Bu yöntem çok gelişmiştir. Doku mühendisliği, serbest generatif terapi ve ilaç taraması gibi biyoteknoloji alanında bölümlere sahiptir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek düze boyuttaa agregaların basit, süspansiyon kültüründe üretilebiliyor olmasıdır.
Bu tahta yörüngesel sallayarak süspansiyon kültüründe memeli hücrelerinin tek tip agrega üretimi için roman O-şekilli damarların olasılığını temsil eder. Konvansiyonel gemilerle orbital sallayarak kültürde, dairesel akış orta yüzeyin santrifüj kuvvet nedeniyle oluşur, ve bu orta akış damarların merkez-alt doğru hücreleri aktarır. Bu etki iyi Einsteins çay yaprağı paradoksu olarak bilinir.
Bu etki hücrelerin merkez-alt ve homojen toplama hücrelerin aşırı birikimine neden olur. Öte yandan, O-şekilli damarlar orta-alt bölgeye orta akım süpürme hücreleri önler merkezi bölge ortadan kaldırır. Bu homojen toplama gerçekleştirebilirsiniz hücrelerin birikimini sınırlar.
Oturtulacak her bir kap için 25 santimetre karelik hek-293 hücreleri ile başlayın. %0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak hücreleri ayrıştırın ve santrifüj yoluyla hücreleri toplayın. Ortaya çıkan peleti bir mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın.
Tek hücreli süspansiyon toplamak için hücre süspansiyonuna 40 mikronluk bir süzgeçten süzün. Hücre süspansiyonunun bir aliquot'una Trypan mavisi ekleyin ve hücre sayısını gerçekleştirin. Daha sonra 2 kez 10 mililitre mililitre lik hücre süspansiyonu hazırlayın.
O şeklindeki çantanın girişini kelepçeli 50 mililitreşile bağlayın ve sonra pistonu ayırın. Hazırlanan hücre süspansiyonuna kenetlenmiş şırınga aracılığıyla O şeklindeki torbaya indirin. İlk kelepçe şırıngasını temiz bir şırıngayla değiştirin.
Tamamen çanta genişletmek için temiz şırınga ile hava 55 mililitre ekleyin. Giriş tüpünü çırpın ve girişi kapatın. Son olarak, kelepçeyi tüpten çıkarın.
35 santigrat derece ve% 5 karbondioksit koşullarında 45 rpm sallayarak O-şekilli torbadaki hücreleri kuluçka. Hücrelerdeki ortamı değiştirmek için, önce hücre süspansiyonuna giriş yoluyla 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonra oda sıcaklığında 200G iki dakika santrifüj.
Supernatant aspirating sonra, kültür orta 20 mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya. Daha önce olduğu gibi O-şekilli torbaya resuspended hücreleri ekleyin ve sallayarak inkübatör için mühürlü çanta dönmek. Hücreleri toplamak için, daha önce olduğu gibi, giriş yoluyla 50 mililitrelik bir tüp içine hücre süspansiyon aktarın.
Kalsiyum 20 mililitre ile çantanın içini yıkayın, magnezyum içermeyen fosfat-tamponlu tuzlu ve sonra torbadan kalan hücreleri toplamak için bir tüp içine içeriğini drenaj. Toplanan hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 200 kat G'de üç dakika santrifüj edin ve sonra süperat aspire edin. Kalsiyum 10 mililitre ekleyin, magnezyumsuz PBS ve agregaları izleyin.
Daha önce olduğu gibi santrifüj sonra, supernate çıkarın ve agregalar içeren pelet bırakın. Hücre sayısı gerekiyorsa, dört mililitre PBS ve bir mililitre Trypsin ekleyin ve hücreleri saymak için ayrıştırmak için 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Deneysel ölçümler, konvansiyonel çanak yetiştirilen agregalar, orbital sallayarak beş gün sonra çeşitli çapları olduğunu göstermektedir.
Buna karşılık, agregalar O-şekilli yemekler veya çanta beş gün boyunca yetiştirilen, çok daha düzgün çapları vardı. Görüntü tabanlı boyut ölçümüne göre, geleneksel çanak kültürü iki farklı zirve göstererek toplam boyutunda geniş bir sapma olduğunu göstermiştir. Öte yandan, O-şekilli tabaklar ve O-şekilli torbalarda agregalar, bu tür agregalar daha düzgün kalitede olabileceğini düşündüren, geleneksel çanak daha tek bir tepe ve çapı daha az sapma gösterdi.
Agrega kesitlerinin hematoksilin ve eozin boyaması, konvansiyonel çanakta yetişen agregaların bazı nükleoz hücrelere ve nekrotik seyretlere sahip olduğunu gösterdi;ancak O-şekilli damarlarda yetiştirilen agregalar herhangi bir nekrotik seyretmedi ve O şekilli torbada yetiştirilen agregalar geleneksel çanaktakiler kadar büyüktü. Hücre sayımları, hücrelerin %85'inden fazlasının her bir kapta beş günlük süspansiyon kültürü boyunca hayatta kaldığını gösterdi. Bu video basit süspansiyon kültüründe memeli hücrelerinin tek tip site agregaları üretimi için yeni O-şekilli damarları işlemek için nasıl gösterir.
