Yakın zamanda LCK GFP zebra balığı birçok B hücreleri GFP düşük düzeyde ifade bulundu. Bu, bu satırı T hücrelerinin yanı sıra B hücrelerini incelemek için yararlı bir araç haline getirir. Bu tekniğin en büyük avantajı, artık LCK GFP zebra balığından B ve T hücrelerini inceleyebilir veya kanserli balıklardan B-ALL ve T-ALL hücrelerini inceleyebiliriz.
Bu yöntemler zebra balığında B hücre gelişimini ve B-ALL çalışmalarını mümkün kılmaktadır. Adaptif bağışıklık sistemini anlamak la ilgili olan ve pediatrik kanserde yaygın olan maligniteler. Eğer daha önce bu diseksiyonları hiç yapmadıysanız, iyi timus ve ilik örnekleri elde edinceye kadar tekniğinizi birkaç kez geliştirmek isteyebilirsiniz.
Görsel gösteri, izleyicilerin balıklarda akıcı ve B-ALL'ı tanımalarına ve b ve t hücrelerini izole etmek için ayıracak doğru ayarları seçmelerine yardımcı olur. Balık sistemi suyunda %0.02 Tricaine ile anestezi yaptıktan sonra, dorsal kavitenin dorsal medial kısmında floresan timi için iki ila altı aylık zebra balıklarını incelemek için bir epifloresan mikroskobundaki GFP filtresini kullanın. Timus bir Petri kabında ötenazi balık yer ve GFP pozitif timi kaldırmak için floresan mikroskop kullanın yerini sonra.
Ve brightfield mikroskobu böbrek iliği ve dalak hasat için ayarlar. Toplanan her organı 500 mikrolitre soğuk sıralama ortamı içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerindeki dokuları homojenize etmek için bir havaneli mikrotüp homogenizer kullanın. Daha sonra, homojenize edilmiş dokuyu 35 mikrometrelik bir kafes filtresinden geçirerek tek bir hücre süspansiyonu oluşturup hücreleri buza yerleştirin.
İki ila dört ay dan itibaren çift-transgenik rag2 ekran için bir floresan mikroskop kullanın:hMYC LCK EGFP balık parlak T hücreli akut lenfoblastik lösemi veya T-ALL ve dim B-ALL hayvanları tanımlamak için yüksek maruz kalma ayarlarını belirlemek için düşük pozlama ayarlarını kullanarak. Yabani tip kontrol ve pre-lösemik balıklar GFP sadece timus lokalize var. Basit bir üç kategori sistemi kullanarak GFP floresan derecesine göre balık kategorize.
Birinci seviye balıklar, sadece sınırlı lokal yayılımı olan timik tümör olarak floresan sinyali gösterirler. Seviye iki balık timus ötesinde vücudun az% 50 içeren bir floresan sinyal göstermektedir. Ve üçüncü seviye balıklar vücudun %50'sinin ötesine uzanan floresan sinyali gösteriyor.
Tüm ile balık ayırın kanser olmayan. Ve yeni ALL gelişimi için bir kez aylık GFP pozitif tümörler olmadan pre-lösemik balık izlemek. T veya B-ALL hücre izolasyonu için bir ötanazi seviyesi üç balık baş ve timik bölge kaldırmak ve bir petri kabına vücut yerleştirmek için bir jilet kullanın.
Beş mililitrelik bir tüp içinde hücreleri ve orta toplama, soğuk sıralama orta 500 mikrolitre ile balık periton boşluğu yıkamak için bir P-1000 pipet kullanın. Taze bir pipet ucu kullanarak vücut boşluğuna soğuk sıralama ortamının 2 ila üç ila 300 mikrolitre hacimleri enjekte edin ve beş mililitrelik tüp içine vücut boşluğundan hücreleri dışarı çıkarmak için balık vücuduna nazik basınç uygulamak için pipet ucunu kullanın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 35 mikrolitrelik bir örgü filtresi ile süzün.
Ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edene kadar buzun üzerine yerleştirin. Tüm vücut homojenizasyon için balık vücut homojenize ve tüp için soğuk sıralama orta ek 300 mikrolitre eklemek için bir havaneli mikrotüp homogenizer kullanın. Hücre süspansiyonuna 35 mikrometrelik bir örgü filtre den filtre uygulayın ve filtreyi yalnızca doku enkazı filtrede kalana kadar gerektiğinde ek sıralama ortamıyla yıka.
Daha sonra, analizleri bitene kadar hücreleri buza yerleştirin. Yalıtılmış hücrelerin akış sitometrik analizi için akış sitometre parametrelerini üreticinin yönergelerine göre ayarlayın. Ve lenfosit ve ata hücre kapılarını tanımlamak için ileri dağılım ve yan dağılım parametrelerini ayarlamak ve hücresel enkaz dışlamak için 10, 000-50, 000 olay elde.
Hücre doublets hariç ve gfp pozitif hücrelerin sayısını ve yüzdesini belirlemek için lenfoid ve / veya öncü kapıları kullanın. Phycoerythrin ve GFP yoğunlukları kullanarak GFP negatif karşı GFP düşük karşı GFP yüksek hücreleri için kapıları tanımlar. GFP düşük ve GFP yüksek hücreleri izole etmek için kapıları nerede yerleştirmek için öğrenme saf B ve T hücre popülasyonları elde etmek için önemlidir.
İki farklı GFP pozitif popülasyon, GFP düşük B hücreleri ve GFP yüksek T hücreleri timus elde edilebilir. Üç aylık zebra balığının böbrek iliğinde bulunan B hücreleri düşük düzeyde GFP ifade eder. GFP yüksek hücreleri ancak nadirdir, T lenfositlerin sadece küçük bir yüzdesi üç aylıkken ilik mevcut olduğunu gösteren.
Aynı şekilde, dalak örnekleri GFP yüksek hücrelere göre düşük GFP daha yüksek yüzdeleri göstermektedir. Henüz akut lenfoblastik lösemi gelişmemiş çift transgenik balıklarda timus, ilik ve dalaktaki GFP ekspresyonu tek transgenik LCK EGFP balıklarında görülene benzer. Ancak, organ başına lenfosit lerin sayısı artar.
Muhtemelen, rag2 organizatörü aktif olduğu olgunlaşmamış B ve T hücre popülasyonlarının MYC tahrik genişleme nedeniyle. B ve T-ALL ile çift transgenik balık altı ay b-ALL çoğunlukla GFP düşük hücreleri içeren loş floresan kanserler geliştirdik. Buna karşılık, parlak floresan balık ya izole T-ALL veya GFP düşük B-ALL ve GFP yüksek T-ALL hücrelerinin karışık popülasyonları barındırabilir.
Nitekim, kantitatif polimeraz zincir reaksiyon analizi GFP düşük hücreleri tarafından değerlendirildiği gibi B hücre transkript yüksek düzeyde ifade. Ve GFP yüksek hücreleri T hücre genleri, LCK ve GFP belirteci yüksek düzeyde ifade. Bu mikroskop ile B-ALL ile balık tanıma öğrenmek için önemlidir.
Ve nasıl düzgün GFP düşük ve GFP yüksek nüfus ayırmak için akış sitometri kapıları tanımlamak için. Bu prosedürü takiben, DNA, RNA veya proteini GFP düşük ve GFP yüksek hücrelerinden PCR, sıralama, kanda veya in vivo transplantasyon deneylerinde ne varsa izole edebilirsiniz. LCK GFB balıklarının T hücrelerine ek olarak floresan B hücrelerine sahip olduğunu öğrendikten sonra b ve T-ALL'ı değerlendirmek için aynı hayvandan her iki hücre tipini de inceleyebiliriz.
