Bu çalışma dan JLRR hibe ile desteklenmiştir: Otizm Konuşuyor, Nina İrlanda, Weston Havens Vakfı, NIMH R01 MH081880 ve NIMH R37 MH049428. Prw Tayvan Ulusal Bilim Konseyi bir burs ile desteklenmiştir. SFS F32 (MH103003) tarafından desteklenmiştir.

Etik deyimi: Aşağıdaki prosedürleri kurum ve hayvan protokolü tarafından onaylanmıştır. Deneyler başlamadan önce hayatta kalma ameliyatları ile ilgili tüm işlemler için onay almak için emin olun ve tüm protokolleri güncel olduğunu doğrulamak. 1. lentivirüs Hazırlık (İsteğe bağlı Adım) <ol><li> 10 ml DMEM /% 10 FBS varlığında yapılabilir her lentivirüs için HEK293T hücrelerinin üç adet 10 cm&#39;lik tabak bölünmüş, ve •% 60-70 ortak akışa kadar büyümeye. % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde hücreler büyür. </li><li> 1.2 ug pMD2.G (VSV-G kodlayan) 1,2 (Tablo 1 &#39;de verilen DNA vektörü sekansı), 6.4 ug CAG-Flex-GFP lentiviral vektör, aşağıdaki herhangi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak her plaka, DNA plazmidleri (10 ug toplam) transfekte ug pRSV-Rev, ve 1.2 ug pMDLg / pRRE. Üç Lentiviral ambalaj vektörler piyasada mevcuttur (Tablo Not: Bu özel yaklaşım 3. nesil lentivir kullanırEl vektörleri ama 2. nesil vektörleri ve ilişkili plazmidler de çalışacaktır. </li><li> Temas veya lentivirüs içeren herhangi bir çözüm veya cihazları etkisiz hale getirmek için bir BSL2 sertifikalı kaput içinde% 10 çamaşır suyu çözeltisi içeren bir atık kabı hazırlayın. Sonraki tamamen, çamaşır suyu çözeltisi içine transfeksiyondan sonra Ortam 4-6 saat kaldırmak, yeni medyanın aynı hacimde ile değiştirin, ve hücrelerin büyümesine izin verir. </li><li> 15 dakika herhangi bir hücre yıkıntıları pelet haline getirildi için 4 gün sonra, 1000 x g&#39;de 50 ml konik tüp ve santrifüj Ortamı toplar. Daha sonra, bir 0.45 um membrandan filtre süpernatan. Herhangi bir düşük protein bağlama filtre, PVDF gibi, iyi çalışıyor. Dikkat: çamaşır suyu çözeltisi içine yer hem katı hem de sıvı viral atık. </li><li> Yük 30 ml&#39;lik bir ultra santrifüj tüpleri içine ve bir ultra santrifüj içine süpernatan süzülmüştür. 4 ° C &#39;de 2.5 saat boyunca 100.000 x g&#39;de santrifüjleyin. Bir BSL2 kaputu santrifüj tüplerine açın ve% 10 Bleach içine süpernatant kaldırmak. Pe PBS ~ 100 ul ekle1x10 ^ 7-8 enfeksiyöz birim / ml titreleri elde edilir LLET. -80 ºC aşağıdaki gün ve mağaza bölmeyin. Lentivirüs alikotları, en az altı ay boyunca -80 ° C &#39;de stabildir. </li><li> Önemli düşünce: Birçok kurum artık viral çekirdeğe sahip. En iyi sonuçlar için 1x10 7 enfeksiyöz birim / ml &#39;lik bir en az titresi, konsantre virüs elde edin. </li></ol> MGE Diseksiyon 2. Verici Fareler <ol><li> İlk olarak, ilgi Kre-ifade hattı ve bir vahşi tip (WT) fare ya da Kre-aracılı rekombinasyon sonra bir muhabir ifade edecek bir fare arasında bir zamanlanmış çiftleşme kurmak. Not: Birçok Kre-sürücü hatları transgenikler ve tutulan ve hemizigot devlet yetiştirilmektedir. Bu nedenle, embriyoların yarısı Cre transgeni içerecektir. DNA, hızlı bir şekilde Cre alel algılamak için kısa bir PCR için embriyo hazırlanabilir. İstenen genotip sadece MGE bir doku da kullanılabilir, böylece, Cre + embriyolar daha sonra hasat edilebilir. Alternatif, Cre-bağımlı haberci MGE diseksiyon ve nakli için embriyoları seçmek üzere, kullanılabilir. </li><li> E13.5 karşılık hangi gün hesaplayın. Hayvanlar akşam önce eşleşmiş olsaydı, fiş gün 0.5 olduğunu. Sipariş zamanlı gebe fareler ya da doğum sonrası (P) sahip zaman için P1 yavrular ile WT kadın donör doku E13.5 olacak gününde 1 fareler. Alternatif olarak, donör hayvanları eşleştirme önce bir hafta evinde bu çiftleşmesi kurmak. Not: E13.5 ve P1 embriyolar hem üreten eski strateji / Aynı gün yavrular güvenilir yapmak çoğu zaman zordur. </li></ol> Medya, Araçlar ve Ekipman 3. hazırlanması. <ol><li> MGE hücre preparasyonu (Tablo 2) için reaktifler ve araçları hazırlayın. <ol><li> Temiz bir yüzey hazırlayın ve yüzeyde temiz forseps, makas ve bir mikrocerrahi bıçak veya ince forseps ya (kesin doku diseksiyonu için) yerleştirin. </li><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS), Hazırlama fdiseksiyon ve dönüşüm kesme işlemleri için,% 10 fetal sığır surem (FBS) ile Dulbeco değiştirilmiş kartal ortamı (DMEM) veya. </li><li> Yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde Kuluçkalama Öncesi, 20-30 mi, DMEM /% 10 FBS. Kapak ortamının gaz değişimi ve pH dengesini sağlamak için gevşetilmiş edilmelidir. Not: Medya preinkübasyon sadece diseksiyonu başlamadan önce hazırlanabilir. </li></ol></li></ol> 4. MGE Hücresinin Hazırlanması <ol><li> Onaylanmış hayvan protokolüne göre hamile bir fare kurban ve buzla soğutulmuş HBSS içeren 10 cm&#39;lik bir petri kabına embriyolar çıkarın. </li><li> (Bir seferde birini yapın buz gibi soğuk HBSS embriyoların kalanını bırakarak) diseksiyon kapsamı kullanarak her embriyo beyin çıkarın ve sonra MGE doku kesip devam edin. Aşağıda Ayrıntılı ve Şekil 1&#39;de, MGE kaldırmak için nasıl gösteren önemli adımlar şunlardır: Not. Buna ek olarak, Şekil 2, tüm diseksiyonu gösteren bir filmprosedür. <ol><li> (Şekil 1A, A &#39;) yukarı bakacak ventral tarafı beyin yerleştirin. Not: dorsal boy yukarı bakacak olması da iyidir. İki adet üretmek için saggital düzlemi boyunca yarısında beyin kesin. Bir örnek hemisected beyin (Şekil 1B, B &#39;), dorsal (üstte korteks) beyin kapak ventral açıdan fark ve ganglionik tepe (GE) doku çevreleyen gösterilmiştir. </li><li> Bir baskın olmayan elle tutulan forseps ile yarımkürede hareketsizleştirir ederken Sonraki, bir dominant elin ile, çok ince forseps veya stabknife (Tablo 2) basılı tutun. (Hemisphere en medial yukarı dönük olmalıdır). Altta yatan GE doku (Şekil 1C ve Şekil 1C &#39;de diagrammed) ortaya dorsal ve ventral doku forseps ile ve bir bıçak bıçak açın. Not: Diseksiyon petri bazı medya Çıkarma kolay pe ise doku stabilize yapabilirsinizMGE diseksiyonu rforming. </li><li> CGE, LGE&#39;yi ve septal dokuları ayırmak için stabknife veya ince forseps ile düz kesimler olun (kırmızı ile gösterilen bkz örnek keser kesikli çizgiler, &#39;1D ve D Rakamlar). Bu kesikler herhangi bir sırada yapılabilir. Not: çevreleyen doku kesip bir &#39;kutu&#39; olarak MGE düşünün. Bunu yapmak tekrarlanabilir, böylece doku disseksiyonlarında değişkenliği azaltarak, her diseksiyon için benzer kesim yapmak yardımcı olur. </li><li> Son olarak, yan MGE açmak ve alt (beynin yan yönü neydi) keserek. Bu MGE geri kalanından MGE manto bölgesini (Şekil 1E ve 1E&#39;de atmak &#39;) kaldırır. MGE kalan yönü öncelikle ventriküler bölge ve neredeyse tüm MGE progenitör hücreleri içeren MGE, subventrikuler bölge bölümlerini içeriyor. Bu doku ile devam edin. </li></ol></li><li> Önemli düşünce: Bir petri ca altına silikon jel eklenmesiBu forseps hassas ipuçları korur ve forseps ile doku çivileme için yumuşak bir yüzey temin n mükemmel bir diseksiyon yüzeyi olarak hizmet etmektedir. </li></ol> MGE Diseksiyon için 4.3 Ek stratejiler. <ol><li> Hızlı beyin kaldırmak için makas gibi forseps kullanarak embriyo cilt kesin. Embriyo yan bırakır gibi, doku demirlemek için kullanılan forseps ile baş dibinde doku tutun. İlk olarak, beyne beyne ve posterior ventral anterior ventral kesmek, ve sonra embriyonun kenarı boyunca iki kesim bağlayın. Sonra cilt kapağı kapmak ve beynin üstünden çekin. Beyin sonra hızla geriye kalan dokudan uzak disseke edilebilir. </li><li> Alternatif olarak, korteks arkasında bütün beynin posterior yönünü çapa. Bu arada, korteks en dorsal kaudal yönü her yarımkürede kavramak ve anterior yönde uzak demirlemiş dokudan korteksi gözyaşı. Bu şekilde, her iki Cortices çıkarılabilir ve ikili ganglion eminences hala orta yanal anatomisinin koruyucu dokunun geri kalanına bağlanmış, ortaya çıkar. </li><li> Delinmeye bıçak Switch, her yarımkürede MGE çevresindeki hassas kesimler yapmak. MGE veya büyük bir ucu olan bir pipet (yani., P1000) toplamak için forseps ayrı bir temiz seti kullanın. Not: MGE tahsil edildiğinde bazı medya kaçınılmaz transfer olarak, tüm diğer Diseke malzemeden uzak toplanan doku tutun. </li><li> MGE toplamak ve DMEM /% 10 FBS (500 ul kadar bir hacim MGES toplamak için yeterlidir) ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine doku koydu. Aynı toplama tüpüne diğer yarımkürede ve yer tekrarlayın. Tüm doku toplanır kadar buz üzerinde örneklerin tutun. </li></ol> 5. Lentiviral etiketleme ve Transplantasyon <ol><li> Bir BSL2 sertifikalı kaput içine MGE doku tüpleri taşıyın ve ortamı çıkarın. Not:MGE doku gözle görünür olmasını ve soğuk medya kolayca ve nazikçe kaldırılır olması için izin tüpün dibine razı olacak kadar büyük. </li><li> , DMEM /% 10 FBS ortamı ~ 500 ul ekle, bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde önceden inkübe edildi. Daha sonra, 8 ug / ml lik bir nihai konsantrasyonda her bir tüpe transdüksiyonunu kolaylaştırmak için polybrene ekleyin. P1000 pipet kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için MGE doku çiğnemek. Son olarak, her tüpe ~ konsantre lentivirüs 15-20 ul ekle. </li><li> Önemli değerlendirme: 10-12 kez bir toz haline getirme, tek bir embriyodan MGE doku parçalanması için yeterli olmakla birlikte, çok sayıda MGES bir araya toplanmış ise daha fazla toz haline getirilmesini gerekebilir. En iyi olanı belirlemek için farklı trituration koşullarını deneyin. </li><li> Güvenli bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir yerde daha karıştırmak için ters, tüm tüpler her tüp kapatın. En az 30 dakika ve 1 saat kadar lentivirüs hücreleri inkübe edin. Daha uzun kez de sonuçlandıkıvrımlı hücre canlılığı. Süre doluncaya kadar boruları her 10 dakikada bir ters çevirin. </li><li> Lentivirüs ile kuluçkalamadan sonra, hücreler topak haline getirilip, 3 dakika süreyle ~ 700 x g kuvöz ve santrifüj tüpleri çıkarın. BSL2 kaput, süpernatant kaldırmak ve% 10 çamaşır suyu içine atın. Daha sonra, 1 ml DMEM /% 10 FBS ekleyin ve daha sonra, yıkama, hücreleri topaklamak üzere aynı hızda yeniden santrifüj ile pelet 2-3 kez çiğnemek. Aşırı virüs kaldırmak için bu yıkama-adımı 2-3 kez daha tekrarlayın. Not: Kısa spin oda sıcaklığında gerçekleştirildiğinde, 4 ° C&#39;de santrifüj adımları Bununla birlikte, indirgenmiş canlılığı gözlenmemiştir. </li><li> Son yıkamadan sonra, mümkün olduğu kadar çok ortamını çıkarın ve buz üzerinde her tüp koydu. Nedeniyle tüp yanlarındaki artık medyaya, ~ medya 2-3 ul nakli prosedürü başladı zaman hücre pelet kapsayan sona erecek. </li></ol> 6. Nakli ve Doğrulama <ol><li> Ev sahibi P1 yavrular Edinme ve prosedürü hazırlamak% 70 etanol ile aşağı püskürtülerek alan. İşlem sırasında sterilite korumak için bir özel, temiz işlem odasında bu işlemleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Buna ek olarak, kullanmak ya da otoklavlanmış cerrahi aletler yavruların% 70 etanol ile temas halinde olacak yüzeylere sterilize edin. Nakli ve temsili prosedür alanı yapmak için gerekli olan temsili ekipmanın bir örneği, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li></ol> Not: Bu yordam bir küçük hacimli enjeksiyon, değil bir kesi, açık yara ya da sütür gerektirecek bir cerrahi işlem olmasına rağmen, hala her fare enjekte edilecek yeni bir mikropipet kullanılması tavsiye edilir. mikropipetler çekilmiş ve% 70 etanol, kapalı bir kap içinde depolanan püskürtüldü bir yüzey üzerinde eğimli zaman ısıyla sterilize edilmiş bulunmaktadır. <ol><li> 40-80 um arasında ucunda bir çapa sahip mikropipetler oluşturur. Bu boyutlar ardından optimum verecekSonuçlar. Isı çekildiğinde mikropipetler sterilize ve bir yüzey üzerinde kesik ve kapalı bir kapta mikropipetler saklamadan önce% 70 etanol ile sprey. Not: (Tablo 2), bu iğneler oluşturmak için gereken cihazlara erişimi sınırlama Alternatif olarak, başka bir enjeksiyon cihazı kullanın. Bununla birlikte, bu değişik çaplarına bağlı mikropipetler gibi uygun olmayabilir. </li><li> 1 ml şırınganın içine mineral yağ çizin, ve 30 1/2 G iğne ile, mineral yağ ile tamamen cam pipet doldurun. Sonraki, piston üzerine stereotaksik cihaz ve yük cam pipet eklemek sonra, stereotaksik cihaz üzerine monte pistonu. Hidrolik sürücü kullanarak, temiz temiz bir kağıt havlu ile saçılan mineral yağ çıkarma, cam pipet içine yarısına kadar pistonu hareket ettirin. <ol><li> Alternatif olarak, bir şırınga kullanarak, mineral yağ içinde pipet arka uç daldırın ve kapiler etkiyle doldurulmuştur. Pipett hava kabarcıklarını önlemek için,e, cam pipet tamamen kadar şırınga pozitif basıncı korumak. Not: Diğer cihazlar başarıyla MGE hücreleri 14 nakli kullanılabilir. Veya daha bu prosedür için de 100 nl eserler yakın bir hacim az sunabilen herhangi bir cihaz. </li></ol></li><li> Ince noktaya içine bükülmüş köşe ince MGE hücre pelet üzerinde aşırı ortamı çıkarmak için sonraki, bir steril kağıt havlu, ya da herhangi bir emici malzeme kullanın. Bu adım, daha küçük enjeksiyon hacimleri elde edilebilir, böylece hücre yoğunluğu yoğunlaşmaktadır. Sonraki, yavaş yavaş hücre pelet hazırlamak ve bir hidrofobik yüzeye hücre süspansiyonu geçmeden önce 1-2 kez çiğnemek için (P2 tercih edilir) pipet düşük hacim kullanın. hacim hemen altında 1 ul olmalıdır. Hücre süspansiyonu içine iğne ucu hareket ettirin ve hidrolik sürücü kullanarak, pipet içine hücre süspansiyonu hazırlamak. </li><li> Hipotermi yoluyla P1 yavru uyuşturan (bir lateks eldiven sarın ve ~ buz üzerinde 2-4 dakika koymak).Bir zararlı uyaran ile anestezi etkinliği için kontrol edin. Ince forseps ile ayak parmakları arasında cilt Pinch: sıkışmak durumunda yavru tepkisiz olmalıdır. Sonraki, enjeksiyon cihazının altında bir kalıp üzerine yavru koyun, sonra kafasına cilt geri çekerek ve standart laboratuar bant ile güvence gergin cilt yapmak. Not: hipotermi yenidoğan farelerde ve düşük mortalite oranı sonuçları çok etkili iken yavrular 10 dakika altında kurtarmak için başlayacak gibi, prosedürler, çabuk yapılmalıdır. Buna ek olarak, buz üzerinde 4 dakika tolere edilebilir ne bir üst sının teşkil eder. Uzun bir zaman enjeksiyonlar için gerekli ise, sadece bir kez hipotermi ikna etmek için çalışın. Bir yavru erken kurtarır Ancak, ilk yavru tekrar tam hipotermi oluşturulmadan önce kurtarmak için izin verir. Ayrıca, sadece hipotermi bir enjeksiyonları gerçekleştirmek için daha fazla zaman neden. Yavrular hipotermi 5-10 dakika içinde iyileşir. Bu çöp ve anne ile yavrular yerleştirerek veya sıcak bir yüzeye uygulamaktadır üzerinde yavru koyarak kolaylaştırılabilirE kurtarmak için. </li><li> Bir stereotaksik cihazı kullanarak, baş yüzeyine dik, yavru kafasına yüzeyinde cam pipet ucu yerleştirin. Pipet kafası ile temas halinde olduğu zaman, &quot;0&quot; olarak düşünün. Sonraki eklemek sonra, korteks içine deri ve kafatası yüzeyi ile pipet itin ve durdurmadan önce ~ 2 kez pipet geri çekin. Mikropipet 0.1 mm&#39;lik bir derinlikte olduğu zaman neokorteks içine hücre hedefleme optimum için enjeksiyonlar yapılmaktadır. Ancak, bu kullanıcı tarafından optimize edilmelidir (aşağıdaki nota bakınız). Not: Bu derinlik güvenilir, yukarıda tarif edilen cihazları ile derin neokortikal katmanları hedef ise, birkaç derinlikleri ampirik bir şekilde tespit test edilmelidir. Buna ek olarak, farklı postero-kaudal ve iç-dış pozisyonda derinliklerinde bir dizi her yerinde en iyi ne derinlik belirlemek için test edilmelidir. Neokorteks içine yavaş nüfuz c yeteneği azalır olarak da, ilk delinme, hızlı olmalıleanly dokuya nüfuz. Birinci en iyi olanı bulmak için bu prosedürü başlatırken farklı hızlarda deneyin. Boyalar pozisyon belirtmek için güvenilmez olmuştur Buna ek olarak, test koordinatlar için, etiketli hücreleri kullanarak gerçek yerini yoktur. </li><li> İğne pozisyonunda sonra, korteks içine hücre süspansiyonu bir dizi hacmi iterek, cam pipet içine pistonu ilerlemek için hidrolik cihazı döndürün. Site başına 50-70 NLS enjekte edilir. Gol neokorteksin boyunca hücrelerin geniş bir dağılım elde etmek ise farklı rostral-kaudal seviyelerde 3-6 farklı sitelerde bu işlemi tekrarlayın. Not: 100 nl veya daha büyük birimler lezyonlara neden ve verimli bir şekilde enjeksiyon yerinde dışarı göç başarısız enjekte edilen hücrelerin büyük topaklar yol açabilir. Böylece, küçük enjeksiyon hacimleri (~ 70 nl veya daha az) zaman yeterse daha fazla siteler üzerinde, optimal. </li><li> Enjeksiyonlar tamamlandığında, ayak kırpma s tanımlamak için güvenilir bir yoludur (aşamasından yavru çıkarmak ve onu işaretleyinups sonra). Yavru kurtarıldı ve kendi başına hareket edebilir sonra, anne ve çöp ile geri koymak (bu aşamada onları kaldırma dakika içinde ortaya çıkar). Not: Bu minimal invaziv bir işlem olduğundan yavru serbestçe hareket ve ısıtılır sonra hiçbir cerrahi sonrası prosedürler vardır. Ancak, yavrular sadece prosedür değil, aynı zamanda sağlamak için ertesi gün sonra onlar sağlığı bozulan emaresi var kontrol edilmelidir. </li><li> Bir sonraki yavru prosedürü başlamadan önce, steril çalışma alanı korumak için% 70 etanol ile bölgeyi sprey. Enjekte yavrular geliştirmek ve daha sonra uygun gelişim aşamasında (ler) de doku değerlendirmek için izin verin. </li></ol>

<ol>
	<li>Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GABA+innervation+in+the+cerebral+and+cerebellar+cortices.">Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).</li><li>Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+of+autism:+increased+ratio+of+excitation/inhibition+in+key+neural+systems.">Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems.</a> Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).</li><li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+migration+from+basal+forebrain+to+neocortex:+dependence+on+Dlx+genes.">Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes.</a> Science. 278 (5337), 474-476 (1997).</li><li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons.">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).</li><li>Gelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wide+Diversity+of+Cortical+GABAergic+Interneurons+Derives+from+the+Embryonic+Preoptic+Area.">A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area.</a> J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).</li><li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons.">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).</li><li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network.">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).</li><li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Bias+in+the+Mitotic+Origins+of+Somatostatin.">Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin.</a> and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resource+of+Cre+Driver+Lines+for+Genetic+Targeting+of+GABAergic+Neurons+in+Cerebral+Cortex.">A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622 (2014).</li><li>Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+progenitors+grafted+into+the+adult+epileptic+brain+control+seizures+and+abnormal.">GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).</li><li>Braz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain.">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li><li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position.">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li><li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain.">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).</li><li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6.">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li><li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons.">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition.">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li><li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+&#8220;MGE+Enhancers&#8221;+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Progenitors+and+Neurons.">Use of &#8220;MGE Enhancers&#8221; for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).</li><li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex.">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hücre bazlı tedaviler için embriyonik ganglion eminences (GEs) den GABAerjik kortikal interneuron öncülerinin kullanımı birçok koşulları 12 -1 4 için umut gösteriyor. Hassas moleküler teknikler etiket ve belirli interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için ihtiyaç vardır. Burada transplantasyonundan önce lentivirüsler embriyonik MGE hücrelerin etiketlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar ve bu yöntem, in vivo analiz için özel kortikal interneuron alt ilgi genleri ifade...

Dinlenme, glutamaterjik temel nöronlar uyarıcı karşılık ise GABAerjik kortikal internöron, memeli neokorteks nöronların ~% 20-30 içermektedir. Internöron elektrofizyolojik özellikleri, akson ve dendrit morfolojisi ve 1 hedefleme sinaptik oldukça çeşitlidir, ve uyarıcı / inhibitör tonda dengesizlikler otizm, şizofreni ve epilepsi gibi nörolojik 2 / nöropsikiyatrik bozuklukların bazı fenotipleri altında yatan varsayılmaktadır. Burada açıklanan protokol genel amacı verimli genetik in vivo analizler için transplantasyon öncesi GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır değiştirmek için bir araç sağlamaktır. Kortikal GABAerjik internöron medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve sırasıyla CGE) 3,4 yanı sıra preoptik alanda 5 doğarlar. Kortikal interneuron atalarıdır uzun mesafe teğet göç takip geçmesiradyal göç ederek nihai hedeflerine ulaşmak için. Hedeflerine varışta, bu kortikal internöron doğru mevcut nöronal ağ içine entegre olmalı, ve her benzersiz interneuron alt grup belirli şekillerde kortikal devre katkıda bulunacaktır. Dört ana alt gruplar moleküler belirteçlerin tarafından ayırt edilebilir: MGE-türetilmiş somatostatin (SST) + ve parvalbumin (PV) + alt gruplar ve CGE-türetilmiş vazoaktif intestinal peptid (VIP) + ve Reelin +; SST - alt grupları 6. Farklı kortikal interneuron alt grupları MGE ve CGE 7, 8 embriyonik gelişimi sırasında değişik zamanlarda doğar. Bu ve diğer kortikal GABAerjik interneuron işaretleri bu alt 9-11 çok özel Cre sürücü soyları meydana getirmek için kullanıldı. MGE progenitörlerin nakli dengesizliklerinin neden olabilir bozuklukları tedavi etmek için potansiyel bir hücre bazlı terapi olarak ortaya çıkmıştır12-24 uyarma / inhibisyonu. Bunlar, tedavi edici yararları çok peri-somatik önleyici PV + hücreleri MGE elde edilir (ayırt etmek ve bir konakçı beyin entegre dağıtmak için), ya da potansiyel nedeniyle MGE progenitörlerinin eşsiz kabiliyetlerine bağlı olabilir. MGE hücreleri aynı zamanda genetik olarak in vitro olarak modifiye edilmiş hücreler, in vivo olarak incelenmesi gereken sağlayan hızlı ve verimli bir şekilde nakli 15 önce lentivirüsler ile transduse olabilir. Bu yaklaşım geliştirmek için gerekçe GABAerjik kortikal interneuron gelişimini ve olgunlaşmasını okuyan barikatlar üstesinden oldu. Özellikle, MGE transplantasyonu mutant fare başka türlü erken zaman noktasında öldü ne zaman araştırmacılar, in vivo, mutant hücrelerinin gelişimini çalışmalarına izin vermiştir. Ayrıca, transplantasyon öncesinde ilgi genlerin katılmasıyla, bir mutant fenotipe spesifik genlerin etkileri, eff olarak değerlendirilebiliricient şekilde. Burada, biz transplantasyon öncesinde lentivirüsler MGE hücreleri nakletmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, bu teknik, Kre-bağlı sentezleme lentivirüsler ve veriler Cre sürücü fare hatları bir kombinasyonu kullanılarak, kortikal interneuron ön ait heterojen bir gruba belirli interneuron alt ilgi konusu bir geni ifade etmek üzere adapte edilebilir göstermektedir. Genetik benzersiz bir şekilde in vivo çalışmalar için GABAerjik kortikal interneuron öncülerini değiştirmek Üstelik, bu protokol teknikleri ve araştırmacılar için bir platform sunuyor. Diğer güncel yaklaşımlar üzerinde bu tekniğin bir avantajı nakledilen MGE hücreleri uzak enjeksiyon yerinde dağıtmak olacaktır. Ayrıca, fokal, viral enjeksiyondan farklı MGE hücreleri dağıtmak sonra morfoloji değerlendirmek kolaydır. Bu yaklaşım, belirli bir hücre tipi sokulması, vahşi tip veya mutant hücrelerine ilgi genleri verme etkisini incelemek için kullanılabilirmuhabir in vivo hastalık alel etkisini incelemek için potansiyel morfoloji değerlendirmek, ya da.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents and equipment for MGE cell transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>REF 309602</td>
			<td colspan="2">BD, Becton Dickinson and company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301/2 gauge needle</td>
			<td>305106</td>
			<td colspan="2">BD, Becton Dickinson and company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision bore to deliver 5 &#181;l (comes with plunger)</td>
			<td>5-000-1005</td>
			<td colspan="2">Drummond scientific company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td colspan="2">Polysciences, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with boomstand **</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital just for mice stereotaxic instrument **</td>
			<td>51725D</td>
			<td colspan="2">Stoelting company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond coated rotary beveler</td>
			<td>n.a.</td>
			<td colspan="2">made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pipette puller</td>
			<td>730</td>
			<td colspan="2">Kopf instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>n.a.</td>
			<td colspan="2">Any drug store or pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Any pipette and tips that can reliaby measure 1 &#181;l of volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">** These are the particular models we use, but many other setups should work</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional Reagents (for making Lentiviruses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm, 0.45 &#181;m filter</td>
			<td>09-719B</td>
			<td colspan="2">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)</td>
			<td>344058</td>
			<td colspan="2">Beckman Coulter&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)</td>
			<td>11668019</td>
			<td colspan="2">Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other commercially available supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol</td>
			<td>12251</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev plasmid encoding Rev</td>
			<td>12253</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G plasmid encoding VSVG</td>
			<td>12259</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-Flex-GFP</td>
			<td>28304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral-mediated labeling and transplantation of medial ganglionic eminence (mge) cells for in vivo studies

Embriyonik medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve CGE) türetilen GABAerjik kortikal internöron, işlevsel ve morfolojik çeşitlidir. Yayılmakta farklı kortikal interneuron alt rollerini anlamada yapılmış, ancak, GABA farklı hücre tiplerinin gelişmesi ve olgunlaşması için katkıda bulunabilir çalışılması gerektiğini hala birçok mekanizma vardır. Ayrıca, değiştirilmiş GABA sinyal, otizm, şizofreni ve epilepsi fenotipleri katkıda bulunabilir. Spesifik Kre-sürücü hatları eşsiz interneuron alt fonksiyonlarını dışarı parsel başladı. Fare modellerinde ilerlemelere rağmen, verimli in vivo moleküler yaklaşımlar GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır çalışma genellikle zordur. Bu hücrelerin hücre özerk programlama incelemek için kullanılan önemli bir tekniktir konak korteks içine MGE hücrelerinin nakli olduğunu. Bu nakledilen hücrelerin ayırt, yoğun göç, birnd işlevsel entegre. Buna ek olarak, MGE hücreleri verimli bir şekilde moleküler yaklaşımlar çok sayıda imkan veren, transplantasyondan hemen önce lentivirüs ile transduse edilebilir. Burada mevcut Kre-sürücü hatları ve Kre-bağımlı ifade vektörleri kullanılarak, detay verimli in vivo analiz için transplantasyon öncesi MGE hücreleri nakletmek için bir protokol biz. Bu, in vivo olarak daha büyük bir hücre türüne özgü çözünürlüğe izin verecek şekilde nakli sonrası dağıtmak için bu hücrelerin yeteneği ile kesin genetik işleme birleştirir, bu yaklaşım, avantaj sağlamaktadır.

MGE hücreleri göç ve bir konak neokorteks 16 nakledilen zaman entegre benzersiz yeteneği olduğundan, onlar vivo çalışmalar öncesi genetik manipülasyon için mükemmel bir model sistemi sağlar. Burada, tek bir E 13.5 embriyolardan MGE doku izole nasıl kullanılabileceğini gösterir (Şekil 1 ve 2), daha sonra in vitro veya in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce hızlı bir şekilde ya da lentivirüs ile transduse edilebilir. Lentivirüsle...

Watch this Scientific Journal Video about Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies at JoVE.com

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor.

Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Çalışmalar

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

11.4K Görüntüleme.  University of California San Francisco.  GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor. 

Video: Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Gelişim Biyolojisi

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...