Bu iş F Yull ve Gazi İşleri Bakanlığı (TS Blackwell) verilir NIH hibe CA113734 tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan deneyleri Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Transgenik Fare hazırlanması <ol><li> NGL (N-KB&#39;yi F-G-L uciferase FP) raportör transgeni (daha önce tarif 1) için pozitif dişi fareler, bu işlem için kullanılır. Kadın yaşı en az 6 hafta olduğunda, bir FVB vahşi tip erkek ile çiftleşir. Yetiştiriciliği (1 erkek ile bir kafese 4 kadın) kullanılabilir Harem. (Lütfen dikkat:. FVB ırkı fareler gibi C57Bl6 gibi Koyu ırkı fareler de kullanılıyor olabilir mevcut çalışma için kullanılan, ancak bu farelerin önceden görüntüleme için traş olması gerekir). </li><li> 15 gün sonrası çiftleşme başlayarak, gebelik belirtileri (büyük çıkıntılı çevresi) için düzenli dişiler kontrol edin. Her kadın bir kez gebe ayrılmış ve son dişi gebe kalmaz ve bir kez erkek üreme kafesten çıkarılmalıdır. </li><li> Bir ayrılmış kadın izled bir çöp görünen doğum tarihini not edin. En az 6 yavruların bir çöp yeterli laktasyon için gereklidir. Çöp doğumdan sonra sekiz gün, protokolü (zaman çizelgesi şeması için Şekil 1&#39;e bakınız) devam edin. </li></ol> 2. Enjeksiyon için Hazırlık <ol><li> E. eritin 0.1 ug / ul nihai konsantrasyonu PBS içinde coli LPS. Bu çözelti, ya da 5 mcg bir toplam 50 ul, meme bezi içine enjekte edilecektir. Kontrol enjeksiyon için kullanılacak PBS tek başına ikinci bir tüp hazırlanır. </li><li> Diseksiyon kapsamı ve izofluran anestezisi ekipmanları Set-up. Bir burun-koni cihaz fare yer alacak kesme kapsamı aşama için güvenli olmalıdır. İyi bir ışık kaynağı, kapsam kendisinden veya ilave ışıklarından olup olmadığını da hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Kurulum tamamlandıktan sonra, izofluran makine ve hava akışını başlatmak. </li></ol> 3. LPS Intradüktal Enjeksiyon <ol><li> LPS çözeltisi 50 ul ile kısa bir iğne enjektör yerleştirin. Kenara ayarla. </li><li> İlk kez solunum yavaşlar sonra izofluran dolu kutuya kadın yerleştirerek ve enjekte edilmesi için fareyi uyuştur, sahneye çıktığı taşımak ve burun konisi içinde burnunu yerleştirin. Fare tamamen uyuşturulduktan onaylamak için bir ayak tutam kullanın. Prosedür boyunca farenin solunum izleyin ve buna göre izofluran seviyesini ayarlayın. Baraj işlemden sonra iade edilebilir kadar dişi alınmış olduğunu yavruların çöp içeren kafesi dikkatle ayırmak gerekmektedir. </li><li> Kat düz koymak yapmak ve farenin alt karın sağ 4. inguinal meme bezi bağlı meme görselleştirmek yardımcı olmak için% 70 etanol küçük bir damla kullanın. </li><li> Meme optimal bir görünüm için diseksiyon kapsamı odaklanın. Dikkatlice daha uzakta deriden meme dışarı çekmek için ince forseps bir dizi kullanabilirsiniz, ancak ponksiyon yok veya herhangi bir şekilde meme yaralayabilir.forseps sıkı doku işlenirken birlikte kenetlenmiş, ancak meme üzerinde stres az miktarda gerektiren bir ışık tutmak ile asla kullanılmamalıdır. </li><li> Yavaşça yerine meme tutmak için sol elinde forseps kullanın. Yavaşça sağ ellerini kullanarak görüş alanı içine önceden yüklenmiş şırınga getirmek. Şırınga hiçbir konumlandırılması içeriği enjekte etmek için ortaya sahip olacak şekilde düzenlenmelidir. </li><li> Bir kez şırınga görünümünde olan, meme merkezi içinde küçük duktus açıklığının dikkatle hedefliyoruz ve şırınga takın. </li><li> El konumlandırılması olmadan, şırınga içeriği enjekte ve meme gelen iğne çıkarılır. </li><li> Kontrol enjeksiyon için 50 ul PBS ile ikinci bir şırınga yerleştirin. Sahnede ve fare alt karın diğer tarafta sol 4. inguinal meme bezi meme en iyi görünüm için fare yerleştirin. PBS-yüklü şırınga kullanarak adımları 3,4-3,7 tekrarlayın. </li><li> Hem enjeksiyonlar compl olunca, ETE anestezi kesilmeli ve bir kurtarma kafes için fareyi hareket ettirin. O 5 dakika içinde mobil hale sigortalamak için dişi izleyin. Fare, 1 saat boyunca kurtarma kafes kalmasını sağlayın. Kurtarma 1 saat sonra, yavrular onun çöp ile kafese kadın geri yerleştirin. Görüntüleme geçmeden önce Fare aralıklarla 6 saat sonrası enjeksiyon için izlenmelidir. Bizim deneyim, hiçbir olumsuz sonuçlara enjeksiyon ve görüntüleme arasındaki dönemde kadın ya da yavrular da kaydedildi. Distres belirtileri (ısırma veya enjeksiyon yerinde, genel uyuşukluk koruyan, örneğin kambur duruş) ya da yavrular (herhangi bir hareket, deri mavimsi renk) kadın gözlenen Ancak, deney kesilmelidir. </li></ol> 4. Bioluminescent Görüntüleme NF-KB Aktivite Visualize&#39;a <ol><li> Sonra farelerin görüntüleme tesisine taşınmıştır, yazılımını açmadan ve makine başlatılırken tarafından görüntüleme işlemi başlar. Olduğunu açınanestezi kutusu ve görüntüleme odasının hem akan sağlayarak oflurane makinesi ve hava akışı. </li><li> Net anestezi kutusunda izofluran anestezisi altında fare yerleştirin. Solunum yavaşladı sonra, fare tamamen uyuşturulduktan onaylamak için bir ayak tutam kullanın. Sonra steril bir şırınga kullanarak retroorbital enjeksiyonu 5 tarafından fare içine luciferase substrat 100 ul enjekte. </li><li> Hemen görüntüleme odasına fare aktarmak ve orada bulunan burun konisi izofluran altında burnunu yerleştirin. Fare sırt üstü yatar olmalıdır. Bant ile sahneye her ayak sabitleyin. </li><li> IVIS yazılım Girdi uygun ayarları bir beyaz ışık fotoğrafik görüntü ve bioluminescent faaliyetin bir görüntü hem de almak. Pozlama süresi 10 saniye olmalıdır. Görüntü elde edin. </li><li> Sonra görüntüleri elde edilmiştir, fare kurtarmak için izin ve sonra onu yavruların kafeste onu geri koyun ve periyodik izlenmesi. </li><li> Fotoğrafik ve Işıklıgörüntüler otomatik olarak bindirilmiş ve Şekil 2&#39;deki gibi, ekranda görüntülenir. Farenin alt karın bölgesinin her iki tarafında (PBS-enjekte bezi üzerinde bir ve LPS enjekte bezi üzerinde bir) fazla ilgi bölgesi veya eşit büyüklükte &quot;ROI&quot; çevreler koyarak elde edilen görüntü analiz. Fotonlardan okuması ayarlayın. Bir dizi (Şekil 2B), her bir ROI içinde tespit ışıldama gösteren görüntülenir. İstatistiksel analizde bu numarayı kullanın. </li><li> Optimum görüntü görüntülemek için, daha fazla görüntülenen sinyal eşik ayarlayın. Bu toplam lüminesans okuması değiştirmez ama kontrol ve LPS-tedavili bezi arasındaki farklar arka plan sinyali çıkarın ve görselleştirmek için izin verecektir. PBS-enjekte bezinin arka sinyal çıkana kadar gösterilen lüminesans miktarını azaltın. Bu, Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi görüntü içinde hala belirgin LPS ile muamele bezinin daha yüksek sinyal bırakmak gerekir. </li><li> Additionaprotein ve RNA testleri de dahil olmak üzere l analizi, 6 post-mortem kadın toplanan meme dokusu ile tamamlanabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bu yöntemler, tefsir edilebilir sonuçlar elde etmek için, LPS (ya da PBS) bitişik doku bozulmamış bırakarak, sadece meme kanalına infüze edilmesi gerekir. Meme çevreleyen subkutan doku içine enjeksiyon yerine simüle enfeksiyon daha yaralanmadan dolayı iltihap ile sonuçlanacaktır. Tekniği öğrenirken PBS içinde seyreltilmesi tripan mavi boya enjeksiyonu. Yararlı Şekil 3A PBS içinde tripan mavisi 100 ul aşılanmış bir başarıyla enjekte bezi gösterir. Gösterildiği gibi, sadece ağaç duktal enjekte edilen çözelti ile doldurulacak, ve enjeksiyon bölgesinde herhangi bir büyük hap olmalıdır. Bu bağlamda bir &quot;bolus&quot; bir meme ya duktal ağaca infüzyonu almayan meme çevresindeki doku enjekte sıvı birikmesi olduğunu. Bu shŞekil 3B kendi. Şekil 3&#39;te gösterilen uygulama enjeksiyonları emzirme günü 21 yaşında bir kadın tamamlanmıştır unutmayınız. Laktasyon yükseklik (gün 8-10, LPS akım protokolü kullanılarak enjekte edildiği aşama) sırasında, süt bol ve bu kanallar görselleştirmek ve enjeksiyon doğru olarak doldurulmuş olup olmadığını belirlemek zordur. Bu nedenle emzirme döneminde daha sonraki zaman noktalarında uygulama enjeksiyonları için daha iyidir. Bulunan meme kanalı sonuçlara LPS ile başarılı bir şekilde enjeksiyon bezi içinde NF-KB aktivitesi artmıştır. Bu IVIS görüntüleme üzerinde haberci fare içinde açık olmalıdır, ve LPS enjekte bezi (ortalama olarak, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, PBS bezi-şırınga göre önemli ölçüde daha yüksek bir lusiferaz aktivitesi (foton sayımı ile ölçülür) sahip olması, LPS bezi okur PBS kontrol sinyali, 200%). Comp gibi LPS-tedavili bezleri içinde lüminesans istatistiksel olarak anlamlı bir artışKontralateral kontrol etmek ared 4 fareler 4 bir grup tamamlanmasından rağmen elde edildi. Bir ek çalışma ayrıca E. birinin intraduktal meme enjeksiyon kullanmıştır NF-KB haberci transgenik içine coli veya LPS. Kendi çalışmalarına benzer şekilde, bu yazarlar E. sonra muhabirin aktivite 6 saat içinde önemli bir artış gördüm coli enjeksiyon 2. Önce herhangi bir manipülasyon hatta başlangıçta, görüntülü zaman beyin ve diğer karın içi organların bünye NF-KB etkinliği nedeniyle dikkat ediniz, bizim muhabir farelerin başları ve karınları sürekli bir sinyal göstermiyor. Böylece, bu sinyale bu deney ile ilgili olarak göz ardı edilmemelidir. Bariz bir sinyal görüntü okuması PBS bezinin arka plan lüminesans aza indirmek için ayarlandıktan sonra LPS enjekte meme bezi içinde kalmalıdır. Şekil 2 arka azaltılmış görüntüleri gösterir. Bezinin Başarısız enjeksiyonu olacakmeme hasar en muhtemel sonuç. Bu görüntüleme sırasında belli olacak sivri, deri düzeyinde inflamasyona neden olur. Yaralama sinyal Bu tür kanallara başarılı LPS enjeksiyonundan sonra görüldüğü gibi, bezi boyunca yayılan değil, çok güçlü ve hasar oluştu meme alanı sınırlı olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Şekil 1. Prosedür şematik. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Şekil 2. Arka azaltılmış IVIS bioluminescent görüntüleme. Temsilcisi sonuçları (A) LPS enjekte bezinin artmış lusiferaz aktivitesini gözler, görüntü Edinilmiş. (B) Image ilgi niceleyiciler bölgesi eklenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Şekil 3 Uygulama enjeksiyonu:.. Meme bezi intraduktal enjeksiyon yoluyla boya enjekte meme üzerinden teslimat doğruluğunu sınamak için, emzirme günü 21 yaşında bir fare PBS içinde seyreltilmesi tripan mavi boya 100 ul ile enjekte edildi. Kurban ardından bezi görselleştirme için ortaya çıkmıştır. (A) başarılı bir enjeksiyon ve meme de boya (B) bolus.

<ol>
	<li>Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+and+intensity+of+NF-&#954;B+activity+determine+the+severity+of+endotoxin-induced+acute+lung+injury.">Duration and intensity of NF-&#954;B activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury.</a> The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).</li><li>Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+NF-&#206;&#186;B+activity+during+Escherichia+coli-induced+mammary+gland+infection.">In vivo imaging of NF-&#206;&#186;B activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection.</a> Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).</li><li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+in+endotoxin-induced+murine+mastitis+is+strictly+dependent+on+mammary+alveolar+macrophages.">Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages.</a> Veterinary Research. 41, 10 (2010).</li><li>Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+nuclear+factor+kappaB+in+mammary+epithelium+promotes+milk+loss+during+mammary+development+and+infection.">Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection.</a> J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40, 155-160 (2011).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. (21), e2828 (2011).</li><li>Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Research. 11, R66 (2009).</li><li>Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+lipopolysaccharide-induced+mastitis+in+a+mouse+model.">Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model.</a> Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).</li><li>Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , 259-270 (2000).</li><li>Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+bovine+soluble+CD14+reduces+severity+of+experimental+Escherichia+coli+mastitis+in+mice.">Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice.</a> Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).</li><li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+neutrophils+but+not+mammary+alveolar+macrophages+in+a+murine+model+of+acute+Escherichia+coli+mastitis.">Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis.</a> Veterinary Research. 41, 53 (2010).</li><li>Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+levels+of+LPS-binding+protein+in+bovine+blood+and+milk+following+bacterial+lipopolysaccharide+challenge.">Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge.</a> Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).</li><li>Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+is+needed+to+restrict+the+invasion+of+Escherichia+coli+P4+into+mammary+gland+epithelial+cells+in+a+murine+model+of+acute+mastitis.">Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis.</a> Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).</li><li>Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe, ., Vandenabeele, T., P, ., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+in+Escherichia+coli-induced+mastitis+in+mice.">Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice.</a> Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).</li><li>Osterman, K. L., Rahm, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactation+mastitis:+bacterial+cultivation+of+breast+milk+symptoms,+treatment,+and+outcome.">Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome.</a> Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).</li><li>Sordillo, L. M., Streicher, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Gland+Immunity+and+Mastitis+Susceptibility.">Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).</li><li>Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+altered+mice+to+investigate+the+role+of+nuclear+factor-kappa+B+activation+and+cytokine+gene+expression+in+sepsis-induced+ARDS.">Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS.</a> Chest. 116, 73S-74S (1999).</li><li>Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+NF-kappaB+activation+promotes+urethane-induced+lung+carcinogenesis.">Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).</li><li>Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+signaling+in+fetal+lung+macrophages+disrupts+airway+morphogenesis.">NF-&#954;B signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis.</a> The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).</li><li>Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+IKKepsilon+regulates+energy+balance+in+obese+mice.">The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice.</a> Cell. 138, 961-975 (2009).</li><li>Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+kinase+II+triggers+cell+membrane+injury+by+inducing+complement+factor+B+gene+expression+in+the+mouse+heart.">Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada bir transgenik NF-KB muhabiri fare ve model mastit iyileştirilmiş bir enjeksiyon tekniği kullanmak, meme dokusunun iltihabı en sık bakteriyel enfeksiyon neden. Bu prosedürde en kritik adım intraduktal enjeksiyon kendisidir. Uygulamada, duktal enjeksiyon başarılı olup olmadığını genellikle açıktır. Ajanların enjeksiyonu (LPS veya PBS) sıvı hissetmeniz gerekir ve şırınga boşaltılır olarak hiçbir direniş orada küçük olmalıdır. En yaygın hatadır bezine e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Escherichia coli lipopolisakkarit (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> serotip 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 31 Gauge insülin enjektörü </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Kısa iğne </td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Kapsamı Diseksiyon </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell İzofluran, USP </td><td> Rx Elite MINRAD A.Ş. </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 görüntüleme sistemi &lt;/ Td&gt; <td> Kaliper (eski Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Luciferase enjeksiyon Şırınga </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1 cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-lusiferin Ateşböceği, sodyum tuzu monohidrat (Luciferase substrat) </td><td> Biosynth Kimya ve Biyoloji </td><td> L-8240 </td><td> 10 mg / ml &#39;ye seyreltilir </td></tr></tbody></table>

intraductal injection of lps as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an nf-&kappa;b reporter transgenic

İnsan hastalıklarının hayvan modelleri klinik öncesi modellerde müdahaleler test olarak titizlikle, sonuçta hastalığın ilerlemesi ve ilişkili mekanizmaları aşamalarında eğitim ve için gereklidir. Bu yöntemler olarak, lipopolisakkarit (LPS) bezinin meme, etkili bir modelleme mastitis, ya da iltihap yoluyla laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir yöntem açıklanmaktadır. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, bu simüle enfeksiyon sonucu olarak NF-KB lusiferaz muhabiri fare 1 bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi. Bu yöntemlerin geliştirilmesinde Nihai hedefimiz emziren genellikle kızarıklık içerir bezi, şişlik ve immün hücre infiltrasyonu 2,3 mastitis ile ilişkili enflamasyon incelemektir. Bu nedenle, biz kesi veya sipariş deri, meme veya bezin yaralama herhangi bir tür olabilir LPS tanıtmak olduğunu farkındaydılaryaklaşımın büyük olasılıkla inflamasyon okuma-out bulandırabilir zira bizim yöntemleri kullanılan olamaz. Biz de özel yapılmış elle çizilmiş pipetler veya yerde bu özel araçlar tutmak için mikromanipülatörler kullanımı gerektiren vermedi bir düz-İleri yöntemi istenen. Böylece, ticari olarak temin edilebilen insülin şırıngası kullanmak için ve sağlam bir meme meme kanalının içine enjekte ajan ile belirlenir. Bu yöntem başarılı oldu ve bize enjeksiyon işlemi tarafından örtülmektedir herhangi bir ek etki olmaksızın LPS enjeksiyonu ile ilişkili iltihaplanma incelemek için izin verdi. Buna ek olarak, bu yöntem, aynı zamanda görsel ve sayısal olarak NF-KB LPS enjekte edilen bez 4 içinde sinyalleme artış göstermek için bir NF-KB lusiferaz raportör transjenik fare ve biyolüminesans görüntüleme teknolojisi kullanılmıştır. Bu yöntemler, sonuçta olduğu gibi, emzikli meme bezinde modeli hastalığa tekniği isteyen birçok disiplinlerden araştırmacılar ilgilendirenBurada açıklanan bir dizi madde enjeksiyonu için kullanılan olabilir, ve sadece LPS ile sınırlı değildir.

Watch this Scientific Journal Video about Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-ÎºB Reporter Transgenic at JoVE.com

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&amp;kappa;B Reporter Transgenic

Burada açıklanan lipopolisakkarid meme iltihabı simüle etmek için meme, genellikle bakteriyel enfeksiyon tarafından neden olduğu bir durum ile laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir tekniktir. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, içinde lipopolisakkarit enjeksiyonu sonuçlarını bir NF-KB lusiferaz muhabiri fare bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi.

Mastitis Fare Model olarak LPS Intradüktal Enjeksiyon: Sinyal bir NF-KB Reporter Transgenik aracılığı ile görsel

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

19.1K Görüntüleme.  Vanderbilt University Medical Center. Burada açıklanan lipopolisakkarid meme iltihabı simüle etmek için meme, genellikle bakteriyel enfeksiyon tarafından neden olduğu bir durum ile laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir tekniktir. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, içinde lipopolisakkarit enjeksiyonu sonuçlarını bir NF-KB lusiferaz muhabiri fare bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi.

Video: Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Fare mesane Duvar Enjeksiyon

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Tıp

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

İndüksiyon ve fare modeli serebral derin malformasyon mikro-CT görüntüleme

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Delici cisim kaynaklı Iris neovaskülarizasyon Rubeosis Iridis bir fare modeli olarak

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Oleik asit enjeksiyon domuzlarda Akut Respiratuar Distress Sendromu için bir Model olarak

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Safra Kanalı TNBS infüzyonu ile Kronik Pankreatit için Bir Fare Modeli

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...