The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

Polimer Beads Proteinlerin 1. Kimyasal Birleştirme <ol><li> Tiol-amin yönlü birleştirme Not: Bu protokol, proteinler Sülfosukinimidil 4- (p -maleimidophenyl) bütirat, çapraz bağlama maddesi olarak (Sülfo-SMPB) (Şekil 1) kullanılarak, polimer boncukları işlevselleştirilmiş amin içeren sistein bağlanması için uygundur. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Şekil 1. Çapraz bağlama polimer taneleri proteinlerin yön tiyol-amin bağlanması için kullanılan stratejiyi. Amin modifiye polistiren boncuklar Sulfo-SMPB ile aktive edilir. Maleimid boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li&gt; <li> Kullanımdan hemen önce bir 100x stok TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml) (tris (2-karboksietil) fosfin) hazırlayın. </li><li> 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml PBS içinde, pH 7.0) kullanımdan hemen önce sisteinin hazırlayın. </li></ol></li><li> Boncuk aktivasyon: <ol><li> Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. </li><li> Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g&#39;de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. PBS 0,8 ml damla pelletini. </li><li> , Taze hazırlanmış 10 mM Sulfo-SMPB 200 ml ekleyin nihai concent vermek2 mM oranı. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. </li></ol></li><li> Protein azaltma: <ol><li> Aktivasyon aşaması kuluçka süresi boyunca, bu nedenle hemen aktif boncuklara ilave edilebilir, aşağıdaki birleştirme adımı için protein hazırlamak. Not: Bu indirgeme aşaması, her zaman GST (glutation-S-transferaz) füzyon proteinleri için gerekli değildir, ancak bu yüksek bağlanma özelliğine sağlamak için önerilir. <ol><li> Protein konsantrasyonu kontrol edin ve birleştirme reaksiyonu için gerekli olan son konsantrasyona göre ayarlayın. Not: PBS içinde 6 mM proteini ve 1 ml&#39;lik bir hacim genellikle kullanılır. </li><li> 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek TCEP stokları ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti inkübe edin. Not: Reaksiyon karışımı, doğrudan aşağıdaki birleştirme reaksiyonu için kullanılabilir. </li><li> Pro belirlemek için, protein çözeltisine küçük bir miktar (bir kaç mi) koru<html> tein konsantrasyon ve bağlanma verimliliği hesaplanması (bakınız bölüm 2). </li></ol></li></ol></li><li> Protein birleştirme aşaması: <ol><li> Santrifüjlemeden sonra (2 dk, bir mikrosantrifüj 16.000 x g) aktive boncuklar Pelet ve taze, steril 1 ml PBS içinde bir kez pelet yıkayın. </li><li> Istenilen protein konsantrasyonu verecek şekilde, hazırlanan protein solüsyonu (örneğin, 1 ml) içinde pelletini. Not: bağlanma adımı sırasında protein konsantrasyonu ortalama bağlanma verimliliğiyle (bağlanma etkinliği belirlenmesi için bakınız bölüm 2) ve (1.1.4.3 hesaplanan) istenen bağlanma yoğunluğuna bağlı olacaktır. Birleştirme adımı sırasında protein konsantrasyonu yaklaşık 6 mM olmalıdır, böylece etkinliği, yaklaşık% 85, 10x boncuk süspansiyonu, istenen nihai konsantrasyon 5 mM. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak bağlama yoğunluğu hesaplayın: jpg &quot;/&gt; Burada ρ c bağlama yoğunluğu [protein moleküllerinin sayısı / nm 2], Protein konsantre protein konsantrasyonu [mg / ml], Protein M protein molekül ağırlığı [Da] w boncuk boncuk kons konsantrasyonu [boncuk sayısı / L], d boncuk çapı [nm 2] Avogadro sayısı </li><li> Ortalama ligand aralığı hesaplamak için birleştirme yoğunluğu kullanın: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C &#39;de 2 saat süre ile, protein-boncuk süspansiyonu inkübe edin. Not: Bazıproteinler, oda sıcaklığında stabil olmayabilir. Bu gibi durumlarda, reaksiyon 4 ° CO / N üzerinden gerçekleştirilebilir. </li><li> 50 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar sistein stok ekleyerek boncuklar üzerinde kalan aktif gruplar devre dışı bırakın ve dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir süspansiyon inkübe edin. Santrifüj (2 dk, bir mikrosantrifüjde 16.000 xg) boncuk pelet. </li><li> Protein konsantrasyonunu ve bir bağlanma verimliliğiyle hesaplanmasını belirlemek için süpernatan tutun (bakınız bölüm 2). </li><li> Son ürünü vermek üzere, taze PBS, 1 ml 1 ml PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez kordon pelet yıkayın. Not: Yukarıdaki protokol, tipik olarak, daha sonraki deneyler (bakınız bölüm 3) için 10x stoklar olarak kullanılabilir 5 mM bir son protein konsantrasyonu, önceki, birleştirilmiş proteinin 1 ml verecektir. </li><li> Protokol bölüm 3 devam etmek için, boncuk stoğu 100 ml / ml çalışma ya da 500 nM proteinin bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Not: Bu prosedüründe için iyi bir başlangıç ​​noktasıe 2 nm 3 x 10 -4 protein / ml&#39;lik bir ortalama bağlanma yoğunluğu ya da 2 mm çapa sahip olan bir boncuk 57 nm&#39;lik bir ortalama mesafe ile sonuçlanan, 2 x 10 12 boncuk / ml olacaktır. </li></ol></li></ol></li><li> Tiol-karboksi yönlü birleştirme Not: Bu protokol, karboksil işlevselleştirilmiş polistiren boncuklara proteinler içeren sistein bağlanması için uygundur. Karboksil yarımı, ilk olarak, değiştirilmiş amin ve daha sonra çapraz bağlı Sülfo-SMPB (Şekil 2) ile 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukinimid (NHS) kullanılarak aktive edilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Şekil 2. Çapraz bağlama polimer boncuklara proteinler yönlü tiol, karboksil bağlanması için kullanılan stratejiyi. Karboksillenmiş polistiren taneleri, ilk EDC aktive edilen ve yarı-kararlı NHS-esteri oluşturmak için NHS ile modifiye edilir. Ethylenedi sonradan amin birleştirmeSülfo-SMPB ile reaksiyona giren bir serbest amin grubu, amin oluşur. Maleimid boncuklar sonra. Boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girebilen aktif <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li><li> Kullanımdan hemen önce TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml), bir 100 x stok hazırlayın. </li><li> 10x stok kullanımdan hemen önce EDC (PBS içinde 20 mM ya da 4 mg / ml) (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid) hazırlayın. </li><li> 10x stok NHS (PBS içinde 50 mM ya da 6 mg / ml) (N-hidroksisukkinimid) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> Hemen b sistein 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml&#39;lik son yoğunluğa seyreltildi, pH 7.0) hazırlamakefore kullanımı. </li></ol></li><li> Boncuk aktivasyon: <ol><li> Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. </li><li> Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g&#39;de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. </li><li> Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. </li><li> PBS 0,8 ml damla pelletini. </li><li> 10x EDC stokunun 100 ml (2 mM nihai konsantrasyon) ve boncuk süspansiyonuna 10x NHS stok çözeltisi (5 mM nihai konsantrasyon) hemen 100 ml ekleyin. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. </li><li> 0,8 ml taze, steril PBS PBS ve tekrar süspansiyon 1 ml&#39;lik bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 200 ml etilendiamin ekleyin ve incdönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu Ubate. </li><li> 1 ml PBS ile bir kez boncuk yıkayın ve taze PBS 0.8 ml içinde yeniden süspanse boncuklar. </li><li> Bölüm 1.1.2.4 (Sulfo-SMPB ile boncuk aktivasyon) Bölüm 1.1.2 altında anlatılan itibaren devam ve bölüm 1.1 (Tiyol-amin yönlü kavrama) tarif protokol kalanını izleyin. Bölüm 1.1 de tarif edilenlere benzer bir şekilde proteinin hazırlanması ve protein bağlama işlemleri gerçekleştirin. Not: (. Yaklaşık% 75) Bu protokol kullanılarak, tipik bağlanma randımanı, bu nedenle, aynı birleştirme yoğunluğu elde etmek için uygun şekilde, ilk protein konsantrasyonunu ayarlamak bölüm 1.1 ile karşılaştırıldığında, biraz daha düşüktür. </li></ol></li></ol></li></ol> Kavrama Etkinliğinin Belirlenmesi 2. Not: aşağıda Bradford reaktifi 10 ve kolorimetrik tahlilleri, protein konsantrasyonu belirlemek kullanmak için: <ol><li> Yavaşça e Bradford Reaktifini ters<html> reaktifin şekilde almalarının sağlanması homojenliği. </li><li> Tampon maddesi içinde 0.1 ila 1.5 mg / ml BSA konsantrasyonları kapsayan protein standartlarının hazırlanması, 10 mg / ml BSA stok solüsyonu kullanılması. </li><li> Bir 96-kuyulu plakanın kuyularına Bradford reaktifi 250 ml ekleyin. Tüm örneklerde, Protein standartlarının ve negatif kontroller (sadece tampon) için yeterli kuyu hazırlayın. </li><li> 96-çukurlu plaka içinde reaktifi (negatif kontrol için Protein standartlarının veya tamponu), protein örneğinin 5 ml ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka inkübe edin. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak 595 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li><li> A595 nm&#39;ye karşı BSA konsantrasyonu standart bir eğri oluşturmak ve ilk ve süpernatan numuneler içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi için kullanabilir. </li><li> Şöyle bağlanmış protein konsantrasyonu hesaplanır: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Bağlanma verimliliğini olarak hesaplayın: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> Rekabet tahlilleri Boncuk-bağlanmış adezinlerin 3. <ol><li> Hazırlık: <ol><li> Tohum, 24 oyuklu bir plakaya 150,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda bir rekabet deneyinde bir gün önce de Hela hücreleri, oyuk başına 1 mi, hücreler önce, deney başlamadan yaklaşık% 80 birleşik duruma ulaştılar izin vermek. </li><li> Üçlü olarak her deneysel koşul ayarlayın. Negatif kontroller için kuyular (rekabet deneyleri sırasında eklenen hiçbir bakteri), pozitif kontroller ve (sitotoksisite deneyleri için) lizis kontrolleri (sadece yarışma deneyleri sırasında eklenen füzyon etiketi bağlanmış kontrol boncuk) ekleyin. </li><li> V. taze bir kolonisi olan 5 ml deniz LB (MLB) kültür aşılamak parahaemolyticus ve sallayarak, 30 ° C&#39;de O / N büyür. </li><li> Bölüm 1. (Kuplaj) &#39;de tarif edildiği gibi, yeterli bir kordon ile birleştirilmiş MY hazırlayın. 10x boncuk stoğu 100 ml Veren ile sabitleştirilir. </li></ol></li><li> Rekabet deneyi: <ol><li> Competit günündeiyon deneyi, bakteri kültürü OD 600 ölçün. </li><li> Katkı maddesi olmadan, renksiz bir DMEM içinde bakteri kültürleri seyreltilmesi ile enfeksiyon ortamı hazırlanır,% 10 v / v boncuk süspansiyonu (her iki adezin-bağlanmış taneleri veya kontrol tanesi), 10 MOl&#39;de 1 ml hazırlayın vermek üzere ihtiva eden 37 ° C önceden ısıtılmış / oyuk ve örnek başına 10-20% -fazla hacmi. Not: Yukarıda belirtilen koşullar altında (24 oyuklu plaka, V. parahaemolyticus, 10 İB), O / N kültürü gerekli hacim için kültür 3 / OD 600 olarak hesaplanır oyuk (ml / ml) başına eklenmelidir. Örneğin, enfeksiyon ortamı, 1 ml tipik haliyle, bakteri kültürü, birkaç ml 100 mi boncuk süspansiyonu içerecek ve renksizdir, katkısız DMEM 1 ml&#39;ye kadar yapılır. </li><li> Kuyulardan eski orta çıkarın ve her bir 37 ° C, steril PBS önceden ısıtılmış 1 ml ekleyerek kültürlenmiş Hela hücreleri yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve oyuk başına enfeksiyon ortamı 1 ml. Ayrıca çözümler cont ekleyerek, kontrolleri kurmak% 0.1 Triton X-100 (sitotoksisite ölçümleri için, sadece gerekli liziz kontrol) içeren kontrol boncuklar ve bakteriler (pozitif kontrol) ya da adezin boncuk ve hiçbir bakteri (negatif kontroller) veya DMEM Tahliye. </li><li> Istenen süre (örneğin, sitotoksisite ölçümleri için 4 saat ya da yapışma ölçümleri için 1 saat) 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe edin. Not: konakçı hücreler bakteriyel yapışma ve sitotoksisite Hem inhibisyon etkinliği için okuma-çıkışları olarak kullanılabilir. Sitotoksiklik ve yapışma ölçümlerinin zaman noktaları uyuşuyorlarsa sitotoksisite kültür süpernatanı ve bağlanma tahlilleri, kalan hücre katmanı elde edilen numuneleri kullanmak kullanılarak tespit edilir, çünkü her iki çalışma, aynı kaynaktan örnekler kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Sitotoksisite ölçümleri: <ol><li> Belirtilen zaman noktalarında (örn 4 saat sonrası enfeksiyon), her 24 kuyu ve transfer için üç kez 200 ml kaldırmakBir 96-yuvalı plaka. </li><li> De yeni bir 96 oyuklu bir plakaya, 1500 x g&#39;de, her 5 dakika ve transfer 100 ml, 96 gözlü levhalar dönerler. Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına taze enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan ortamın 100 ml (bu boş olarak kullanılacaktır) ekleyin. </li><li> Laktat dehidrogenaz (LDH) salım deneyi bir LDH sitotoksisite belirleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin. <ol><li> Kısaca, 25 artışlarla ihtiyaç duyulan reaktif miktarını hesaplamak (62 numune ölçülecek ise, örneğin, 75 vs. için yeterli reaktif karışımı makyaj). </li><li> Örneğin, 100 numune için, reaktif B Invert 250 ul reaktif A 11,25 ml karışımı, köpük önlemek için girdap yok. </li><li> Çok kanallı bir pipet ile pipetleme edebilmek için bir hazne karışımı koyun. Her bir örnek için reaktifi karışımı 100 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında inkübe ve plaka 10, 20, 30 dakika sonra, bir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm&#39;de absorbans okunur. </li&gt; <li> Liziz kontrol numunesinin absorpsiyonunu yüksek ama yine plaka okuyucu (tipik haliyle, 2-3 absorbans birimi) lineer aralığında olduğu veri kümesi analiz edin. </li><li> Dönüşüm için aşağıdaki formül kullanılarak,% sitotoksisite gibi sonuçları Express: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Bakteriyel yapışma ölçümü: <ol><li> Belirtilen zaman noktalarında (örn 1 saat sonrası enfeksiyon) olarak, hücre tabakasından ortamı çıkarın. </li><li> İyice herhangi bir un bağlı hücreleri çıkarmak için, steril, önceden ısıtılmış PBS (1 ml PBS her birinin en az 3-4 yıkama) hücre tabakası yıkayın. </li><li> PBS içinde Triton X-100 çözeltisi h steril% 1 v 1 ml / eklenerek göz başına Lyse konakçı hücreler sunar. 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> 1.5 ml tüpler ayırmak için de her içeriğini aktarmadan önce her bir örnek yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle. Örneklerin 10 kat seri dilüsyonları hazırlayınsteril PBS içine (örneğin, numune 100 ml PBS 900 ml kullanım). </li><li> Levha 100 MLB agarı üzerinde her bir numunenin mi ve bir hücre dağıtıcı kullanılarak yayıldı. Bakteri suşları ve zaman noktasına bağlı olarak plaka sulandırmalarda hangi optimize edin. Not: Açıklanan deney düzeneği için, 10 5 ya da 10 6 kat seyreltme CFU sayısını uygun bir sayı verir. </li><li> 37 ° CO / N plakaları inkübe ve koloni sayımı ile bakteri numaralandırma. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, sırasıyla amin- akuple tiol içeren proteinler için kullanılan veya karboksilat ile modifiye edilmiş polistiren boncuklar gibi iki protokol, tarif eder. İşleme bağlı kolaylığı, tiol-amin birleştirme tercih edilir, ancak arzu edilen boncuk tarifnamede (çap, flüoresan özellikleri) bağlı olarak, bir amin-işlevselleştirilmiş boncuk kullanılması mümkün olmayabilir ve bu nedenle karboksilat dönüştürecek bir protokol dahil ettik - Bir amin kısma Araştırmacı iskele seçiminde mümkün olan en büyük esnekliği sağlamak için. Protein, yönlü kavrama ihtiva eden herhangi bir sistein hem tiyol-amin ve tiol, karboksil birleştirme çalışmaları (yani, N-terminusunda başına protein, yüzey görüntüsünü taklit immobilizasyonu) sistein artıklarının olmayan bir protein gerektirir, ancak, bu bir GST füzyon olarak üretilir Protein ya da bu site tarafından tanıtılan tek bir terminal sistein kalıntısı mutagenezini yönetti içerir. Birden çok reaktif sistein ihtiva edilmesi halindeprotein içinde, bu proteinin fonksiyonunu engelleyebilir rastgele immobilizasyon yol açacaktır. Pek çok bakteriyel adezin doğal sistein içermez. Bu yerel yapısı ve fonksiyonu mutant korunur sağlamak için kapsamlı deneyler gerektirecektir, ancak diğerleri için, bu, bir yere yöneltilmiş mutagenesis ile ayrılabilmektedir. GST füzyon proteinleri için, boncuklara bağlanmış saflaştırılmış GST-eklentisi uygun bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. Bu genellikle bir araya gelme veya non-spesifik olarak hücrelere bağlı için daha yüksek bir eğilimi olduğu gibi, bir kontrol olarak bağlanmamış boncuklar kullanılarak, kaçınılmalıdır. Ancak EDC kullanılarak protokol 1,2. Basitleştirilmiş bir versiyonu, bu durumda, bağlantı yönlü bağlantıyı garanti etmez, bu nedenle protein, birincil aminler ile gerçekleşir ve bununla birlikte in, karboksil işlevselleştirilmiş polimer boncuklara birkaç proteinlere kullanılabilir. Bir indirgeme maddesi olarak TCEP gibi dithiothr gibi diğer ticari olarak temin edilebilir ve yaygın olarak kullanılan indirgeme maddeleri ile ikame edilmesi gerekmezeitol (DTT) ya da 2-merkaptoetanol (BME), içlerindeki tioller tiol maleimid bağlama adımında, protein bağlama ile rekabet edecek şekilde. PBS diğer tamponlar ile ikame edilebilir, ancak aşağıdaki hususlar ile: Tamponlar birincil aminler içermeyebilir (nedenle Tris ihtiva eden tamponlar uygun değildir). Çok düşük (&lt;10 mM) tuzu konsantrasyonlarını ihtiva eden tampon maddeler kullanılması topaklanma boncuk yol açar ve de kaçınılmalıdır. Protein saflığı da önemli bir faktör, bu işlem sırasında dikkate ve yüksek kaliteli veri elde etmek için olan, saf proteinler, kullanılmalıdır. Rutin olarak, en az bir afinite arıtma ve jel filtrasyon aşaması da dahil olmak üzere, birden fazla adımda proteinleri saflaştırmak ama değiştirme kromatografisi, iyon bazı durumlarda, bir üçüncü adım olarak yapılır. SDS-PAGE ile değerlendirildiği gibi bir sonucu olarak bağlamak için kullanılan proteinler saflığı genellikle% 90 veya daha fazladır. Bu inci gibi, ilk reaksiyon karışımında hem protein konsantrasyonlarını belirlemek için önerilirReaksiyon tamamlandıktan sonra e süpernatant. Bu bariz Boncuk bağlanmış protein konsantrasyonunu ve dolayısıyla bağlanma yoğunluğu belirlemek için yardımcı olacaktır. Her iki değerin belirlenmesi, aynı zamanda bağlanma randımanı hesaplanmasına izin verir. Istenen son konsantrasyon ve bağlanma yoğunluğu elde etmek için, daha sonraki reaksiyonlarda ilk protein çözeltisinin hazırlanması, bu göz önüne alınabilir. Reaksiyonun maddelerin yok kullanılan konsantrasyonlarda boya kompleksi oluşumu ile karışabilir Bradford reaktifi, özellikle, önce ve birleştirme reaksiyonundan sonra protein konsantrasyonu belirlenmesi için uygundur. Düşük protein konsantrasyonu kullanılacak ise, bu yöntem, daha hassas bir saptama yöntemi ile ikame edilmesi gerekebilir, ancak ilgi bu birleştirme reaksiyonu içinde ihtiva edilen maddeler ile uyumlu olması gerekir için ödenmesi gereken yer alır. Aynı zamanda özenle toz reaktifleri taze hazırlanmış reaktifleri kullanmak ve işlemek için tavsiye edilir (örneğin, mağazakapalı bir kap içinde ve silis boncuklar kullanarak birleştirme etkinliğini olumsuz etkileyecektir reaktifler kalitesi yana nem çekme reaktifler) önlemek için. Bağlanma verimliliği beklenenden daha düşük ise, olası çözümler başlangıç ​​kordon ve protein artan konsantrasyonlarda içerir. Daha yüksek konsantrasyonlar kullanılıyorsa, eşleme reaktif konsantrasyonu, orantılı olarak artırılacaktır için yeterli molar fazlalığı temin etmelidir. Boncuk / protein konsantrasyonlarını değiştirerek genellikle daha iyi bir optimizasyon yolunda adım ziyade tepki süreleri artmaktadır. Boncuk bağlanması için protokoller uzun olduğundan, biz bunlara malzemenin büyük bir toplu hazırlar. Süspansiyon örnekleri, sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde dondurulup birkaç ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Çözülmüş alikotları refrozen olmamalıdır ve 4 ° C &#39;de tutulur ve 1-2 gün içinde kullanılmalıdır. Bununla birlikte, bu ilk olarak küçük bir parti test edilmelidir olarak kullanılan protein maddelerinin tabiatına ve stabilitesine bağlı olarak değişecektir. <p clasAşağıda ele alındığı gibi s = &quot;jove_content&quot;&gt; Boncuk bağlanmış adhesinler, bir çok uygulama için kullanılabilir. Bu protokol, genellikle konakçı hücreler bakteri bağlanma ve patojen aracılı sitotoksisite inhibisyonunu ölçmek için kullanılan bir deneyi tarif. Analiz genellikle konukçu hücrelere bakteriyel ek bir düşüş kullanılarak, rekabetçi deniz gıda kaynaklı patojen Vıbrıo parahaemolyticus ile Hela epitel hücrelerin enfeksiyonunu inhibe etmek için, boncuk bağlanmış MAM kapasitesinin ölçülmesi için yapıldı ya da okuma olarak sitotoksisite azalır . Her iki durumda da, hazırlanması ve rekabet analizleri aynı protokolü uygulayın. V. okuma bağlı olarak, farklı suşlar parahaemolyticus kullanılmaktadır: POR1 sitotoksisite ölçümleri için kullanılan sitotoksik suşu, sitotoksik olmayan streyn POR2 bakteriyel yapışmayı ölçmek için kullanılır ise, hücre ölümü ve hücre dekolmanı bağlı bakteri miktarının belirlenmesi için prosedür ödün yana. Başlangıçta, yetYarışmaları&#39;na deneyleri konakçı hücreler bakteriler eklenmesinden önce boncuklar ile önceden inkübe edildi, ilk adım adım bir protokol gibi oluşturulmuştur. V için parahaemolyticus ve ikinci topuk kısmı özellikleri (MAM7 bağlanmış 2 um boncuk), her iki boncuk ve bakteri elde edilen sitotoksisite değişiklik olmaksızın, aynı anda ilave edilebilir. Yani, bu deney sisteminde, taneler konakçı hücre bağlama bakterileri outcompete. Kullanılan bakteri türleri ve boncuk geometrisine bağlı olarak, iki ayrı adımlar olarak boncuk yapışma ve bakteriyel enfeksiyonu korumak için iyi nedenler olabilir. Örneğin, hareketsiz bakteri hücreleri enfekte etme plakalar genel olarak enfeksiyonun ortam ilave edildikten sonra santrifüje tabi tutulur. Bu hücre tabakası boncuk yüksek ölçüde düzensiz dağılımına yol açar Bununla birlikte, kordon süspansiyonlar ihtiva eden plakalar santrifüj kaçınılmalıdır. Daha küçük parçacık boyutları kullanılıyorsa, boncuk, hücre yüzeyindeki yerleşmek uzun sürer durumda su içindefficient süresi enfeksiyondan önce kordon bağlanması için izin verilmelidir. Bakteriyel yapışma üzerinden oku olarak kullanıldığında, konakçı hücreler önemli ölçüde enfekte eden soyun zarar görmezler burada numuneler bağlı bakterilerin miktarının tehlikeye hücre kopması ve yok edilmesi olarak, zaman noktalarında alınır. Bunun yerine seyreltme plaka ile bakteriyel yapışmayı sıralandıran örnekler alternatif görüntüleme (Şekil 5) işlenebilir. Bu durumda, doku kültürü hücreleri, daha çok, doğrudan kuyulara daha cam kapak slipleri üzerine ekildi edilmelidir. Buna ek olarak, bir flüoresan proteini ifade flüoresan boncuklar ve bakteri enfeksiyonu özel konakçı hücre işaretleri ile birlikte kullanılabilmektedir. Örneğin, rekabet deneyleri genellikle konakçı hücrelerinin aktin hücre iskeleti leke ve floresan mavi boncuk ve floresan ile birlikte, enfeksiyondan kaynaklanan morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için floresan kırmızı rodamin-Phalloidin kullanarak görüntülüYeşil (GFP ifade veya SYTO18 lekeli) bakteriler. Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes ve Streptococcus F1 FUD ve Vibrio parahaemolyticus MAM de dahil olmak üzere topuk kısmı çiftli adezinler bir dizi, yapışma, yapışma inhibisyonu ve yapışma katkı çalışma biomimetik malzemeleri olarak kullanılmıştır patojen aracılı sitotoksisite 1, 7, 8. iskeleler olarak kullanılan polimer taneleri renk (örneğin, mavi, kırmızı flüoresan, mavi, yeşil, turuncu) geniş bir aralığında kullanılabilir, çünkü bu yaklaşımı kullanmanın avantajlarından biri, bağlanma etkinlikleri görselleştirme kolaylığıdır. Bu durumda, işlev müdahale edebilir doğrudan protein etiketleme, önlenebilir. Buna ek olarak, bu şekilde çözünür proteinler ile karşılaştırıldığında fizyolojik olarak daha uygun bir yapıyı yansıtan birleştirme taklit eder bakteriyel yüzey üzerindeki adezinlerin değerlikli görüntü yüzey. Bozulmamış bakteri veya bacteri kullanıldığı çalışmalarda karşılaştırıldığındaal mutantlar, boncuk yaklaşımı bakteriyel büyüme ile ilgili sorunları circumvents. Olumsuz konak hücrelerini etkiler büyüme ortamı ve besin tüketme asitlenme ve bakteri çoğaltma sonunda ödün - Örneğin, uzun vadeli (örneğin, O / N) sağlam bakterileri kullanarak hücrelerin barındırmak için bakteriyel yapışma çalışmalar genellikle bakteri gelişimini eşlik olayların tarafından tehlikeye görüntü kalitesi. Daha yakın zamanda, boncuk çiftli adezinlerin kullanımı bakteriyel eklenme alt sinyalleme işlemlerinin rol oynayan konak hücre faktörlerinin meyil saflaştırılması için bir araç olarak kullanımını içerecek şekilde genişletilmiştir. V. parahaemolyticus MAM7 konakçı hücre zarında fosfatidik asitler bağlanarak, RhoA aktivasyonu ve aktin yeniden düzenlemeleri 1, 3 tetikler. MAM çiftli taneler arındırmak ve MAM-konakçı hücre bir sonucu olarak bir araya toplanan sinyal platformları katılan proteinleri tanımlamak için kullanılmaktadır bağlama. Boncuklar can berikolayca kısa santrifüjleme aşaması süpernatanından ayrılması ve ilgili protein kovalent bağlanan, bu tür proteomik veya Western gibi alt uygulamalar için kullanılabilir, ilgili protein kompleksleri kirletici proteinlerden ayrılmasını sağlamak ve zenginleştirmek için iyi bir yöntem olup, Kurutma.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

V. parahaemolyticus adezinin MAM7 konak yüzey reseptörleri tanınması katılan yedi tandem memeli hücre girişi (MCE) etki içerir. Bu V ile rekabet etmek için, bu malzemelerin kabiliyetini test etmek için yedi ardışık MCE etki (MAM7) ya da sadece ilk MCE alanını (MAM1) ya da polistiren kapsayan rekombinant bağlanmış boncuklar, saflaştırılmış fragmanlar kullanılır bağlama konakçı hücre için parahaemolyticus ve yapışma inhibitörleri olarak, bu maddelerin elde edilen etkinlik. Hela hücreleri V. ile enfekte edildi in vitro enfeksiyonundan kaynaklanan parahaemolyticus streyn POR1 ve sitotoksisite 4 saat (Şekil 3) sonra değerlendirilmiştir. % 0.1 Triton X-100 (pozitif liziz kontrol) Hela hücrelerinin tedavisi tam hücre lizizi ile sonuçlanmıştır, enfekte olmamış hücreler POR1 ile muamele edilmemiş olan hücreler üzerinde in vitro enfeksiyonu hücre lizizi çok yüksek seviyelerine yol açtı. Sitotoksisite, çok düşük seviyelerde gösterilir ve bu MAM7-co ile inhibe edilmiştirboncuklar upled ancak MAM1-bağlanmış olmayan ya da GST-bağlanmış kontrol tanesi (Şekil 3). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Vibrio parahaemolyticus Şekil 3. Karakterizasyonu rekabet deneyleri sırasında epitel hücrelerinde sitotoksisitesine neden olmuştur. Hücreler, V ile tedavi edildi parahaemolyticus (Vp), (+) ile gösterilir, ya da bakteriler (-) farklı rakip öğeler (. bileşik) mevcudiyetinde gösterildiği gibi. Bunlar ya hiç comp dahil. (-), MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST). Kontroller olarak, hücreler Triton X-100 (triton, liziz kontrolü) ya da muamele edilmiş ya da enfekte edilmeden (uninf) kalmıştı. Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi 4 saat sonra LDH salınımı ölçüldü ve sonuçlar Triton kontroller (% 100) ve yukarıda tarif edildiği gibi boşlukları (% 0) normalize edilmiş. Sonuçlar üçlü deneylerden elde edilen ortalama ± SEM araçlardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> V. numaralandırma MAM7-, MAM1-, ya da GST Kontrol taneleri ile inkübe muamele edilmemiş Hela hücreleri, ya da hücrelerin ya da bağlı parahaemolyticus MAM7 boncuklar fakat MAM1- olmayan ya da GST kontrol tanesi, V outcompete ortaya eki için parahaemolyticus hücre yüzey reseptörleri (Şekil 4) ev sahipliği yapacak. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Yarışma deneyler sırasında bakteriyel ekin Şekil 4. Karakterizasyonu. Hela hücreleri V ile enfekte edildi parahaemolyticus yokluğunda POR2 (Vp +), (-) ya da birim rekabet mevcudiyeti aşağıdaki gibi MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST) (blş.). Bakteriyel yapışma olarak 1 saat sonra ölçülmüştür<html> bölümünde anlatılan 3. Sonuçlar üçlü deneyler ± SEM araçlardır. Araçlar (CFU / ml FLTR) 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6 bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Fluorofor etiketli boncuklara bağlanmış adhesinler konukçu hücrelere bakteriyel yapışmayı taklit ve hücresel görüntüleme (Şekil 5) güçlü araçlardır maddelerin oluşumuna yol açar. MAM7-birleştiğinde floresan mavi boncuk kullanarak, epitel hücrelerine MAM7 aracılı eki sürecini karakterize. Konukçu hücrelere MAM7 bağlanması yeniden düzenlenmesi ve birlikte görüntülenmiştir F-aktine (Şekil 5B) için leke rodamin Phalloidin kullanıyorlardı stres elyafların biçimlendirilmesine aktin ile sonuçlanmıştır. _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Hela için MAM7-birleştiğinde boncuk Şekil 5. hazırlanması ve floroforun kullanımı floresan mavi biomimetic boncuk (A) Süspansiyon (sağ tüp, 10x stok). Görüntüleme amaçlı biomimetic boncuk etiketli ve kontrol (sol tüp) tampon. (B) Ek aktin düzenlenmeleri ve stres lif oluşumu hücreler sonuçları. (Rodamin-Phalloidin ile boyanmış kırmızı) floresan mavi boncuk Bağlanma ve elde edilen aktin stres lifleri mikroskobu ile görüntülendi. Bar, 10 um. Panel B Görüntüler Lim ve ark. 1 uyarlanmıştır ve Creative Commons Attribution lisansı altında yeniden üretildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions at JoVE.com

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K Görüntüleme.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

Video: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...