmıştır. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">AlamarBlue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10-230-103</td>
			<td style="width:307px;">Manufactured by Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-26</td>
			<td>Manufactured by Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-771-9AM</td>
			<td>Manufactured by Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Black sided clear bottom 96-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-320-785</td>
			<td>Manufactured by E&#38;K Scientific Products Inc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

Zebra balığı Zebra balığı, enerji homeostazı ve obezite çalışma için yaygın olarak uygulanan bir model yapmak potansiyeline sahip doğal avantajları ile önemli bir model organizma vardır. Embriyolardaki deneyler, 96 veya 384 oyuklu plaka formatmda gerçekleştirilir edilmesi için zebrabalıkları küçük boyutu sağlar Morfolino ve CRISPR tabanlı teknolojiler banyo uygulaması tarafından genetik manipülasyon kolaylığı ve ilaç tedavisi iyileştiren yaşayabilir olduğunu. Ayrıca, Zebra balığı roman gen keşfi için izin ileri genetik ekranlar için idealdir. Obezite için bir model olarak zebrafish göreceli yenilik göz önüne alındığında, tam bu faydaları istismar araçları geliştirmek için gereklidir. Burada, aynı zamanda embriyonik zebrafish binlerce enerji harcanmasını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bireysel balık izole etmek için, 96 gözlü levhalar kullanan bir bütün hayvan mikroplaka platformu geliştirdik ve ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü canlılığı yeniden hesaplanan toplam NADH 2 üretimini değerlendirmekAjan AlamarBIue. Poikilotherms NADH 2 üretim ve enerji tüketimi arasındaki ilişki sıkıca bağlanır. Bu enerji harcaması tahlil hızla doğrudan enerji tüketimini değiştirmek veya uygulamalı ilaç (örn insülin duyarlılığını) yanıtı değiştirebilir farmakolojik veya genetik manipülasyonlar taramak için potansiyel oluşturur.

Deney çözeltisi embriyonik balık (Şekil 1) yokluğunda floresansında bir artış meydana gelmez. Ancak, tahlil kuyunun içinde metabolizma hızı küçük değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Bir kuyunun içinde bir tek balık 1 saat (p &lt;0.0001) içinde boş kuyulardan önemli ölçüde farklı bir sinyal oluşturur. 2 kuluçkadan 24 saat sonra embriyonik balıklar tarafından üretilen sinyallerin görsel temsilini sağlar Şekil. Bu resmin amacı için ...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay at JoVE.com

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K Görüntüleme.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

Video: High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biyoloji

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Bir Zebra balığı Düzenli Bakım ve Onarım (<em&gt; Br.rerio</em&gt;) Laboratuvar: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...