Bu yöntem, gen adayları, virüsler veya kan testis bariyer fonksiyonunu veya bütünlüğünü etkileyebilecek çevresel toksinler hakkında biyoloji alanlarının kan testibariyerindeki anahtar soruların yanıtlatılabilir. Ameliyattan üç gün önce, en az üç sekiz haftalık C57Black/6 erkek fareleri günlük olarak vücut ağırlığı kadmiyum klorür başına beş miligram intraperitoneal enjeksiyon ile tedavi edin. Ameliyat günü, %75 etanol sterilize edilmiş cerrahi alanın üzerine temiz bir doku yerleştirin ve termostatik ısıtıcıyı 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Doku üzerine bir anestezili fare yerleştirin, sonra parmak sıkışma yanıt eksikliği onaylamak. Bir tıraş makinesi ile karın saç tıraş ve% 75 etanol ile maruz kalan cilt dezenfekte. Karın duvarını ortaya çıkarmak için preputial bezlerin üzerinde bir santimetrelik deri kesi yapmak ve periton 0.5 santimetrelik bir kesi yapmak için cildi kaldırmak için küçük forsepskullanın.
Epididim ve testis etrafında yağ pedleri aramak için forseps kullanın, dikkatle bir ekli testis ortaya çıkarmak için yağ yastıkları çekerek. Yağ pedleri ve testis altında dokuz santimetrelik bir kağıt parçası yerleştirin ve taze hazırlanmış inulin-FITC çözeltisi ile bir mikroenjeksiyon pipet yükleyin. Pipeti bir mikromanipülatör ünitesine bağlayın ve mikroenjeksiyon pipet ucunu tunica albuginea'nın altına hafifçe yerleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
Testisinterstitium içine inulin-FITC 20 mikrolitre teslim etmek için yavaş yavaş çalışma kolu döndürün. Teslimat başarılı olursa, testis parlak yeşil-sarı renk dönecektir. Hemen karın boşluğuna testis dönmek ve pbs 20 mikrolitre ile kontralateral testis enjekte, sonra cerrahi bir dikiş ile cilt kapatın.
Ve fareyi termostatik ısıtıcının ısı yastığının üzerine yerleştirin. Enjeksiyondan 40 dakika sonra, her fareden testisleri toplamak için keskin makas kullanın ve dokuları bir mililitre buz gibi PBS'de yıkayın. Daha sonra, 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit testislerini düzeltin ve ardından yıkama başına %1 PBS'nin 1,5 mililitresinde üç yıkama yapın.
Bir gecede %30 sakaroz dehidratasyonundan sonra, numuneleri tek tek gömme çerçevelere aktarın ve dokuları optimum kesme sıcaklığı bileşiğiyle kaplayın. Bir kriyostat'ın sıcaklığını negatif 20 santigrat dereceye ayarlayın ve kareleri OCT dondurulana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca kriyostatta yerleştirin. Daha sonra, tüm testis her kalıp kaplı olana kadar taze OCT ile her gömme çerçeve doldurun.
OCT'nin ikinci katmanı donduğunda, her testisin beş mikrometre kalınlığındakesitlerini elde ederek doku kesitlerini cam mikroskop slaytlarına geçirin. Örnekleri görüntülemek için, önce slaytları oda sıcaklığında nemli bir kutuda ısıtın. 10 dakika sonra, slaytları her yıkama da taze Tris-tamponlu tuzlu üç kez yıkayın ve bölümlerin ışıktan korunan beş dakika kurumasını bekleyin.
Artık tuzlu eti çıkarmak için tozsuz kağıt kullanın ve numuneleri DAPI destekli montaj ortamına monte edin. Daha sonra, her numuneyi ters bir kapak fişiyle kaplayın ve bir konfokal mikroskobun 20X hedefi altında örnekleri görüntüleyin. Kadmiyum klorür tedavisi üç gün kan-testis bariyerinde inulin-FITC difüzyon bazal bölmesi seminiferous epitel apikal bölmesi sağlayan hasara neden olur.
Buna karşılık, bu difüzyon kontrol PBS tedavi testislerinde bloke edilir. Kan-testis bariyer hasarının boyutu, inulin-FITC difüzyonmesafesinin aynı seminiferous tübülün yarıçapına oranı hesaplanarak belirlenir. Ayrıca, heterozigot Rictor'daki sağlam kan testi bariyeri, nakavt farebloklarını bariyer boyunca apikal bölmeye doğru itmiyet emdirirken, koşullu Rictor nakavt farelerin inulin difüzyonuna izin veren kan testis bariyeri vardır.
Bu prosedürü denerken, deney günü hazırlanan inulin-FITC'yi teslim etmeyi ve FITC ışığa duyarlı bir molekül olduğu için dokuyu ışıktan korumayı unutmamak önemlidir. Bu tekniğin etkileri bozulmuş spermatogenezin tedavisine kadar uzanır, çünkü kan-testis bariyerinin işlevi spermatogenezde meyyozisin tamamlanması için bağışıklık ayrıcalıklı bir mikroortam sağlamaktır. Gelişiminden sonra, bu teknik farelerde subfertilite ve kısırlık keşfetmek için üreme tıbbı alanında araştırmacılar için bir yol sağlar.
Paraformaldehitlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken giysi ve yüz maskesi takmagibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
