Bu protokol, genotip, fenotip ve ilaç yanıtı çalışmaları için uygun, tekrarlanabilir, immünokompetan PDAC in vivo modelleri sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, deneyin tekrarlanabilirliğini korurken, sinjenik bir biyolojik tümör mikroçevresi ile tümör ilerlemesini araştırmaya yardımcı olma yeteneğidir. Prosedürü gösteren, her ikisi de laboratuvarımızdan olan Stefanie Barthel ve Chiara Falcomata olacaktır.
Bir T75 kültür şişesinde yetiştirilen pankreatik duktal adenokarsinomu veya PDAC hücrelerini fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayarak tümör hücrelerinin hazırlanmasına başlayın. Ardından, şişeden ayırmak için beş ila 10 dakika boyunca 0,5 mililitre tripsin ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce,% 10 fetal sığır serumu veya FBS ve% 0.1 penisilin streptomisin ile 10 mililitre DMEM'deki ayrılmış hücreleri tekrar askıya alın.
Hücre süspansiyonunu 200G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin. DMEM'deki hücre peletini, enjeksiyon için hücrelerin gerekli son konsantrasyonuna dayanarak, katkı maddeleri olmadan tekrar askıya alın. Neubauer Odası'nı kullanarak 10 mikrolitre hücre süspansiyonundaki hücreleri sayın ve mevcut hücrelerin sayısını hesaplayın.
Seyreltilmiş süspansiyonun bir mililitresini, gerekli son konsantrasyona göre, 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre agregasyonunu önlemek için tüpü implantasyona kadar bir rotatöre yerleştirin. PDAC hücrelerinin ortotopik implantasyonu için, fare uyurken analgosedate fareye göz kremi uygulayın.
Analgozasyonlu farenin sol lateral karın kanadını tıraş etmeden önce yeterli analgozasyonu kontrol edin. Sağ tarafta yatan fareyi steril bir ısıtma paspasına yerleştirin ve bacakları yüzeye bantlayın. Yeni eldivenler giyin ve dezenfekte edin.
Cerrahi makas kullanarak, dalağın yansıtıldığı sol kanatta derinin ve deri altı yağ dokusunun yaklaşık bir santimetresini uzunlamasına kesin. Makas ve forseps kullanarak, peritona daha kolay erişmek için cildi peritondan ayırın. Bir santimetre uzunlamasına kesimle dalağın bulunduğu yerde peritonu açmadan önce makas çiftini değiştirin.
Dalağı ve bağlı pankreası künt, ince uçlu forseps kullanarak mobilize ederken, organların diğer dokulara bağlı olmadığından emin olun. Ayrıca, pankreası tutarken damarlara veya çevresindeki dokuya zarar vermemek için tedarik eden kan damarlarını kontrol edin. Organın kuyruğuna daha kolay erişim sağlamak için pankreası dikkatlice insizyondan çekin ve pankreası takip eden dalağı gözlemleyin.
Enjeksiyon sırasında organın katlanmadığından ve dökülmeyi önlemek için organın kapsülünün iğne penetrasyon bölgesinde gerginlik altında tutulduğundan emin olun. Damarın delinmesi veya enjekte edilmesi riskini en aza indirmek için görünür kan damarları arasında bir pankreas dokusu parçası hedefleyin. Baskın eli kullanarak, organın kapsülüne, organın uzunlamasına eksenini takip eden 27 gauge kanül ve 50 mikrolitrelik bir şırınga ile dikkatlice nüfuz edin.
2.500 hücre içeren 20 mikrolitrelik süspansiyonu pankreasın kuyruk bölgesine enjekte ettikten sonra, tümör hücrelerinin dökülmesini önlemek için pankreası ve yerleştirilen şırıngayı yaklaşık bir dakika boyunca sabit tutun. Ardından, iğneyi enjeksiyon bölgesinden çıkarın. Daha sonra, hücrelerin dökülmesini önlemek için dokuya zarar vermeden karın içindeki organları dikkatlice yeniden düzenleyin.
Organlara bir mililitre% 0.9 sodyum klorür dökerek organ yapışmasını önleyin. Basit kesilmiş dikiş tekniğini kullanarak periton diktikten sonra, iki ila üç dokuz milimetre paslanmaz çelik yara klipsi kullanarak cildi kapatın. Daha sonra analgosedasyonu midazolam, medetomadin ve fentanil veya MMF ile, farenin vücut ağırlığına göre deri altı AFN enjeksiyonu ile antagonize edin.
İşiniz bittiğinde, fareyi uyanık ve tamamen aktif olana kadar 37 santigrat derece ısıtılmış bir odaya yerleştirin. Aktif fareyi orijinal kafesine geri yerleştirin ve kürkü, ten rengini ve aktivitesini kontrol ederek farenin sağlık durumunu izleyin ve ameliyattan üç ila dört saat sonra tekrarlayın. İmplante edilmiş farenin MRG'sinde, PDAC hücrelerinin engraftasyonu, enjekte edilen hücre sayısına ve aşılanan hücre hattının agresifliğine ve büyüme özelliklerine bağlı olarak, ameliyattan yaklaşık yedi gün sonra en erken karın palpe edildi.
Elde edilen implante farelerin sağkalımı, hücre hatlarının tümör hücresi intrinsik özelliklerine bağlı olarak değişmiştir. Başarılı pankreas içi enjeksiyonlar, fare pankreasında tam gelişmiş tümörlere yol açtı. Buna karşılık, başarısız implantasyonlar, canlı olmayan hücrelerin enjeksiyonu, implante edilen hücrelerin reddedilmesi veya yetersiz sayıda hücrenin enjeksiyonu nedeniyle pankreas tümörlerinin yokluğuna neden olmuştur.
Enjeksiyonlar sırasında herhangi bir hücreyi dökmemeye ve hücrelerin karın içine yayılmasını önlemek için çevredeki dokulara zarar vermemeye dikkat etmeyi unutmayın. Bu prosedürü takiben, klinik öncesi ilaç yanıt çalışmaları gibi in vivo çalışmalar, immünkompetan farelerde gerçekleştirilebilir, ardından tümör konakçı etkileşimlerini araştırmak için örneğin gerçekler, dizileme veya histolojik analiz yapılabilir.
