Bu yöntem biyolojik örnekleri yerli bir ortamda tutar ve elektron ışını kaynaklı objeyi azaltır. Ana avantajı bu tekniğin tüm hücreler için geçerli olmasıdır. Yani elektron mikroskobundan önce hücrelerin susuz, lekeli veya kesitli olması gerekmez.
Tüm bozulmamış plazma membran bağlamında kanser hücreleri üzerinde görüntü reseptörleri yeteneği yeni tedavi yaklaşımları ve yeni antikanser ilaçların geliştirilmesine yol açabilir önemli bir yönüdür. Hücreleri, grafen kaplama ve mikroskopi ile çalışmaları mı göstereceğim, Sercan Keskin ise grafenin nasıl hazırlanacağını gösterecektir. Başlamak için, silikon nitrür membran yukarı bakan ve serum içermeyen orta 50 mikrolitre ile PLL ve FLP kaplı mikroçipler içeren 96 kuyu plaka iki kuyu hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin.
Hücrelerin mikroçipe bağlanmasıiçin plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle beş dakika kuluçkaya yatırın. Ters mikroskopla mikroçipteki hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin ve hücrelerin pencereyi düzleştirmek ve yapışmak için yeterli alana sahip olmasını sağla. HÜCRELERDE HER2 etiketlemek için, etiketleme plakasının ilk satırının kuyularına mikroçipleri yerleştirin.
Daha sonra mikroçipleri PBS BSA ile yıkayın. Antikor mimetik spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için mikroçipleri PBS BSA GS ile beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra 200 nanomolar antikor mimetik ile 10 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit.
Polimer PMMA grafen kaldırmak için, pipet PMMA grafen etrafında polimer üzerinde su birkaç damlacıkları. Daha sonra, PMMA grafen serbest bırakmak için 30 ila 45 derecelik bir açı ile suya batırın. Bakır bazlı kirleticileri eforlamak için, suda 0,42 molar sodyum persülfat 50 mililitre çözeltiprepair.
PMMA grafenini sodyum persülfat çözeltisine, grafen tarafı aşağı yassı bir şekilde aktarmak için standart bir cam kaydırak kullanın. PMMA grafeni çözümün en üstüne yüzer. Bir gece orada bırak.
Ertesi gün, PMMA grafenini sodyum persülfat çözeltisinden temiz suya aktarın. Yarım saat suda yüzsün. PMMA grafenintüm sodyum persülfat kalıntılarını çıkarmak için toplam üç kez yıkayın.
Sonra, PMMA grafenini sodyum klorür kristaline aktarın. Petri kabındaki suda doymuş sodyum klorür çözeltisi hazırlayın ve pmma grafenini grafen tarafı aşağı ile çözeltinin üzerine aktarın. Sodyum klorür kristalini cımbızla tutun ve yüzen PMMA grafenini toplayıp.
Daha sonra, aşırı su akışını sağlamak için iki dakika dikey olarak tutun. 30 dakika oda sıcaklığına kadar kurumasını bekleyin ve 100 derecede 20 dakika fırında pişirin. Suyu tamamen çıkarın.
Bir cam Petri kabında asetonu duman kaputundaki bir sıcak tabakta yaklaşık 50 dereceye ısıtın. Yangından kaçınmak için sıcaklığı dikkatle izleyin. PmMA grafenini tuz üzerine aseton dolu Petri kabına batırın ve PMMA'yı 30 dakika eritmeye bırakın.
Numune hazırlama için kullanmadan önce grafenin tuz üzerinde iyice kurutulmasına izin verin. Tampondan tuz artıklarını çıkarmak ve filtre kağıdına yerleştirmek için hazırlanmış ve etiketlenmiş bir mikroçipi saf suda yıkayın. Hücreler koyu noktalar olarak görünür olmalıdır.
Sodyum klorür kristalindeki çok katmanlı grafeni bir mikroçipin silikon nitrür penceresine uyan bir parçaya kesmek için jilet kullanın. Grafeni sodyum klorür kristalinden çıkararak bir su kabına batırın, kristali yüzeye göre 45 derecelik bir açıyla yatırın. Su yüzeyinden metal bir döngü ile grafen yakalamak, sonra alt döngü yüzeyi ile mikroçip üst yüzeyine dokunun, mikroçip metal döngü sopa neden.
Grafen mikroçipin üstünde görülebilir. Stereomikroskop altında, grafensilikon nitrür penceresindeki tüm hücreleri kapsayacak şekilde mikroçipten kalan suyu çıkarmak için filtre kağıdı kullanın. Mikroçipi cımbızlı bir filtre kağıdına yerleştirin.
Grafen mikroçip üzerinde mor bir Parıltı olarak görülebilir. Mikroçipi kağıttan bir bölme Petri kabına aktarın. Pipet serbest bölmelerinden birine bir damlacık su ve su doymuş bir atmosfer sağlamak için kapağı kapatın.
Daha sonra, parafin film ile bölme çanak mühür ve buzdolabında dört derece santigrat saklayın. Kondansatör merceçlerini ayarlayarak en az 0,2 nanometre lik bir prob boyutuiçin bir hizalama örneği kullanarak STEM'i 200 kilovolt'luk ışın enerjisine ayarlayın. Bir diyafram ekleyerek 180 Picoampere ve 13,2 miliradians bir ışın yakınsama yarı açı bir sonda akımı ayarlayın.
Projektör lens ayarlarını ayarlayarak ADF STEM dedektörü açma yarı açı aralığını 68-280 miliradan'a ayarlayın. Ardından, STEM görüntü boyutunu 2048 piksele 2048'e, pikselin ise altı mikrosaniyeye kadar süresini ayarlayın. Mikroçipi grafen kaplı hücrelerle tem için standart bir numune tutucuya, hücreler yukarı bakacak şekilde yükleyin ve tutucuyu elektron mikroskobuna yükleyin.
800 X büyütme de genel bir resim edinin. Daha sonra, 1,3 nanometre piksel boyutu ile 80, 000 X kuantum nokta nano tanecikleri ilgi ve görüntü bir bölge tanımlayın. En iyi şekilde tohumlanmış hücreler burada gösterilir.
Pencere kapalıdır, ancak düzleştirmek ve uymak için yeterli alan vardır. Bir mikroçipüzerinde çok fazla hücre tohumlandığında, tüm hücrelerin yapışması için yeterli alan yoktu. 24 saat sonra hücrelerin yarısından fazlası düzolmadı.
Çok az hücre tohumlu ise, silikon nitrür penceresi 24 saat sonra büyük bir boş alan ile sona erecek. Dic ve en iyi tohumlanmış hücrelerin floresan görüntüleri burada gösterilmektedir, HER2 başarılı etiketleme gösteren. STEM grafen kaplı ve kaplamasız SKBR3 hücrelerinde yapıldı.
800 X büyütme görüntülerindeki insets 80, 000 X.Kuantum nokta nano tanecikleri 50, 000 X büyütme parlak noktalar olarak görülebilir görüntülendi. Elektron ışını aydınlatmasının numune üzerindeki etkisini araştırmak için STEM görüntüleri biriken elektron dozu ile bir görüntü serisinde elde edilebildi. Kaplamalı olmayan ve grafen kaplamalı numuneler için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir.
Kaplamasız örneklerin pozması, grafen kaplı örneklerin hiçbirinde oluşmayan hücre yüzeylerinde parlak yapılara yol açmıştır. Parçacık çiftlerin ortalama göreceli mesafe değişimi kaplamasız numuneler için %1,3'ün altında, kaplamalı numuneler için ise %0,8'in altında kalmıştır. Bu işlemden sonra, diğer mikroskopi yöntemleri kullanılarak tüm hücrelerde farklı türde membran proteinleri görüntülenebilir.
Bu teknik, plazma zarının organizasyonu ve proteinler arasındaki etkileşim hakkında daha fazla bilgi edinmek için bozulmamış plazma zarındaki proteinlerin görüntülemimümkün kalmıştır.
