Proliferasyon hücre fonksiyonunun önemli bir ölçüsüdür. Bu protokol, araştırmacıların ticari olarak mevcut kitlerin yüksek maliyeti olmadan laboratuvarlarında hassas bir proliferasyon tahlilleri geliştirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin sert muameleve / veya radyoaktivite kullanımını önler olmasıdır.
Bu tekniği göstermek Vicky Wong olacak, laboratuvarımda müdür. Proliferasyon tahnit etmek için, 96-iyi plaka dmem mililitre başına 20, 000 hücreleri 20, 000 hücreleri% 2 fetal sığır serum ve plaka düz kas hücresi media ile bir şişe vasküler düz kas hücreleri kaldırmak. Hücreleri bir gecede 37 derecede büyütün.
Çoğalmayı teşvik etmek için olumlu bir kontrol olarak üç ila altı kuyulara mililitre trombosit elde edilen büyüme faktörü başına 30 nanogram ekleyin. Ardından PBS'yi negatif denetimle aynı sayıda kuyuya ekleyin. 72 saat kuluçkaya yat.
Seyreltik daha önce bir milimolar için beş milimolar EdU stok hazırlanan ve 72 saatlik kültür döneminin son 24 saat için her kuyu ya iki mikrolitre ekleyin. Arka plan floresansını ve Parlaklığı belirlemek için EdU olmadan bir dizi çoğaltma tutun. Yirmi dört saat sonra, medya kaldırarak hücreleri düzeltmek, sonra% 4 paraformaldehit kuyu başına 150 mikrolitre ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
Paraformaldehit çıkarın ve kuyu başına su ve 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka 150 mikrolitre ekleyin. TX-100'ü çıkarmak için PBS ile üç kez yıkayın. Floresan kullanarak dahil EdU tespit etmek için, doğru sırada stok çözeltileri reaktifler ekleyerek kullanmak için hemen önce 96-iyi plaka başına etiketleme çözeltisi 10 mililitre yapmak:20 mikrolitre THPTA, 20 mikrolitre bakır sülfat, beş mikrolitre floresan pikolyl-azis, ve 100 mikrolitre sodyum ascorbate pbs içine toplam 10 mililitre mililitre mililitre lik itme alanı.
En kritik adım, etiketleme çözümlerini kullanmadan hemen önce yapmaktır. PBS'yi kuyulardan çıkarın, her kuyuya 150 mikrolitre etiketleme çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tüm çekirdekleri algılamak için, floresan mikroskop veya görüntüleme plakası okuyucuüzerinde her kuyuya VE görüntüye DAPI ekleyin.
Manuel sayma önlemek için ve bir görüntüleme plaka okuyucu mevcut olmadığında, bu protokol HRP azide ve ELISA substrat kullanarak bir parlaklık okuma değiştirilebilir. Luminscence kullanarak EdU'yi tespit etmek için öncelikle %0,1 polisorbat 20 ile tris-tamponlu salin hazırlayın. Daha sonra her kuyuya 150 mikrolitre bloke tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın.
Engelleme tamponu çıkardıktan sonra hücreleri 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Dahili EdU'yu tespit etmek için, ilk olarak stok çözümlerinden doğru sırada reaktifler ekleyerek 96 kuyulu plaka başına 10 mililitre etiketleme çözeltisi hazırlayın. İlk olarak, 20 mikrolitre THPTA, sonra 20 mikrolitre bakır sülfat, beş mikrolitre biotin pikol-azid, 100 mikrolitre sodyum 10 mililitre toplam hacmi için PBS içine akorbat.
Sallayarak TBST 200 mikrolitre ile beş kez üç dakika kuyuları yıkayın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca % 0.3 hidrojen peroksit 150 mikrolitre ile endojen peroksidazları söndürün. Hidrojen peroksit çıkardıktan sonra, sallayarak TBST 200 mikrolitre ile beş kez üç dakika yıkayın.
Her iyi ve bir saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka tbst seyreltilmiş streptavidin-horseradish peroksidaz 50 mikrolitre ekleyin. Sallayarak TBST 200 mikrolitre ile beş kez üç dakika yıkayın. Her kuyuya 50 mikrolitre kemilüminesans ELISA substratı ekleyin ve lüminesans algılayabilen bir plaka okuyucuda hemen okuyun.
Floresan çekirdekleri standart bir floresan plaka okuyucu tarafından tespit edilebilse de, lüminesans protokolü kullanılarak floresan tazyik, streptavidin-horseradish peroksidaz ve standart ELISA substratı ile saptanan homojen sıvı okumaya dönüştürülür. Floresan okuma ile karşılaştırıldığında bu yöntemin avantajı daha homojen bir okuma ve plaka pdgf yanıt olarak VSMC çoğalması ölçüldüğünde burada görüldüğü gibi saniyeler içinde okunabilir. Dezavantajı arka plan floresan ile daha yüksek olmasıdır, bu nedenle negatif kontroller daha yüksek olma eğilimindedir.
Değişkenliği azaltmak amacıyla sonuçlar ilk hücre sayılarına göre normalleştirildi. Ancak, ayrı bir deneme kümesinde, bu yöntemin hücre sayılarında küçük farklılıkları algılayacak kadar hassas olmadığı gösterilmiştir. EdU pozitif ve toplam hücreleri saymak için en verimli ve doğru yolu bir görüntüleme plaka okuyucu kullanarak.
Bu tür plaka okuyucu kullanılamıyorsa, manuel sayma da doğru sonuçlar verecektir. Bu iki yöntem karşılaştırılırken, EdU pozitif manuel sayısı toplam uyarlanmamış sayımlar ile otomatik sayım ile aynıydı. Bu iki yöntemin avantajı, sayılacak hücrelerin görünürlüğü, doğruluğun iyileştirilmesi ve enkazın spesifik olmayan boyanması görülebilmekte ve önlenebilir.
Manuel sayma yönteminin en büyük dezavantajı zaman. Etiketleme çözümünü kullanmadan hemen önce taze yapmayı unutmayın ve maddeleri yazılı protokolde verilen sıraya ekleyin. Boyama yoğunluğu loşsa, şelatörü bakır oranına göre ayarlamayı deneyin.
Paraformaldehitin toksik olduğunu unutmayın. Eldiven giyerken duman kaputunda kullanılmalıdır. Yordamın kendisi zor değildir, ancak etiketleme çözeltisindeki bakır oranlarına göre şelatör ayarlayarak optimize edilmesi gerekebilir.
Buna ek olarak, kuluçka süreleri ve EdU tedavisinin uzunluğu hücre tipine ve sorulan özel soruya bağlı olarak ayarlanabilir. Bu teknik hücre yüzeyi ve hücre içi boyama ile uyumludur, böylece bölünen ve bölünemeyen hücrelerin özellikleri belirlenebilir. Yaygın olarak proliferasyon ölçmek için kullanılmasına rağmen, tıklama kimyası da RNA, proteinler, yağ asitleri ve karbonhidratmetabolik etiketleme için kullanılabilir.
Eğer metabolik hedef hücre yüzeyinde yse, canlı hücreler etiketlenebilir.
