We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

<ol>
	<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoding+in+Bacteriophages.">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities.">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community.">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes.">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li><li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa.">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li><li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes.">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li><li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The bacteriophages. , (2006).</li><li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences.">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li><li>Klenk, H. -. P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules.">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li><li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses.">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li><li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+ecosystems:+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus.">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741 (2003).</li><li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+S-PM2,+a+&#8220;photosynthetic&#8221;+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains.">The genome of S-PM2, a &#8220;photosynthetic&#8221; T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li><li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses.">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li><li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains.">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li><li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes:+signature+features+and+ecological+interpretations.">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).</li><li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages.">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li><li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40:+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage.">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism.">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li><li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution.">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li><li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins.">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+for+Enterobacteria.">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+expression+of+the+P(BAD)+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter.">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li><li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles.">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van&#8217;t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TagCleaner:+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets.">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288 (2011).</li><li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli.">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002 (2009).</li><li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+for+plant+metabolomics:+reporting+MSI-compliant+studies.">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li><li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+viruses+exploit+their+host&#8217;s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation.">Marine viruses exploit their host&#8217;s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li><li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules.">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li><li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid.">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li><li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism.">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype.">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, biz varsayılan faj genlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için Phenomic yaklaşımlar sunuyoruz. Izleme teknikleri ana anabolik metabolizmasının sahip gelişmiş bir tahlil içerir, Çok-fenotip tahlil plakaları (MAP), katabolik metabolizmanın efekt ölçebilen metabolitler kurulan yöntemi, ilave olarak. Biz yüksek verimli işleme ve analiz 24 için izin bu teknolojilerden kaynaklanan büyük veri kümelerini yönetmek için ek araçlar sağladı. Son olarak, açıklamalı bir faj kapsid proteini, faj tiyoredoksin, iki farazi metabolik faj genlerinin ve ortalama deneysel yanıt karşılaştırılması yoluyla biz fenotipik eğilimler ve aykırı değerlerin belirlenmesi belirlenmesi üzerinde durularak, veri setleri ve gen sınıfları hem yorumlamak için çeşitli stratejiler öneriyorum. Belirtildiği gibi, her iki yaklaşım kantitatif ev sahibi metabolizması sadece yarısını ölçün. Herhangi bir göreli fonksiyonu yorumlamaksoruşturması kapsamında yeni proteinler, her iki yöntemle elde edilen veriler fonksiyonu kanıt sunmaları gerekmektedir. Bu mevcut yazının bir odak olmasa da, her Phenomic yönteminden veri çıkışları gibi rasgele orman ve temel bileşen analizi gibi kümeleme teknikleri odaklanmak kombinatoriyel analizlerle alınır. Ayrıca, kombine analiz kaynaklanan hipotezler sonra geleneksel genetik metodolojiler tarafından onaylanmalıdır. Son olarak, yöntemler ağır bakteriyel fizyoloji etkilenir ve bu nedenle aynı standartları izler sundu. Her iki yöntem yapılırken, düşünceler ile denediği bağımsız, klonal gruplar sağlamak için yapılması gereken; kirlenme önlenir; tek bir değişken test ediliyor; ve uygun kontroller aynı anda koştu ediliyor. Bu noktalar hesaba takdirde herhangi bir fizyolojik deneyinde benzer sonuçlar açık, neden olur. Çoklu fenotipik tahlil plakaları(MAP) MAP&#39;ler geliştirilmesi büyük bir geçiş miktarının ve mevcut teknolojilerde (Şekil 5A ve Tablo 1,2) göre adapte deneyi sağlar. Tahlil tüm mikrobiyoloji laboratuarları mevcut malzemeleri, teçhizat, ve temel teknikleri kullanır. sonraki veri işleme ve analiz için bir hesaplama boru hattının eklenmesi, PMAnalyzer 24, hızlı veri yorumlama sağlar. Buna ek olarak, yaklaşım, hem deneysel ve analitik açıdan kolayca ayarlanabilir ya da özel amaçlar için ayarlanmış. Veri büyük bir kısmı bölümünde 4 özetlenen filtreleme geçmek başarısız olursa, örneğin, bir el sorunları tanımlamak için büyüme eğrileri aracılığıyla elemek yapabilirsiniz. Sorun sıkı filtre parametreleri nedeniyle ortaya çıkarsa, senaryoya ayarlamalar yapılabilir. Alternatif olarak, sorunları deneysel işlemle ilişkili ise (yani, uzun süreli yoğuşma, uygunsuz bakteriyel cel transferils, vs.) sonra ek çoğaltır kolayca tekrar edilebilir. Cuevas et al., 24 de açıklandığı gibi, PMAnalyzer tutarlı bir otomatik boru hattı olarak ayrıştırma ve analiz komut yürüten bir sarıcı komut dosyası olarak yazılmış tek bir bash programıdır. Tüm komut üçlü verileri arasında her zaman noktası için medyan değerini alarak 25 ° C&#39;de Git deposundan serbestçe erişilebilir ve daha sonra gecikme süresini elde etmek için lojistik eğri, maksimum büyüme oranı, asimptotunu ve yeni bir terim, Büyüme Seviye parameterizes. medyan değeri büyük aykırı etkisini azaltmak için Çalışmamızda ortalama üzerinde seçildi, ancak komut dosyası kolayca çoğaltmak verilerin ortalamasını hesaplamak için adapte edilebilir. Azaltılmış varyasyon verileri çoğaltmak (Şekil 2A) boyunca görülen (SE) nedeniyle bir lojistik eğrisi için PMAnalyzer medyan kullanımını sürdürmüştür. Buna ek olarak, bu çalışmada büyüme için kesilir (GL ≥ 0.4) dete olduveri Büyüme Düzeyi ve maksimum büyüme oranı karşısında nasıl ayırdığını karşılaştırarak rmined (Şekil 1A, B). Bu yeniden tanımlanmasını gerektiren bu terim değişebilir kullanılan alet ve model sistemine bağlı olarak değer kesti. Bizim tahlil önemli bir avantajı biz Büyüme Düzeyi (GL) olarak tanımlayan genel mikrobiyal büyümeyi, karakterize tek bir parametre kullanarak fenotipleri karşılaştırmak için yeteneğidir. GL harmonik ortalama olduğunu ve bu nedenle verilerin büyük aykırı etkilerini azaltır. kaymıştır lojistik takılan değerlere sahip bir harmonik ortalama kullanımının büyüme özet deneme yanılma yoluyla geldi edildi sağlamak. Diğer yöntemler büyüme dahil ayırt çalıştı: Bu geçen süre, belirli eğri parametreleri (yarım μ max μ max ve taşıma kapasitesi), tayini (R2) katsayısına ve belirli eğrisi parametreleri ile çarpılır R2 kombinasyonlarını ulaşmak için. Kaydırılmış bir harmonik ortalama kullanmaGL lojistik-fit değerleri böylece seçim yöntemi oldu büyümeyi değerlendirirken en büyük aralığı sağladı. Unutulmaması gereken bir husus dinamik büyüme eğrisi desenleri tek bir parametre veya bir monte modeli kullanırken kaybolmuş potansiyeline sahip olmasıdır. Örneğin, lojistik eğri ve GL bireysel eğri parametreleri bifazik büyümeyi temsil aciz. Tek bir karbon ortamda, bir büyüme bu etki, alt-tabaka, alt-tabaka kullanım veya vardiya her iki dönüşüm, viral protein arabuluculuk eder. Birden fazla büyüme parametreleri dikkate değilken potansiyel kayıp Ek etkileri şunlardır: uzun süreli gecikme süresi, viral makine veya ürün artan yükü öneren; Hızla enerji üretim yolları barındırmak için birleştiğinde viral proteinleri düşündüren, üstel fazı hızlandırılması; ana besin alımı ve anabolizma viral desteğe ima biyokütle oluşumu ya da daha yüksek seviyelerinin, (veriler gösterilmemiştir). Böylece, (doğmakta olan büyüme eğrilerini komplo <stGL klon genel başarısını temsil eden bir tek sayısal numara sağlayarak, dikkate lojistik modelin başlıca değişkenleri alır oysa rong&gt; Şekil 2A, B) zamanla eğilimleri ile ilgili bilgi sağlar. MAP&#39;ler yapısal ve metabolik genler tarafından katkıda farklı tepkiler göz önüne alındığında, söz konusu farklı alt tabaka sınıfları protein fonksiyonu için en büyük kanıt olduğu görülmektedir. Örneğin, metabolik proteinler genellikle merkezi metabolizma 16,32 barındırmak için spesifik olan sınırlayıcı besin, edinimi ile ilişkilidir. Ön MAP deneyleri merkezi metabolizma karbon kaynakları (Şekil 2A) üzerinde büyüdüğü zaman varsayılan metabolik faj genleri barındıran klonlar artmış bir lag fazı olduğunu ortaya koymaktadır. Tersine, konakçı enerji ve dNTP havuzları büyük boyutlara gerektiren olası yapısal genleri taşıyan klonlar, yüzde ilişkin büyüme üzerinde yanlış pozitif tepki nedenral ve amino asit metabolizması, karbon yüzeyler. (Gösterilmemiş olan Şekil 2A ve veri) mikroskopi ile gözlemlenen Bu durum, ana ipliklenmenin ve / veya inklüzyon cisimcikleri ile sonuçlanan çözünmeyen proteinlerin birikmesi muhtemeldir. Daha fazla analiz, bu ön sonuçlarını doğrulamak için gerekli iken, MAP belirli faj gen sınıflarının fonksiyonlarını hipotez için ilişkili fenotipik yanıtları almak yeteneğine sahiptir. Bilinmeyen viral proteinlerin aydınlatılması ek olarak, MAP bireysel bakterinin fonksiyonel ve metabolik çeşitlilik ya da bakteri topluluğu araştırmak için yeni bir kaynaktır. MAP bileşenleri bakterilerin bir dizi büyümeyi desteklemek kolay değiştirilmesi için tasarlanmıştır; deniz, Okzotrofik ve anaerobik mikroplar da dahil olmak üzere. Farklı bakteriyel cinsi MAP&#39;ler üzerinde desteklenebilir daha önce tanımlandığı bazal ön büyüme ortamı ilave veya ayarlanmış kimyasal türleri gerektiren bu çabalar kolaylaştırmak.MAP&#39;ler bu kullanım bir not gibi tripton, maya özütü ve pepton olarak katkı maddelerinin kullanımını yasaklayan, belirlenen medyayı muhafaza etmektir. Metabolomik metabolitler alan kütle spektrometresi ile tespit izole edilen metabolitler dahil metabolit veri tabanları, bağlıdır. Burada seçilen çekirdek tesisi büyük metabolomiks veritabanlarından birine sahiptir. Diğerleri daha önce bizim ana kaydedilmiştir asla ederken İlginçtir, bizim denemelerle ortaya çıkan metabolitlerin yarıdan fazlası (~% 65) tanımlanamayan idi, Escherichia coli (örnekler şunlardır: İndol 3 asetik asit 33, salisilik asit 34, ve dihidroreçine asit 35). Bu durum bitki metabolitleri veya soruşturma altında belirli proteinlerin doğru veritabanının güçlü bir önyargı ya isnat edilebilir. Ne olursa olsun, sonuç, veri sunumunun ve analiz için bilinen metabolitlerin sınırlı bir sayıdır. FuTure, çeşitli veri tabanları kullanılarak birden metabolomik yöntemleri daha metaboliti kapsama sağlayacak. Halen, hem bilinen hem de karşılaştırma ve bizim yeni viral proteinleri zıt yaparken bilinmeyen metabolitleri kullanılır. Bu yaklaşımı kullanarak, işlevsel olarak benzer proteinleri barındıran klonlar, eksiksiz metabolomic profilinde artan benzerliği paylaşacak varsayımında. Ön metabolomik analiz yapısal ve metabolik genler açıkça birbirinden ayrı yok ederken (Şekil 6) korelasyon yapmak aşırı eksprese zaman, bu genlerin konak üzerinde benzer etkiler gösteren ortaya koydu. Örneğin, yakından varsayılan metabolik genlerle açıklamalı kapsid gen kümeleri Bu çalışmada, EDT2440 ve EDT2441 vurgulanan. Bir kamuya açık transmembran topoloji ve sinyal peptid belirleyicisi programı kullanarak araştırmalar hem farazi metabolik genler tek bir transmembran liman kanıt gösterdi. İlginçtir 5 inci dışarı(En dendrogram kısmını sol) Birinci küme grubunda e 9 klon aynı topoloji programı kullanarak transmembran etki tahmin. Başka araştırmalar da ihtiyaç vardır, bununla birlikte, bu klonlar aşırı ekspresyonu sırasında mevcut metabolitler zar ya da yapısal yük kaynaklanan selüler gerginlik tepkisi ile ilişkili olduğu görünmektedir. Bu kanıt metabolomiks veriler gürültü artan bir miktarda sahip ise, yöntem içinde ve bir gen sınıfı arasında, her iki genin genel etkileri, farklı sinyal vurgulama yeteneğine sahip olduğunu desteklemektedir. Yöntem, gen fonksiyonu belirli bir bilgi çıkarma yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için, metabolitleri özellikle metabolik yolların gruba ayrıldı. Bir klon, tek bir yola özgü metabolitleri etkiliyorsa hipotezi varlık, ardından aşırı eksprese edilen gen bu yol aktiftir. Bizim metabolomiks kalite güvence boru hattının kurulması öncesinde, ön veriler bir yere ortayad underrepresented metabolitler ilişkili oldukları yollar üzerinde küçük bilgi veren, genellikle &quot;bilinmeyen&quot; vardı (veriler gösterilmemiştir). Önceden işlenmiş metabolomiks Ancak veriler, metabolit profilleri çoğunluğu benzer ve sadece bilinmeyen ve bilinen metabolit bolluk belirli bir sayıda, örneğin putreskin ve urasil (Şekil 6) için, klonlar arasında farklılık olduğunu ortaya koymaktadır. Protein fonksiyonu çabalarının daha yüksek çözünürlük sağlamak deneysel karakterizasyonu fonksiyonel bazlı metabolitin &quot;delikleri&quot; doldurmak için kullanılabilir bilinen faj genlerinin karşı yeni faj genleri karşılaştırmak için yapılıyor. Bu tekniği kullanarak, bilinen viral genlerin tahsis işlevi bilinmemektedir genlerinin işlevi için bir referans içerir. Bununla birlikte, metabolomic analiz sınırlayıcı faktör veritabanının boyutu ve alaka olduğunu. Bu araştırmaya ilişkilendirilebilir metabolomic veritabanları geliştirilmesi gereken bu sınırlamalar, düzeltmek için; böyleE. ASKA koleksiyonuna özgü bir metabolitlerin veritabanı ve bolluk olarak E. coli klonları olan tek ORF 36 aşırı ifade edilir. Lawerence Berkeley Ulusal Laboratuvarı&#39;nda araştırmacılar modeli bakteri 37 tüm mutant kütüphaneleri özel metabolitlerin ilk kapsamlı bir veritabanı derlenmiş bu tür veritabanları ihtiyacı için kanıtlar 2013 yılında sağlandı. Bu araştırma fenotip ve genotip arasındaki açık bağlantıyı açığa belirli metabolitlerin kullanımı için gerekli olan genlerin içine yeni görmemizi sağladı. Bir araç olarak metabolomik göz önüne alındığında, bu işleme rejimi çekirdek tesisinde izlenen tanımlamak önemlidir. En deneysel prosedürlerin bir dışlayıcı kullanım araçlara ilişkin gün-gün varyans olduğunu. Bugüne kadar tüm GC-MS analizi her bir analitik çalışma dahildir iç standartların kullanımı uygular; Ancak, projeye özel iç örneklerin eklenmesi &lt;/ Em&gt; deney her gün ilave varyans kaldırır koştu. Bu hususlar normalleştirme sorunları ve önyargıları önlemek için erken ele alınmalıdır. Başka bir çözüm, aynı makine üzerinde bir çekirdek tesiste ve tek bir toplu, herhangi bir nüve imkan mevcut bir seçenek olarak tüm örneklerin işlemektir. çeşitli araçlar hem tanıttı ve yeni ekran ve işlevsel bilinmeyen faj genleri karakterize etmek anlamına gelir sağlayan bu yazının yeniden araştırdı. hesaplamalı boru hatlarının düzene kullanımı ile deneysel tekniklerin sadelik ve uyum bu yöntemlerin araştırma çabaları ve alanlarda geniş bir yelpazede için geçerlidir sağlar. Amacımız burada sunulan Phenomic yaklaşımlar eşit işlevsel tanımsız sistemlerine ek olarak yeni faj proteinlerinin daha fazla araştırma yardımcı olacaktır.

(Bakteriyofaj veya faj aka) Bakteri bulaşan virüsler bir ortamda 1,2 küresel parçacıklar gibi 10&#39;dan fazla 31 virüsü (VLP&#39;ler) de var ve diğer tüm organizmalar sayıca tahmin edilmektedir. denizel ortamlarda ile ilişkili viral toplulukları araştıran ilk çalışma metagenomic viral fraksiyon 3 içinde görülen çeşitlilik miktarının üzerinde duruldu. Buna ek olarak, Breitbart ve arkadaşları, viral Topluluğu dizilerinin üzerinde 65% kamuya açık veri tabanlarında mevcut olan bir dizi ile homoloji paylaştığı bulundu. Daha sonraki çalışmalar metagenomic benzer kanıtlar bulundu: San Diego deniz çökelleri gelen metagenomes, California% 75 bilinmeyen virüs dizileri 4 içerirler; Salton Denizi hypersaline göllerden metagenomes% 98 bilinmeyen virüs dizileri 5 içerirler; % 98 bilinmiyor viral sekanslar 6 - ve mercan ilişkili metagenomes 95 içerir. Açıklama içermeyen Bu bilgi birikimi sonuçlandı7 &quot;Biyolojik evrenin karanlık madde&quot; olduğu faj genetik materyal. Faj genomik karakterizasyonu mevcut nükleik asit ve protein veri tabanları ile karşılaştırmak yoluyla dizi benzerliği belirleme dayanır. Faj kodlanmış genetik bilgi ağırlıklı bilinmediğinden, homoloji dayalı yöntemler etkisizdir. Transkripsiyon ve replikasyon genleri, metabolik genleri ve yapısal genleri: genomları içinde, fajlar tipik olarak üç ana gen tiplerini kodlamak. transkripsiyonuna genleri (sınıf I / II genleri 8) polimerazlar, primases, endo / ekso-nükleazlar ve kinazlar bulunmaktadır. Bu genler çok transkripsiyonu ve faj genetik materyali kopyalayan, faj enfeksiyonu önemleri nedeniyle muhafaza edilir. Faj polimerazlar kolaylıkla nedeniyle küresel koruma 9 geleneksel bir dizi homolojisi yöntemler kullanılarak tespit edilir ve etkili filogenetik işaretleri 10 karşılık vermektedir gösterilmiştir.Aksine, faj metabolik ve yapısal genlerdeki (sınıf II / III genleri 8) giderek farklı ve genellikle varsayımsal genler olarak açıklamalı vardır. Faj metabolik genler konağın metabolik kapasitesini etkiler ve mutlaka viral replikasyon için gerekli değildir. Genellikle, yardımcı metabolik genlerin 11 (AMGs) olarak geçen bu genler, konakçı metabolizmasını modüle eden ve enfeksiyon ve viryon olgunlaşma başarı uygun ilerlemesini sağlar görünmektedir. AMGs sınırlayıcı besin ya da enerji üretimi yollarındaki kullanımı ve madde alımı ile ilişkilendirilmiştir. Bazı örnekler fotosistem çeşitli cyanophage 12-16 genomları bulunan genleri, genler bağlı olan ve fosfat metabolizması 17,18 ve faj dNTP biyosentezi 18,19 için pentoz fosfat yolunun kullanımı ile düzenlenir bulunmaktadır. Buna karşılık, yapısal genler enfeksiyon sırasında üretilen geç genlere orta arasındadır ve farklı faj-ho arasında farklılıkst sistemleri. yapısal proteinlerin üretimi kendi transkripsiyon, çeviri ve montaj 8 viral dNTP kullanılabilirliği ve enerji havuzları bağlıdır. kapsid ve kuyruk fiber yapısal proteinler tüm viral proteini kodlayan genlerin en farklı olarak kabul edilir ve başarılı viryonu üretimi için gereklidir. Onların sapma tipik olarak virüs konak Birlikte evrimin varlığını 20 şekillenmesinde aktif bir rol oynamak atfedilir. Geleneksel homoloji ve sekans hizalama teknikleri kullanırken Iraksak proteinler, ne olursa olsun gen sınıfı, kolayca göz ardı edilir. Sıkı dizi karşılaştırmalar ile görülen kısıtlamalar düzeltmek için bir çaba gibi yapay sinir ağları 21 olarak dernek belirlemek için dizi özelliklerini kullanma yeteneğine biyoinformatik araçları sonuçlandı. Yapay sinir ağları (YSA) yapısal ve metabolik genlerin tahmini için izin, ancak, doğrudan karakterize etmek için aşağı deneysel doğrulama gerektirenGen işlevi. Bu yazının amacı, yeni bir faj gen sentezlenmesi sırasında bir konakçı bakteri hem katabolik ve anabolik metabolizma izleme yeteneğine Phenomic protokolleri temin edilmesidir, işlevsel YSA&#39;ların yoluyla tahmin. phenomics alanı, hücresel fenotipleri ile ilişkili biyoloji, iyi bilinmeyen ya da pleiotropik fonksiyonu ile proteinlerin soruşturma yardımcı olmak için sistem biyolojisi kurulmuştur. Phenomic araçlar genotipik bilgilere fenotipik bilgi bağlamak için kullanılır. Biz onların fonksiyonu (ler) faj gen ifadesi sırasında gözlemleyerek konak fizyolojik etkileri yoluyla tespit edilebilir varsayılan faj genlerinin hipotez. Bu hipotezi araştırmak için, iki sayısal yöntemler seçildi. Metabolomik belirli ortamındaki büyüme sırasında ev sahibi metaboliti çeşitliliği ve göreceli bolluk ölçülen ise Multi-fenotip Tahlil Tabaklar (MAP) ana substrat kullanımını ve sonraki biyokütle oluşumunu izlemek için kullanıldıruhsal durumların. Varsayılan yapısal ve metabolik proteinler Escherichia coli aşırı ve her iki deneylerden temsilcisi sonuçları karşılaştırılmıştır. Sayısız görsel teknikler ve yüksek verimli işleme boru hatları deneysel çoğaltma kolaylaştırmak için sunulmuştur. Son olarak, sunulan yöntemlerinin uyarlık ve doğruluğu açıklamalı kapsid proteini ve faj metabolik protein, tiyoredoksin, artı iki varsayılan AMGs için beklenen fizyolojik etkileri bağlamında ele alınmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

Faj konak etkileşimleri içine Güncel araştırmalar (meta) genomlar bilgiyi extrapolating bağlıdır. İlginçtir, 60 - tüm faj dizilerinin% 95 geçerli açıklamalı proteinlere hiçbir benzerliği paylaşırlar. Bunun bir sonucu olarak, faj genlerinin büyük bir kısmının varsayımsal olarak açıklamalı. Bu gerçeklik ağır hem yapısal ve yardımcı metabolik genlerin şerhi etkiler. Burada bu bilinmeyen faj genlerin birinin sentezlenmesi sırasında seçilen konakçı fizyolojik yanıt (lar) yakalamak için tasarlanmış Phenomic yöntem sunuyoruz. Metabolomik metaboliti bolluk ve çeşitlilik izleyerek iki ürün analizi sağlarken Çok fenotip Tahlil Tabaklar (MAP), ev sahibi substrat kullanımı ve sonraki biyokütle oluşumu çeşitliliğini izlemek için kullanılır. Her iki araç tek bir varsayımsal faj açık okuma çerçevesinin (ORF) ekspresyonu ile bağlantılı bir fenotipik profil sağlamak için eşzamanlı olarak kullanılır. Her iki yöntem için Örnek sonuçlar, highli karşılaştırıldığındafarazi yapısal veya metabolik faj genleri ya taşıyan bir ana fenotipik profil farklılıklarını ighting. Buna ek olarak, deneysel analizi kolaylaştırdı görselleştirme teknikleri ve yüksek verimlilik hesaplama boru hatları sunulmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins at JoVE.com

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Görüntüleme.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Video: Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.