Protokolümüz, kıkırdak dokusunun doğasına çok benzeyen hidrojellerde hastalık oluşturulmasını sağladığı için önemlidir. Bu tekniğin ana avantajı, mekansal yapıda belirgin biyolojik aktiviteye, düşük immünojenisiteye ve biyolojik endüstriyel fonksiyona sahip hidrojellerde hastalık üretme yeteneğidir. Başlamak için, toplanan kıkırdağı bir neşter kullanarak bir ila iki milimetre küp büyüklüğünde parçalar halinde doğrayın.
50 milimetrelik bir santrifüj tüpünde, 20 mililitre hipotonik Tris-hidroklorür tamponuna 20 gram kıyılmış kıkırdak daldırın. Tüpü üç saat boyunca 80 santigrat derecede ve ardından üç saat boyunca 37 santigrat derecede fırına koyun. Santrifüj tüpünü 1000 RPM'de 30 saniye vorteksleyin.
Ardından, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş plastik bir elek kullanarak hücrelerden arındırılmış kıkırdağı süzün. Kıkırdağı toplamadan önce steril PBS ile üç kez yıkayın. Toplanan kıkırdağa 10 mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve her dört saatte bir tripsin değiştirerek 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
Süspansiyonu filtreledikten sonra, tripsinizli kıkırdağı hipertonik tampon ile yıkayın. Kıkırdak korunduktan sonra, 10 mililitre nükleaz çözeltisi ekleyin ve dört saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıya koyun. Steril PBS ile yıkadıktan sonra, kıkırdağa hipertonik Tris-hidroklorür çözeltisi ekleyin ve gösterildiği gibi çalkalayıcıya yerleştirin.
Steril PBS ile yıkandıktan sonra, dokuyu 24 saat boyunca% 1 Triton X-100 çözeltisine batırın. Triton X-100'ü çıkardıktan sonra, hücreden arındırılmış kıkırdağı üç gün boyunca damıtılmış suyla durulayın ve suyu her 12 saatte bir değiştirin. Üç gün sonra, kıkırdağa perasetik asit çözeltisi ekleyin ve dört saat bekletin.
PBS ile yıkandıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi plastik bir elek kullanarak kıkırdağı toplayın. Sıvı nitrojen kullanarak, hücrelerden arındırılmış kıkırdak tozu hazırlayın. İki gram kıkırdak tozuna 80 mililitre 0.5 molar asetik asit ve 20 miligram pepsin ekleyin ve karışımı 37 santigrat derecede 24 saat sindirin.
Sindirimden sonra, süspansiyonu 400 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve şimdi DC-ECM çözeltisi olarak adlandırılan süpernatanı toplayın DC-ECM çözeltisini saklamak için, altı oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir mililitre çözelti ekleyin ve bir liyofilizatöre yerleştirin. Çözelti dondurularak kurutulduktan sonra bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir hidrojel oluşturmak için, 20 miligram dondurularak kurutulmuş DC-ECM çözeltisini bir mililitre steril damıtılmış suda çözün.
Girdap haline getirildikten sonra, DC-ECM çözeltisine bir miligram B2 vitamini ekleyin. İnkübasyondan sonra, üç dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın. 20 miligram DC-ECM kıkırdak tozuna tampon GTL ve proteinaz K ekleyin ve vorteks salınımı kullanarak iyice karıştırın.
Kıkırdağın tamamen çözünmesi için, karışımı dört saat boyunca 56 santigrat derecede inkübe edin. Girdap haline getirildikten sonra, 200 mikrolitre tampon GTL ve ardından susuz etanol ekleyin. Girdaptan sonra, numuneyi dört santigrat derecede bir dakika boyunca 6000 G'de santrifüjleyin.
Daha sonra DNA'yı el yazmasında açıklandığı gibi toplayın ve ölçün. Kollajeni analiz etmek için, beş miligram DC-ECM tozunu hidroklorik asit içinde 100 santigrat derecede 20 dakika asitleştirin. Daha sonra beş mililitre altı molar sodyum hidroksit çözeltisi ile nötralize edin.
Hidroksiprolin standardına karşı 570 nanometrede absorbans kullanarak nötralize edilmiş numunenin hidroksiprolin içeriğini hesaplayın. Karıştırdıktan sonra 200 miligram DC-ECM tozuna 500 mikrolitre reaktif A ekleyin. Numuneyi dört santigrat derecede 16 saat inkübe edin.
Santrifüjlendikten sonra, 50 mikrolitre numune çözeltisi toplayın ve 50 mikrolitre reaktif B, ardından reaktif C ekleyin.Numuneyi 10 dakika inkübe ettikten sonra, 750 mikrolitre reaktif D ekleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Santrifüjlemeden sonra, pelete bir mikrolitre reaktif E ekleyin ve santrifüjlemeden önce iyice karıştırın. Ardından, GAG içeriği ölçümünden önce numuneyi ayırın.
Hazırlanan DC-ECM kıkırdağında DNA içeriği önemli ölçüde ortadan kaldırıldı. Bununla birlikte, doğal kıkırdak ile karşılaştırıldığında kollajen ve GAG içeriği korunmuştur. SEM ve TEM analizleri, hazırlanan DC-ECM'nin ultra yapısını ortaya koymuştur.
Ters çevrilmiş tüpte hazırlanan hidrojel dibe akmadı, böylece jelleşme gösterdi. Ayrıca, sadece DC-ECM çözeltisi ile karşılaştırıldığında, B2 vitamini ilavesi, DC-ECM hidrojel oluşumu sırasında indüklenen çapraz bağlanma nedeniyle jelleşme süresini azalttı. DC-ECM hidrojel viskozitesi, çözelti viskozitesinden daha yüksekti ve artan kesme hızları, çözelti viskozitesini azalttı.
Ayrıca, DC-ECM çözeltisinin ve hidrojelin yüksek depolama modülü, her ikisinin de sıvı özelliklerden ziyade jel özelliklere sahip olduğunu gösterdi. SEM analizi, DC-ECM çözeltisinin gözenek boyutunun, çapraz bağlama ve dondurarak kurutmadan sonra hidrojel formunda önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Protokol, ECM'nin yapısını ve konuşmasını korurken hücresel materyali uzaklaştırmak için fiziksel ve kimyasal bozulma ve enzimatik sindirimin bir kombinasyonunu içerir.
