Name: biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions at JoVE.com

The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

Polimer Beads Proteinlerin 1. Kimyasal Birleştirme <ol><li> Tiol-amin yönlü birleştirme Not: Bu protokol, proteinler Sülfosukinimidil 4- (p -maleimidophenyl) bütirat, çapraz bağlama maddesi olarak (Sülfo-SMPB) (Şekil 1) kullanılarak, polimer boncukları işlevselleştirilmiş amin içeren sistein bağlanması için uygundur. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Şekil 1. Çapraz bağlama polimer taneleri proteinlerin yön tiyol-amin bağlanması için kullanılan stratejiyi. Amin modifiye polistiren boncuklar Sulfo-SMPB ile aktive edilir. Maleimid boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li&gt; <li> Kullanımdan hemen önce bir 100x stok TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml) (tris (2-karboksietil) fosfin) hazırlayın. </li><li> 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml PBS içinde, pH 7.0) kullanımdan hemen önce sisteinin hazırlayın. </li></ol></li><li> Boncuk aktivasyon: <ol><li> Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. </li><li> Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g&#39;de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. PBS 0,8 ml damla pelletini. </li><li> , Taze hazırlanmış 10 mM Sulfo-SMPB 200 ml ekleyin nihai concent vermek2 mM oranı. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. </li></ol></li><li> Protein azaltma: <ol><li> Aktivasyon aşaması kuluçka süresi boyunca, bu nedenle hemen aktif boncuklara ilave edilebilir, aşağıdaki birleştirme adımı için protein hazırlamak. Not: Bu indirgeme aşaması, her zaman GST (glutation-S-transferaz) füzyon proteinleri için gerekli değildir, ancak bu yüksek bağlanma özelliğine sağlamak için önerilir. <ol><li> Protein konsantrasyonu kontrol edin ve birleştirme reaksiyonu için gerekli olan son konsantrasyona göre ayarlayın. Not: PBS içinde 6 mM proteini ve 1 ml&#39;lik bir hacim genellikle kullanılır. </li><li> 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek TCEP stokları ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti inkübe edin. Not: Reaksiyon karışımı, doğrudan aşağıdaki birleştirme reaksiyonu için kullanılabilir. </li><li> Pro belirlemek için, protein çözeltisine küçük bir miktar (bir kaç mi) koru<html> tein konsantrasyon ve bağlanma verimliliği hesaplanması (bakınız bölüm 2). </li></ol></li></ol></li><li> Protein birleştirme aşaması: <ol><li> Santrifüjlemeden sonra (2 dk, bir mikrosantrifüj 16.000 x g) aktive boncuklar Pelet ve taze, steril 1 ml PBS içinde bir kez pelet yıkayın. </li><li> Istenilen protein konsantrasyonu verecek şekilde, hazırlanan protein solüsyonu (örneğin, 1 ml) içinde pelletini. Not: bağlanma adımı sırasında protein konsantrasyonu ortalama bağlanma verimliliğiyle (bağlanma etkinliği belirlenmesi için bakınız bölüm 2) ve (1.1.4.3 hesaplanan) istenen bağlanma yoğunluğuna bağlı olacaktır. Birleştirme adımı sırasında protein konsantrasyonu yaklaşık 6 mM olmalıdır, böylece etkinliği, yaklaşık% 85, 10x boncuk süspansiyonu, istenen nihai konsantrasyon 5 mM. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak bağlama yoğunluğu hesaplayın: jpg &quot;/&gt; Burada ρ c bağlama yoğunluğu [protein moleküllerinin sayısı / nm 2], Protein konsantre protein konsantrasyonu [mg / ml], Protein M protein molekül ağırlığı [Da] w boncuk boncuk kons konsantrasyonu [boncuk sayısı / L], d boncuk çapı [nm 2] Avogadro sayısı </li><li> Ortalama ligand aralığı hesaplamak için birleştirme yoğunluğu kullanın: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C &#39;de 2 saat süre ile, protein-boncuk süspansiyonu inkübe edin. Not: Bazıproteinler, oda sıcaklığında stabil olmayabilir. Bu gibi durumlarda, reaksiyon 4 ° CO / N üzerinden gerçekleştirilebilir. </li><li> 50 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar sistein stok ekleyerek boncuklar üzerinde kalan aktif gruplar devre dışı bırakın ve dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir süspansiyon inkübe edin. Santrifüj (2 dk, bir mikrosantrifüjde 16.000 xg) boncuk pelet. </li><li> Protein konsantrasyonunu ve bir bağlanma verimliliğiyle hesaplanmasını belirlemek için süpernatan tutun (bakınız bölüm 2). </li><li> Son ürünü vermek üzere, taze PBS, 1 ml 1 ml PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez kordon pelet yıkayın. Not: Yukarıdaki protokol, tipik olarak, daha sonraki deneyler (bakınız bölüm 3) için 10x stoklar olarak kullanılabilir 5 mM bir son protein konsantrasyonu, önceki, birleştirilmiş proteinin 1 ml verecektir. </li><li> Protokol bölüm 3 devam etmek için, boncuk stoğu 100 ml / ml çalışma ya da 500 nM proteinin bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Not: Bu prosedüründe için iyi bir başlangıç ​​noktasıe 2 nm 3 x 10 -4 protein / ml&#39;lik bir ortalama bağlanma yoğunluğu ya da 2 mm çapa sahip olan bir boncuk 57 nm&#39;lik bir ortalama mesafe ile sonuçlanan, 2 x 10 12 boncuk / ml olacaktır. </li></ol></li></ol></li><li> Tiol-karboksi yönlü birleştirme Not: Bu protokol, karboksil işlevselleştirilmiş polistiren boncuklara proteinler içeren sistein bağlanması için uygundur. Karboksil yarımı, ilk olarak, değiştirilmiş amin ve daha sonra çapraz bağlı Sülfo-SMPB (Şekil 2) ile 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukinimid (NHS) kullanılarak aktive edilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Şekil 2. Çapraz bağlama polimer boncuklara proteinler yönlü tiol, karboksil bağlanması için kullanılan stratejiyi. Karboksillenmiş polistiren taneleri, ilk EDC aktive edilen ve yarı-kararlı NHS-esteri oluşturmak için NHS ile modifiye edilir. Ethylenedi sonradan amin birleştirmeSülfo-SMPB ile reaksiyona giren bir serbest amin grubu, amin oluşur. Maleimid boncuklar sonra. Boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girebilen aktif <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li><li> Kullanımdan hemen önce TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml), bir 100 x stok hazırlayın. </li><li> 10x stok kullanımdan hemen önce EDC (PBS içinde 20 mM ya da 4 mg / ml) (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid) hazırlayın. </li><li> 10x stok NHS (PBS içinde 50 mM ya da 6 mg / ml) (N-hidroksisukkinimid) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> Hemen b sistein 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml&#39;lik son yoğunluğa seyreltildi, pH 7.0) hazırlamakefore kullanımı. </li></ol></li><li> Boncuk aktivasyon: <ol><li> Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. </li><li> Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g&#39;de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. </li><li> Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. </li><li> PBS 0,8 ml damla pelletini. </li><li> 10x EDC stokunun 100 ml (2 mM nihai konsantrasyon) ve boncuk süspansiyonuna 10x NHS stok çözeltisi (5 mM nihai konsantrasyon) hemen 100 ml ekleyin. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. </li><li> 0,8 ml taze, steril PBS PBS ve tekrar süspansiyon 1 ml&#39;lik bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 200 ml etilendiamin ekleyin ve incdönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu Ubate. </li><li> 1 ml PBS ile bir kez boncuk yıkayın ve taze PBS 0.8 ml içinde yeniden süspanse boncuklar. </li><li> Bölüm 1.1.2.4 (Sulfo-SMPB ile boncuk aktivasyon) Bölüm 1.1.2 altında anlatılan itibaren devam ve bölüm 1.1 (Tiyol-amin yönlü kavrama) tarif protokol kalanını izleyin. Bölüm 1.1 de tarif edilenlere benzer bir şekilde proteinin hazırlanması ve protein bağlama işlemleri gerçekleştirin. Not: (. Yaklaşık% 75) Bu protokol kullanılarak, tipik bağlanma randımanı, bu nedenle, aynı birleştirme yoğunluğu elde etmek için uygun şekilde, ilk protein konsantrasyonunu ayarlamak bölüm 1.1 ile karşılaştırıldığında, biraz daha düşüktür. </li></ol></li></ol></li></ol> Kavrama Etkinliğinin Belirlenmesi 2. Not: aşağıda Bradford reaktifi 10 ve kolorimetrik tahlilleri, protein konsantrasyonu belirlemek kullanmak için: <ol><li> Yavaşça e Bradford Reaktifini ters<html> reaktifin şekilde almalarının sağlanması homojenliği. </li><li> Tampon maddesi içinde 0.1 ila 1.5 mg / ml BSA konsantrasyonları kapsayan protein standartlarının hazırlanması, 10 mg / ml BSA stok solüsyonu kullanılması. </li><li> Bir 96-kuyulu plakanın kuyularına Bradford reaktifi 250 ml ekleyin. Tüm örneklerde, Protein standartlarının ve negatif kontroller (sadece tampon) için yeterli kuyu hazırlayın. </li><li> 96-çukurlu plaka içinde reaktifi (negatif kontrol için Protein standartlarının veya tamponu), protein örneğinin 5 ml ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka inkübe edin. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak 595 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li><li> A595 nm&#39;ye karşı BSA konsantrasyonu standart bir eğri oluşturmak ve ilk ve süpernatan numuneler içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi için kullanabilir. </li><li> Şöyle bağlanmış protein konsantrasyonu hesaplanır: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Bağlanma verimliliğini olarak hesaplayın: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> Rekabet tahlilleri Boncuk-bağlanmış adezinlerin 3. <ol><li> Hazırlık: <ol><li> Tohum, 24 oyuklu bir plakaya 150,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda bir rekabet deneyinde bir gün önce de Hela hücreleri, oyuk başına 1 mi, hücreler önce, deney başlamadan yaklaşık% 80 birleşik duruma ulaştılar izin vermek. </li><li> Üçlü olarak her deneysel koşul ayarlayın. Negatif kontroller için kuyular (rekabet deneyleri sırasında eklenen hiçbir bakteri), pozitif kontroller ve (sitotoksisite deneyleri için) lizis kontrolleri (sadece yarışma deneyleri sırasında eklenen füzyon etiketi bağlanmış kontrol boncuk) ekleyin. </li><li> V. taze bir kolonisi olan 5 ml deniz LB (MLB) kültür aşılamak parahaemolyticus ve sallayarak, 30 ° C&#39;de O / N büyür. </li><li> Bölüm 1. (Kuplaj) &#39;de tarif edildiği gibi, yeterli bir kordon ile birleştirilmiş MY hazırlayın. 10x boncuk stoğu 100 ml Veren ile sabitleştirilir. </li></ol></li><li> Rekabet deneyi: <ol><li> Competit günündeiyon deneyi, bakteri kültürü OD 600 ölçün. </li><li> Katkı maddesi olmadan, renksiz bir DMEM içinde bakteri kültürleri seyreltilmesi ile enfeksiyon ortamı hazırlanır,% 10 v / v boncuk süspansiyonu (her iki adezin-bağlanmış taneleri veya kontrol tanesi), 10 MOl&#39;de 1 ml hazırlayın vermek üzere ihtiva eden 37 ° C önceden ısıtılmış / oyuk ve örnek başına 10-20% -fazla hacmi. Not: Yukarıda belirtilen koşullar altında (24 oyuklu plaka, V. parahaemolyticus, 10 İB), O / N kültürü gerekli hacim için kültür 3 / OD 600 olarak hesaplanır oyuk (ml / ml) başına eklenmelidir. Örneğin, enfeksiyon ortamı, 1 ml tipik haliyle, bakteri kültürü, birkaç ml 100 mi boncuk süspansiyonu içerecek ve renksizdir, katkısız DMEM 1 ml&#39;ye kadar yapılır. </li><li> Kuyulardan eski orta çıkarın ve her bir 37 ° C, steril PBS önceden ısıtılmış 1 ml ekleyerek kültürlenmiş Hela hücreleri yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve oyuk başına enfeksiyon ortamı 1 ml. Ayrıca çözümler cont ekleyerek, kontrolleri kurmak% 0.1 Triton X-100 (sitotoksisite ölçümleri için, sadece gerekli liziz kontrol) içeren kontrol boncuklar ve bakteriler (pozitif kontrol) ya da adezin boncuk ve hiçbir bakteri (negatif kontroller) veya DMEM Tahliye. </li><li> Istenen süre (örneğin, sitotoksisite ölçümleri için 4 saat ya da yapışma ölçümleri için 1 saat) 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe edin. Not: konakçı hücreler bakteriyel yapışma ve sitotoksisite Hem inhibisyon etkinliği için okuma-çıkışları olarak kullanılabilir. Sitotoksiklik ve yapışma ölçümlerinin zaman noktaları uyuşuyorlarsa sitotoksisite kültür süpernatanı ve bağlanma tahlilleri, kalan hücre katmanı elde edilen numuneleri kullanmak kullanılarak tespit edilir, çünkü her iki çalışma, aynı kaynaktan örnekler kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Sitotoksisite ölçümleri: <ol><li> Belirtilen zaman noktalarında (örn 4 saat sonrası enfeksiyon), her 24 kuyu ve transfer için üç kez 200 ml kaldırmakBir 96-yuvalı plaka. </li><li> De yeni bir 96 oyuklu bir plakaya, 1500 x g&#39;de, her 5 dakika ve transfer 100 ml, 96 gözlü levhalar dönerler. Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına taze enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan ortamın 100 ml (bu boş olarak kullanılacaktır) ekleyin. </li><li> Laktat dehidrogenaz (LDH) salım deneyi bir LDH sitotoksisite belirleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin. <ol><li> Kısaca, 25 artışlarla ihtiyaç duyulan reaktif miktarını hesaplamak (62 numune ölçülecek ise, örneğin, 75 vs. için yeterli reaktif karışımı makyaj). </li><li> Örneğin, 100 numune için, reaktif B Invert 250 ul reaktif A 11,25 ml karışımı, köpük önlemek için girdap yok. </li><li> Çok kanallı bir pipet ile pipetleme edebilmek için bir hazne karışımı koyun. Her bir örnek için reaktifi karışımı 100 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında inkübe ve plaka 10, 20, 30 dakika sonra, bir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm&#39;de absorbans okunur. </li&gt; <li> Liziz kontrol numunesinin absorpsiyonunu yüksek ama yine plaka okuyucu (tipik haliyle, 2-3 absorbans birimi) lineer aralığında olduğu veri kümesi analiz edin. </li><li> Dönüşüm için aşağıdaki formül kullanılarak,% sitotoksisite gibi sonuçları Express: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Bakteriyel yapışma ölçümü: <ol><li> Belirtilen zaman noktalarında (örn 1 saat sonrası enfeksiyon) olarak, hücre tabakasından ortamı çıkarın. </li><li> İyice herhangi bir un bağlı hücreleri çıkarmak için, steril, önceden ısıtılmış PBS (1 ml PBS her birinin en az 3-4 yıkama) hücre tabakası yıkayın. </li><li> PBS içinde Triton X-100 çözeltisi h steril% 1 v 1 ml / eklenerek göz başına Lyse konakçı hücreler sunar. 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> 1.5 ml tüpler ayırmak için de her içeriğini aktarmadan önce her bir örnek yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle. Örneklerin 10 kat seri dilüsyonları hazırlayınsteril PBS içine (örneğin, numune 100 ml PBS 900 ml kullanım). </li><li> Levha 100 MLB agarı üzerinde her bir numunenin mi ve bir hücre dağıtıcı kullanılarak yayıldı. Bakteri suşları ve zaman noktasına bağlı olarak plaka sulandırmalarda hangi optimize edin. Not: Açıklanan deney düzeneği için, 10 5 ya da 10 6 kat seyreltme CFU sayısını uygun bir sayı verir. </li><li> 37 ° CO / N plakaları inkübe ve koloni sayımı ile bakteri numaralandırma. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, sırasıyla amin- akuple tiol içeren proteinler için kullanılan veya karboksilat ile modifiye edilmiş polistiren boncuklar gibi iki protokol, tarif eder. İşleme bağlı kolaylığı, tiol-amin birleştirme tercih edilir, ancak arzu edilen boncuk tarifnamede (çap, flüoresan özellikleri) bağlı olarak, bir amin-işlevselleştirilmiş boncuk kullanılması mümkün olmayabilir ve bu nedenle karboksilat dönüştürecek bir protokol dahil ettik - Bir amin kısma Araştırmacı iskele seçiminde mümkün olan en büyük esnekliği sağlamak için. Protein, yönlü kavrama ihtiva eden herhangi bir sistein hem tiyol-amin ve tiol, karboksil birleştirme çalışmaları (yani, N-terminusunda başına protein, yüzey görüntüsünü taklit immobilizasyonu) sistein artıklarının olmayan bir protein gerektirir, ancak, bu bir GST füzyon olarak üretilir Protein ya da bu site tarafından tanıtılan tek bir terminal sistein kalıntısı mutagenezini yönetti içerir. Birden çok reaktif sistein ihtiva edilmesi halindeprotein içinde, bu proteinin fonksiyonunu engelleyebilir rastgele immobilizasyon yol açacaktır. Pek çok bakteriyel adezin doğal sistein içermez. Bu yerel yapısı ve fonksiyonu mutant korunur sağlamak için kapsamlı deneyler gerektirecektir, ancak diğerleri için, bu, bir yere yöneltilmiş mutagenesis ile ayrılabilmektedir. GST füzyon proteinleri için, boncuklara bağlanmış saflaştırılmış GST-eklentisi uygun bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. Bu genellikle bir araya gelme veya non-spesifik olarak hücrelere bağlı için daha yüksek bir eğilimi olduğu gibi, bir kontrol olarak bağlanmamış boncuklar kullanılarak, kaçınılmalıdır. Ancak EDC kullanılarak protokol 1,2. Basitleştirilmiş bir versiyonu, bu durumda, bağlantı yönlü bağlantıyı garanti etmez, bu nedenle protein, birincil aminler ile gerçekleşir ve bununla birlikte in, karboksil işlevselleştirilmiş polimer boncuklara birkaç proteinlere kullanılabilir. Bir indirgeme maddesi olarak TCEP gibi dithiothr gibi diğer ticari olarak temin edilebilir ve yaygın olarak kullanılan indirgeme maddeleri ile ikame edilmesi gerekmezeitol (DTT) ya da 2-merkaptoetanol (BME), içlerindeki tioller tiol maleimid bağlama adımında, protein bağlama ile rekabet edecek şekilde. PBS diğer tamponlar ile ikame edilebilir, ancak aşağıdaki hususlar ile: Tamponlar birincil aminler içermeyebilir (nedenle Tris ihtiva eden tamponlar uygun değildir). Çok düşük (&lt;10 mM) tuzu konsantrasyonlarını ihtiva eden tampon maddeler kullanılması topaklanma boncuk yol açar ve de kaçınılmalıdır. Protein saflığı da önemli bir faktör, bu işlem sırasında dikkate ve yüksek kaliteli veri elde etmek için olan, saf proteinler, kullanılmalıdır. Rutin olarak, en az bir afinite arıtma ve jel filtrasyon aşaması da dahil olmak üzere, birden fazla adımda proteinleri saflaştırmak ama değiştirme kromatografisi, iyon bazı durumlarda, bir üçüncü adım olarak yapılır. SDS-PAGE ile değerlendirildiği gibi bir sonucu olarak bağlamak için kullanılan proteinler saflığı genellikle% 90 veya daha fazladır. Bu inci gibi, ilk reaksiyon karışımında hem protein konsantrasyonlarını belirlemek için önerilirReaksiyon tamamlandıktan sonra e süpernatant. Bu bariz Boncuk bağlanmış protein konsantrasyonunu ve dolayısıyla bağlanma yoğunluğu belirlemek için yardımcı olacaktır. Her iki değerin belirlenmesi, aynı zamanda bağlanma randımanı hesaplanmasına izin verir. Istenen son konsantrasyon ve bağlanma yoğunluğu elde etmek için, daha sonraki reaksiyonlarda ilk protein çözeltisinin hazırlanması, bu göz önüne alınabilir. Reaksiyonun maddelerin yok kullanılan konsantrasyonlarda boya kompleksi oluşumu ile karışabilir Bradford reaktifi, özellikle, önce ve birleştirme reaksiyonundan sonra protein konsantrasyonu belirlenmesi için uygundur. Düşük protein konsantrasyonu kullanılacak ise, bu yöntem, daha hassas bir saptama yöntemi ile ikame edilmesi gerekebilir, ancak ilgi bu birleştirme reaksiyonu içinde ihtiva edilen maddeler ile uyumlu olması gerekir için ödenmesi gereken yer alır. Aynı zamanda özenle toz reaktifleri taze hazırlanmış reaktifleri kullanmak ve işlemek için tavsiye edilir (örneğin, mağazakapalı bir kap içinde ve silis boncuklar kullanarak birleştirme etkinliğini olumsuz etkileyecektir reaktifler kalitesi yana nem çekme reaktifler) önlemek için. Bağlanma verimliliği beklenenden daha düşük ise, olası çözümler başlangıç ​​kordon ve protein artan konsantrasyonlarda içerir. Daha yüksek konsantrasyonlar kullanılıyorsa, eşleme reaktif konsantrasyonu, orantılı olarak artırılacaktır için yeterli molar fazlalığı temin etmelidir. Boncuk / protein konsantrasyonlarını değiştirerek genellikle daha iyi bir optimizasyon yolunda adım ziyade tepki süreleri artmaktadır. Boncuk bağlanması için protokoller uzun olduğundan, biz bunlara malzemenin büyük bir toplu hazırlar. Süspansiyon örnekleri, sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde dondurulup birkaç ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Çözülmüş alikotları refrozen olmamalıdır ve 4 ° C &#39;de tutulur ve 1-2 gün içinde kullanılmalıdır. Bununla birlikte, bu ilk olarak küçük bir parti test edilmelidir olarak kullanılan protein maddelerinin tabiatına ve stabilitesine bağlı olarak değişecektir. <p clasAşağıda ele alındığı gibi s = &quot;jove_content&quot;&gt; Boncuk bağlanmış adhesinler, bir çok uygulama için kullanılabilir. Bu protokol, genellikle konakçı hücreler bakteri bağlanma ve patojen aracılı sitotoksisite inhibisyonunu ölçmek için kullanılan bir deneyi tarif. Analiz genellikle konukçu hücrelere bakteriyel ek bir düşüş kullanılarak, rekabetçi deniz gıda kaynaklı patojen Vıbrıo parahaemolyticus ile Hela epitel hücrelerin enfeksiyonunu inhibe etmek için, boncuk bağlanmış MAM kapasitesinin ölçülmesi için yapıldı ya da okuma olarak sitotoksisite azalır . Her iki durumda da, hazırlanması ve rekabet analizleri aynı protokolü uygulayın. V. okuma bağlı olarak, farklı suşlar parahaemolyticus kullanılmaktadır: POR1 sitotoksisite ölçümleri için kullanılan sitotoksik suşu, sitotoksik olmayan streyn POR2 bakteriyel yapışmayı ölçmek için kullanılır ise, hücre ölümü ve hücre dekolmanı bağlı bakteri miktarının belirlenmesi için prosedür ödün yana. Başlangıçta, yetYarışmaları&#39;na deneyleri konakçı hücreler bakteriler eklenmesinden önce boncuklar ile önceden inkübe edildi, ilk adım adım bir protokol gibi oluşturulmuştur. V için parahaemolyticus ve ikinci topuk kısmı özellikleri (MAM7 bağlanmış 2 um boncuk), her iki boncuk ve bakteri elde edilen sitotoksisite değişiklik olmaksızın, aynı anda ilave edilebilir. Yani, bu deney sisteminde, taneler konakçı hücre bağlama bakterileri outcompete. Kullanılan bakteri türleri ve boncuk geometrisine bağlı olarak, iki ayrı adımlar olarak boncuk yapışma ve bakteriyel enfeksiyonu korumak için iyi nedenler olabilir. Örneğin, hareketsiz bakteri hücreleri enfekte etme plakalar genel olarak enfeksiyonun ortam ilave edildikten sonra santrifüje tabi tutulur. Bu hücre tabakası boncuk yüksek ölçüde düzensiz dağılımına yol açar Bununla birlikte, kordon süspansiyonlar ihtiva eden plakalar santrifüj kaçınılmalıdır. Daha küçük parçacık boyutları kullanılıyorsa, boncuk, hücre yüzeyindeki yerleşmek uzun sürer durumda su içindefficient süresi enfeksiyondan önce kordon bağlanması için izin verilmelidir. Bakteriyel yapışma üzerinden oku olarak kullanıldığında, konakçı hücreler önemli ölçüde enfekte eden soyun zarar görmezler burada numuneler bağlı bakterilerin miktarının tehlikeye hücre kopması ve yok edilmesi olarak, zaman noktalarında alınır. Bunun yerine seyreltme plaka ile bakteriyel yapışmayı sıralandıran örnekler alternatif görüntüleme (Şekil 5) işlenebilir. Bu durumda, doku kültürü hücreleri, daha çok, doğrudan kuyulara daha cam kapak slipleri üzerine ekildi edilmelidir. Buna ek olarak, bir flüoresan proteini ifade flüoresan boncuklar ve bakteri enfeksiyonu özel konakçı hücre işaretleri ile birlikte kullanılabilmektedir. Örneğin, rekabet deneyleri genellikle konakçı hücrelerinin aktin hücre iskeleti leke ve floresan mavi boncuk ve floresan ile birlikte, enfeksiyondan kaynaklanan morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için floresan kırmızı rodamin-Phalloidin kullanarak görüntülüYeşil (GFP ifade veya SYTO18 lekeli) bakteriler. Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes ve Streptococcus F1 FUD ve Vibrio parahaemolyticus MAM de dahil olmak üzere topuk kısmı çiftli adezinler bir dizi, yapışma, yapışma inhibisyonu ve yapışma katkı çalışma biomimetik malzemeleri olarak kullanılmıştır patojen aracılı sitotoksisite 1, 7, 8. iskeleler olarak kullanılan polimer taneleri renk (örneğin, mavi, kırmızı flüoresan, mavi, yeşil, turuncu) geniş bir aralığında kullanılabilir, çünkü bu yaklaşımı kullanmanın avantajlarından biri, bağlanma etkinlikleri görselleştirme kolaylığıdır. Bu durumda, işlev müdahale edebilir doğrudan protein etiketleme, önlenebilir. Buna ek olarak, bu şekilde çözünür proteinler ile karşılaştırıldığında fizyolojik olarak daha uygun bir yapıyı yansıtan birleştirme taklit eder bakteriyel yüzey üzerindeki adezinlerin değerlikli görüntü yüzey. Bozulmamış bakteri veya bacteri kullanıldığı çalışmalarda karşılaştırıldığındaal mutantlar, boncuk yaklaşımı bakteriyel büyüme ile ilgili sorunları circumvents. Olumsuz konak hücrelerini etkiler büyüme ortamı ve besin tüketme asitlenme ve bakteri çoğaltma sonunda ödün - Örneğin, uzun vadeli (örneğin, O / N) sağlam bakterileri kullanarak hücrelerin barındırmak için bakteriyel yapışma çalışmalar genellikle bakteri gelişimini eşlik olayların tarafından tehlikeye görüntü kalitesi. Daha yakın zamanda, boncuk çiftli adezinlerin kullanımı bakteriyel eklenme alt sinyalleme işlemlerinin rol oynayan konak hücre faktörlerinin meyil saflaştırılması için bir araç olarak kullanımını içerecek şekilde genişletilmiştir. V. parahaemolyticus MAM7 konakçı hücre zarında fosfatidik asitler bağlanarak, RhoA aktivasyonu ve aktin yeniden düzenlemeleri 1, 3 tetikler. MAM çiftli taneler arındırmak ve MAM-konakçı hücre bir sonucu olarak bir araya toplanan sinyal platformları katılan proteinleri tanımlamak için kullanılmaktadır bağlama. Boncuklar can berikolayca kısa santrifüjleme aşaması süpernatanından ayrılması ve ilgili protein kovalent bağlanan, bu tür proteomik veya Western gibi alt uygulamalar için kullanılabilir, ilgili protein kompleksleri kirletici proteinlerden ayrılmasını sağlamak ve zenginleştirmek için iyi bir yöntem olup, Kurutma.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td>Danger; corrosive&lt;br/&gt; can be bought as solution or freshly prepared</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td><td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&amp;nbsp;&amp;mu;m mean particle size</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td><td>Thermo scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>Ethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Danger; corrosive and toxic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&amp;nbsp;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>for infection experiments</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for maintenance of cultured host cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin -&lt;br/&gt; Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Cytotoxicity detection kit</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reagent reservoirs (25ml)</td><td>SLS</td><td>F267660</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture facilities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>multichannel pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

V. parahaemolyticus adezinin MAM7 konak yüzey reseptörleri tanınması katılan yedi tandem memeli hücre girişi (MCE) etki içerir. Bu V ile rekabet etmek için, bu malzemelerin kabiliyetini test etmek için yedi ardışık MCE etki (MAM7) ya da sadece ilk MCE alanını (MAM1) ya da polistiren kapsayan rekombinant bağlanmış boncuklar, saflaştırılmış fragmanlar kullanılır bağlama konakçı hücre için parahaemolyticus ve yapışma inhibitörleri olarak, bu maddelerin elde edilen etkinlik. Hela hücreleri V. ile enfekte edildi in vitro enfeksiyonundan kaynaklanan parahaemolyticus streyn POR1 ve sitotoksisite 4 saat (Şekil 3) sonra değerlendirilmiştir. % 0.1 Triton X-100 (pozitif liziz kontrol) Hela hücrelerinin tedavisi tam hücre lizizi ile sonuçlanmıştır, enfekte olmamış hücreler POR1 ile muamele edilmemiş olan hücreler üzerinde in vitro enfeksiyonu hücre lizizi çok yüksek seviyelerine yol açtı. Sitotoksisite, çok düşük seviyelerde gösterilir ve bu MAM7-co ile inhibe edilmiştirboncuklar upled ancak MAM1-bağlanmış olmayan ya da GST-bağlanmış kontrol tanesi (Şekil 3). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Vibrio parahaemolyticus Şekil 3. Karakterizasyonu rekabet deneyleri sırasında epitel hücrelerinde sitotoksisitesine neden olmuştur. Hücreler, V ile tedavi edildi parahaemolyticus (Vp), (+) ile gösterilir, ya da bakteriler (-) farklı rakip öğeler (. bileşik) mevcudiyetinde gösterildiği gibi. Bunlar ya hiç comp dahil. (-), MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST). Kontroller olarak, hücreler Triton X-100 (triton, liziz kontrolü) ya da muamele edilmiş ya da enfekte edilmeden (uninf) kalmıştı. Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi 4 saat sonra LDH salınımı ölçüldü ve sonuçlar Triton kontroller (% 100) ve yukarıda tarif edildiği gibi boşlukları (% 0) normalize edilmiş. Sonuçlar üçlü deneylerden elde edilen ortalama ± SEM araçlardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> V. numaralandırma MAM7-, MAM1-, ya da GST Kontrol taneleri ile inkübe muamele edilmemiş Hela hücreleri, ya da hücrelerin ya da bağlı parahaemolyticus MAM7 boncuklar fakat MAM1- olmayan ya da GST kontrol tanesi, V outcompete ortaya eki için parahaemolyticus hücre yüzey reseptörleri (Şekil 4) ev sahipliği yapacak. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Yarışma deneyler sırasında bakteriyel ekin Şekil 4. Karakterizasyonu. Hela hücreleri V ile enfekte edildi parahaemolyticus yokluğunda POR2 (Vp +), (-) ya da birim rekabet mevcudiyeti aşağıdaki gibi MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST) (blş.). Bakteriyel yapışma olarak 1 saat sonra ölçülmüştür<html> bölümünde anlatılan 3. Sonuçlar üçlü deneyler ± SEM araçlardır. Araçlar (CFU / ml FLTR) 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6 bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Fluorofor etiketli boncuklara bağlanmış adhesinler konukçu hücrelere bakteriyel yapışmayı taklit ve hücresel görüntüleme (Şekil 5) güçlü araçlardır maddelerin oluşumuna yol açar. MAM7-birleştiğinde floresan mavi boncuk kullanarak, epitel hücrelerine MAM7 aracılı eki sürecini karakterize. Konukçu hücrelere MAM7 bağlanması yeniden düzenlenmesi ve birlikte görüntülenmiştir F-aktine (Şekil 5B) için leke rodamin Phalloidin kullanıyorlardı stres elyafların biçimlendirilmesine aktin ile sonuçlanmıştır. _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Hela için MAM7-birleştiğinde boncuk Şekil 5. hazırlanması ve floroforun kullanımı floresan mavi biomimetic boncuk (A) Süspansiyon (sağ tüp, 10x stok). Görüntüleme amaçlı biomimetic boncuk etiketli ve kontrol (sol tüp) tampon. (B) Ek aktin düzenlenmeleri ve stres lif oluşumu hücreler sonuçları. (Rodamin-Phalloidin ile boyanmış kırmızı) floresan mavi boncuk Bağlanma ve elde edilen aktin stres lifleri mikroskobu ile görüntülendi. Bar, 10 um. Panel B Görüntüler Lim ve ark. 1 uyarlanmıştır ve Creative Commons Attribution lisansı altında yeniden üretildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions at JoVE.com

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Görüntüleme.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

Video: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biyokimya

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

Enfeksiyon Sırasında Agar ve Dokuda Yetişen Bakteri Kolonilerinin Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi Yoluyla Mikrobiyal İşbirliğinin İncelenmesi

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biyoloji

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

Konak-Patojen Etkileşimlerinin İn Vitro Araştırılması için Organotipik Doku Model Sistemleri

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...