I thank Dr Adamantios Mamais for extracting &#945;-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.

Otopsi beyin dokusu nörolojik bozukluklar için Kraliçe Meydanı Beyin Bankası bağışlandı, University College London, etik onaylı protokolleri kullanarak Nöroloji Enstitüsü, insan dokusu yetkilisi tarafından verilen bir lisans altında araştırma için depolanan (HTA) İngiltere (no. 12198). Bu protokol (Tablo 1) için kullanılan olguların listesine bakın. Tamponlar 1. Hazırlık <ol><li> 1X TBS (Tris-tamponlu tuzlu su) tamponunu hazırlayın: <ol><li> 500 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1.500 mM NaCI stok çözeltisi olarak 10X TBS hazırlayın. <ol><li> Üzerinden 60,5 g Tris-CI, pH 7,6 ve yüksek saflıkta 800 ml su içinde 87,6 g NaCI tartılır. 1 M HCl ile pH ayarlayın ve 1 L. son stok hacmi yapmak </li></ol></li><li> Damıtılmış su içinde stoğu 10 kez seyreltilmesi ile 1X TBS nihai konsantrasyonu hazırlayın. </li><li> Ekle proteaz inhibitörleri (PI), (50 ml tampon için 1 tablet) ile Phos verici fosfataz inhibitörü tablet (1 tablet ml tampon 10) başınaproteaz ve fosfataz spesifik olmayan enzimatik işlemlerden etkilerini ortadan kaldırmak. Not: Burada, üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılabilecek Roche tabletler, ancak eşit şekilde diğer ticari olarak temin edilebilen inhibitörleri inhibitörlerinin kullandık. </li></ol></li><li> (PH 7,4), 1X TBS ile / Sodyum dodesil sülfat v (SDS) w tamponu% 5 ekleyerek TBS-SDS tamponu hazırlayın. SDS çözündürülmesi için bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, sabit karıştırma ile 60 ° C&#39;ye kadar çözelti ısıtılır. </li><li> 8 M / 1X TBS-SDS tamponu için hacim (pH 7.4) bir son konsantrasyona kadar üre eklenmesi ile TBS-SDS-üre tamponu hazırlayın. Üre çözülmesi için bir manyetik karıştırıcı üzerinde sürekli karıştırılarak 60 ° C&#39;ye kadar çözelti ısıtılır. </li></ol> 2. Örnek Homojenizasyon ve Diferansiyel Ultrasantrifügasyon Not: işin şu kısmı HTA İngiltere kurallarına göre insan beyin dokusunun işlenmesini gerektirir. Yerel standart operasyon prosedürlerinin tüm ti izlenmektedirmes. Beyin örnekleri negatif basınçta muhafaza edilen bir microcabinet içinde homojenize dondurulmuş beyin blokları ve doku malzemeden kesilir. Tek kullanımlık önlük eldiven, yüz maskeleri, aşırı ayakkabının koruyucuları ve koruyucu gözlük işlem boyunca giyilir. İnsan dokusu atık bertaraf etmek üzere 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav sonra atılır. Diyezler (bisturi bıçakları) çevreleme ve güvenli bertaraf için uygun bir kesici kapta bertaraf edilmektedir. <ol><li> (Bazal ganglion bölgesinden ağırlığı yaklaşık 0.5 g), dondurulmuş insan dokusu bir parça almak ve hızlı bir şekilde, küçük bir petri kabı ve steril bir bisturi bıçağını kullanarak buz üzerinde küçük parçalara (yaklaşık 1 ila 2 mm) içerisine kıyma. Her bir numune için ayrı petri-çanak ve neşter bıçak kullanın. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde kıyılmış doku toplayın ve tüpe buz soğukluğunda 1XTBS tamponu 10 hacim ekleyin. </li><li> 10 sn için 20.000 rpm&#39;de mekanik bir homojenleştirici kullanılarak örnekleri homojenize. 2 dakika için buz üzerinde soğutulur. Bu adımı üç kez tekrarlayıns. Not: homojenize edildi örnekleri kadar ısıtılır değildir ki bu yapılır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleme ile açıklığa kavuşturulması. Olmayan homojenize malzeme pelet atın. </li><li> Süpernatant (ham homojenat) alın, (tüp boyutu rotor büyüklüğüne bağlıdır) santrifüj tüplerine polikarbonat ve dikkatli dengelemek ekleyin. 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca 100,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Bu TBS-çözünebilir fraksiyon olarak süpernatant saklayın. </li><li> Yıkama 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de 1X TBS tamponu ve santrifüj her beş hacim içinde iki kez pelet. Süpernatantlar atın. <ol><li> Oda sıcaklığında 1X TBS-SDS yaklaşık 5 hacim 20 KHz&#39;de 10 saniye boyunca sonike pelet nihai pelet yeniden süspanse edin. Not: SDS içeren tampon numunelerinin eklenmesi SDS çökelmesini önlemek için 10 ° C &#39;de getirilmesi gerekmektedir önce. </li><li> 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de Ultracentrifuge. </li></ol></li><li> Bu inci gibi süpernatant saklayıne çözünebilen bir kısım SDS. <ol><li> Yıkama oda sıcaklığında 1X TBS-SDS tamponu içinde iki kez 5 hacim pelet. Santrifüj 25 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de her zaman. </li><li> Tam çözünürlüğünü elde etmek için 10 saniye boyunca 20 KHz ayarlanmış bir sonikatör kullanılarak 1X TBS-SDS-üre tamponu 50 ul nihai pelet çözünür; Bu üre, çözünür fraksiyonu olarak adlandırılır. </li></ol></li><li> Imalatçının protokolüne göre, ticari bir protein tahlil kiti kullanılarak toplam protein içeriğinin her fraksiyonu deneyi. Protein tahlili tepkin maddeler ile uyumluluk sağlamak için 1X TBS tamponu ile 1: TBS-SDS-üre numuneleri 1 seyreltin. -80 ° C&#39;de küçük kısımlar (20 ul) Freeze örnekleri donma-erime döngülerinden azaltır. Not: örnekler% 10 gliserol eklenmesi -80 ° C de, uzun süreli depolama için tavsiye edilir. </li></ol> Örnekleri ve Analiz Sonuçlarının 3. İmmünoblotting <ol><li> 10-kuyu% 4-12 Bis-Tris poliakrilamid jel üzerinde TBS, TBS-SDS ve TBS-SDS-Üre özlerinden Run örneklerstandart teknikler kullanılarak tampon olarak MOPS ile. Bkz Gallagher ve Chakravarti (2008) ayrıntılı bir western blot protokolü için 29. </li><li> TBS ve SDS ve üre fraksiyonları bir molekül ağırlığı markeriyle birlikte her şerit üzerine yüklenebilir Her numunenin protein 10 ug. </li><li> 1 saat süre ile veya yükleme tampon mavi boya, jel tabanına erişmesine kadar 200 V jel çalıştırın. </li><li> Elektroforetik naylon zarları 28 üzerine jeller proteinleri transfer,% 20 metanol ihtiva eden transfer tampon maddesi içine ilk% 100 metanol ve ardından önceden ıslatılmış. Protein, yan ve Moleküler Ağırlık boyut işaretleyicilerinin oryantasyonunu belirlemek için lekesi üzerinde bir tanımlama işareti sağlar. <ol><li> Islak filtre kağıdı yanında membranı ile jel Sandwich. Membranın doğru yerleştirilmesi jeli ve anot arasındaki zarla önemlidir. 40 V 2 saat için aktarımı gerçekleştirmek </li><li> 1X PBS-Tween (1X PBS-T) tamponu Makyaj: 200 ml PBS 1 tabletSu 0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür ve 0.137 M sodyum klorür, pH 7.4 elde etmek için. </li><li> 70 rpm&#39;de sallama ile 30 dakika için 1X PBS-T içinde% 5 BSA çözeltisi içinde membran bloke eder. Bu zara birincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın engeller. </li></ol></li><li> (1X PBS-T ile yıkanmıştır, bir dizi ve ardından (4 ° C &#39;de O / N) 750 seyreltme: 1 ile, α-sin birincil antikor Syn-1 (fare monoklonal antikoru BD Biosciences) 6 ml protein blot Probe 3 x 5 dakika her zaman) 28. </li><li> 1 ikincil antikor konjuge uygun HRP ile leke inkübe: 2000 seyreltme 30 dakika boyunca. 1X PBS-T ile bir dizi yıkama (3 x 5 dk her zaman) uygulayın. <ol><li> Karanlık bir odada 15 saniye geliştirilmiş chemiluminescence çözeltisi lekelerini daldırın. Bir ışık geçirmez kaset protein tarafı yukarı ile leke karşı sarılmak film ve yer otoradyografisi filmleriyle Kapak lekeler uygun sinyalleri (uygun boyut bantları) yakalamak için. </li><li> Otomatik geliştirici olarak otoradyografisi filmleri geliştirin. Not: Lekeler aynı zamanda otomatik bir geliştirici makinesi kullanılamaz durumda ticari bir kaynaktan bir geliştirici ve fixer kullanılarak elle geliştirilebilir. </li></ol></li><li> Western blot 6 ml sabit bir α-syn antikoru sinyalin leke şerit çalkalanarak 10 dakika boyunca tampon sıyırma batı leke inkübe edin. 8000 seyreltme: 1 beta-aktin primer antikor (fare monoklonal) ile 3.6.2 için adımları 3.43 izleyin. </li><li> Tarama ve kantitatif amaçlı NIH ImageJ (ücretsiz indirilebilir bir yazılım) kullanarak bir Tiff görüntü ve ölçü yoğunlukları içine son görüntüyü dönüştürmek. Not: Yazılım, ilgi nispi alan (uygun büyüklükte bantlar) yoğunluklarının okuma sağlar ve veri ya da rasgele birimleri ya da α-sin yoğunluk / β-aktin (bir ev tutma geni) bir oranı olarak ifade edilebilir Bir ev tutma geni (üre çözünür örneklerde olduğu gibi) geçerli değil ise kendi. </li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease+a+decade+od+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).</li><li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, . M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-synuclein+in+Lewy+bodies.">A-synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388, 839-840 (1997).</li><li>Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+filamentous+inclusions+of+Lewy+bodies+from+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).</li><li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).</li><li>Ahmed, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology,+pathophysiology+and+genetics+of+multiple+system+atrophy.">The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy.</a> Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).</li><li>Ploymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson's+disease.">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276, 2045-2047 (1997).</li><li>Kruger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ala30Pro+mutation+in+the+gene+encoding+alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease.">Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease.</a> Nat Genet. 18, 106-108 (1998).</li><li>Zarranz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+mutation,+E46K,+of+alpha-synuclein+causes+Parkinson+and+Lewy+Body+dementia.">The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia.</a> Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).</li><li>Proukakis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+alpha-synuclein+missense+mutation+in+Parkinson+disease.">A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease.</a> Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).</li><li>Kiely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synucleinopathy+associated+with+G51D+SNCA+mutation:+a+link+between+Parkinson's+disease+and+Multiple+System+atrophy?.">Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy?.</a> Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).</li><li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G51D+alpha-synuclein+mutation+causes+a+novel+Parkinson-pyramidal+syndrome.">G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome.</a> Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).</li><li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson's+disease.">Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302, 841 (2003).</li><li>Chartier-Harlin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson's+disease.">Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364, 1167-1169 (2004).</li><li>Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+neuropathology+of+PD.">Genetic neuropathology of PD.</a> Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).</li><li>Fauvet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+in+central+nervous+system+and+from+erythrocytes,+mammalian+cells,+and.+Escherichia+coli+exists+predominantly+as+disordered+monomer.">&#945;-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer.</a> J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).</li><li>Bartels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+occurs+physiologically+as+a+helically+folded+tetramer+that+resists+aggregation.">&#945;-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation.</a> Nature. 477, 107-110 (2011).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+insoluble+alpha-synuclein+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies.</a> Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solubility+of+alpha-synuclein+in+multiple+system+atrophy+differs+from+that+of+dementia+with+Lewy+bodies+and+Parkinson's+disease.">The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 76, 87-96 (2001).</li><li>Miller, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+blood+and+brain+from+familial+Parkinson's+disease+with+SNCA+locus+triplication.">Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication.</a> Neurology. 62, 1835-1838 (2004).</li><li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease.">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+solubility+and+phosphorylation+of+alpha-synuclein+over+the+course+of+Parkinson's+disease.">Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).</li><li>Mamais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+solubility+and+aggregation+properties+in+G2019S+LRRK2+Parkinson's+disease+brains+with+Lewy+Body+pathology+compared+to+idiopathic+cases.">Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases.</a> Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).</li><li>Lashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+clinical,+pathological,+biochemical+and+genetic+study+of+fused+in+sarcoma+proteinopathies.">A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies.</a> Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).</li><li>Brelstaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportin-1:+a+marker+of+FTLD-FUS.">Transportin-1: a marker of FTLD-FUS.</a> Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).</li><li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes.">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li><li>Nuber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+progressive+dopaminergic+phenotype+associated+with+neurotoxic+conversion+of+&#945;-synuclein+in+BAC-transgenic+rats.">A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of &#945;-synuclein in BAC-transgenic rats.</a> Brain. 136, 412-432 (2013).</li><li>Tofaris, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+dopaminergic+nerve+cells+odf+the+substantia+nigra+and+olfactory+bulb+in+mice+transgenic+for+truncated+human+a-synuclein+(1-120):+implications+for+Lewy+Body+disorders.">Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders.</a> J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations.">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li><li>Gallagher, S., Chakravarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis+.">Immunoblot analysis .</a> J Vis. Exp. (16), e759 (2008).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+alpha-synuclein+accumulation+in+multiple+system+atrophy,+Parkinson's+disease+and+progressive+supranuclear+palsy:+a+comparative+investigation.">Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation.</a> Brain. 133, 172-188 (2010).</li><li>Paleologou, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+elevated+levels+of+soluble+&#945;-synuclein+oligomers+in+post-mortem+brain+extracts+from+patients+with+dementia+with+Lewy+bodies.">Detection of elevated levels of soluble &#945;-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies.</a> Brain. 132, 1093-1101 (2009).</li><li>Culvenor, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-A&#946;+component+of+Alzheimer+s+disease+Amyloid+(NAC)+revisited.">Non-A&#946; component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited.</a> American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>McKeith, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+dementia+with+Lewy+bodies:+third+report+of+the+DLB+consortium.">Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium.</a> Neurology. 65, 1863-1872 (2005).</li><li>Lee, B. R., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+immunodetection+of+endogenous+&#945;-synuclein.">Improved immunodetection of endogenous &#945;-synuclein.</a> PLoS ONE. 6, e23939 (2011).</li><li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+&#945;-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous &#945;-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).</li></ol>

Yazar ifşa ilgisi yoktur.

Bu makale denatüre jel çalışma koşulları kullanılarak hastalıklı beyinleri ekstraksiyon ve monomerik, oligomerik diferansiyel çözünürlük özelliklerinin incelenmesi ve kümelenmiş α-syn için biyokimyasal protokol tanımlamaktadır. Bu çalışma için iyi bilinen bir tekniktir toplu α-sin 17, 18, ​​20, 21 kendi doğal formunda normal eriyebilir ancak hastalığın ilerlemesi ya da genetik mutasyon amiloidojenik veya yüksek çekiş özelliklerinin elde protein. Bununla birlikte, bazı grupları (8 veya% 10 yerine% 5%) 21,22, 30. SDS α-sin membran bağlanmış form içerebilir oligomerler, bir anyonik deterjan ve çözünürleştiren onların tampon SDS konsantrasyonlarında hafif varyasyonlar kullanmış α-sin, üre, oysa kaotropik reaktifi α-syn 20 çözünmeyen toplanmış ve fibriler veya amiloidojenik formları denatüre. Bu bağlamda Paleologou ark 31 tarafından sistematik bir çalışma istikrar incelendiα-syn oligomerler ve üre değişen konsantrasyonları ile fibrillerin (6,5-8 M) ya da SDS (0,25-2%) ve rapor üre konsantrasyonu yüksek olan SDS konsantrasyonlarda stabil ama oligomerleri. Α-syn oligomerler ve fibriller için spesifik onların FILA-1 antikoru, denatüre edici olmayan koşullar altında 6,5 ​​M üre konsantrasyonlarında fibrillerin yüksek konsantrasyonlarda tespit edilmiştir. Bu protokolde kullanılan tampon konsantrasyonlarının yakın Culvenor et al edilmiştir ne yansıtır. (1999) 32. Çözünmez α-syn biyokimyasal çıkarılması için anatomik beyin bölgelerinin özenle seçilmiş olmalı ve bu hastalığın ilerlemesi 33,34 bağlı α-syn LB ve LN yükünü yansıtmalıdır. Burada kullanılan vakalar McKeith göre PD ilerlemesinin geç ve bir ara aşamadan yansıtan PD neokortikal ve limbik alt tipleri gelen bazal ganglion örnekleri 34 ctriteria vardır. Kraliçe Meydanı Beyin Bank, beynin bir yarısırutin histokimyasal analizler için formalin sabit ve diğer yarısı dikkatle farklı anatomik bölgelere içine disseke ve flaş dondurulmuş ve biyokimyasal ileri ve DNA / RNA analiz çalışmaları için -80 oC dondurucular saklandı. Nöropatolog tarafından beyinleri ve diseksiyon formalin fiksasyonu takiben, immunhistokimya arşivlenmiş α-syn antikoru ve sonuçları kullanılarak yapılır. Ayrıca rutin olarak, beyin dokusunun pH değerinin, beyin dokusunun agonal durumunun bir ölçüsü olarak girişte ölçülür. Bu biyokimyasal analiz için doku koruma kalitesi için sağlam bir temel oluşturur. Bizim burada verileri daha SDS kontrollere göre PD durumlarda çözünür α-sin monomer olduğunu göstermektedir; Özellikle Neokortikal PD olgular limbik PD çeşitli kıyasla daha yüksek α-sin yükü vardır. Neokortikal vakalar gibi frontal ve parietal cor olarak neokortikal bölgelerdeki PD α-sin patolojinin daha ilerlemesini temsil33,34 göçmenlik ve. Limbik PD olgular amigdala, transentorhinal ve singulat bölgeleri olarak bazal ön beyin / limbik bölgelerde alanlarda yüksek LB puanları. Anlamlı veriler ve istatistiksel analiz için birer kohorttaki en az 4 vaka çalıştırmanız gerekir. Aynı şekilde biz burada sunulan leke verilerinin istatistiksel analizini teşebbüs değil. Aynı zamanda farklı antikorlar farklı biçimler / yüksek mertebeden α-syn oligomerler bileşimini tanıyabilir ve her biri kendi nispi hassasiyet ve tercih olabilir belirtmek gerekir. 4 farklı α-sin antikorlar (Syn-1, BB, Onco ve LB509) α-sin oligomerler / agrega en az değişmektedir sonuç verir olduğunu göstermektedir burada Tong ve ark., 29 sonuçlarından açıkça görülmektedir. Bu α-syn antikoru epitop ya N-terminal veya C bulunur bağlı olarak varyasyon rağmen α-syn monomerler Tüm 4 antikorlar tarafından benzer oranlarda kabul edildi29 terminal. Türler 20,21 sinüklein α-Benzer şekilde, fosfo-spesifik antikorlar, alfa sinüklein farklı yüksek moleküler ağırlıkların belirlenmesi. Burada anlatılan protokolde, yüksek özelliğine sahip antikor Syn-1 19-21 kullanılmıştır. Ancak, bu hücrelerde aynı zamanda proteinin aşırı ekspresyonunu ve demonte antikoru preabsorption deneyleri ile western blot üzerinde yeni antikor doğrulama ve dikkate alınması önemlidir. Bu α-sin ve veya stabil olmayan dörtlü α-sin formların küçük fragmanlarının belirlenmesi için araştırmacılar tarafından uygulanmış olan diğer varyasyonlar dikkate alınması önemlidir. Bu tetramerleri 36 stabilize α-syn 35 veya çapraz bağlama maddeleri ile Örnek homojenatlarında tedavisinde tepe bölümü kesik biçimlerinde korumak için PBS içinde% 0.4 PFA ile membran hafif tespit içerebilir. Otopsi TI kullanarak proteinlerin doğru biyokimyasal değerlendirmessue enzimatik protein yıkımı ve modifikasyon minimize gerektirir. Bu durum kohortlardan içinde eşleştirilmiş örnekler kısa otopsi gecikme ile doku kullanabilir ve / veya seçmek için bu nedenle tavsiye edilir. Α-sin immünohistokimya standart antikorlar kullanılarak immünohistokimya yalıtım protokolü başlamadan önce yapılmalıdır. Α-sin patolojinin ölçüde oldukça değişkendir ve seçilen bölgelere göre değişebilir. Her çalışma ile optimum verim için bir pozitif kontrol olarak bol patoloji bölgeleri seçmek için tavsiye edilir. Gerekli fosfataz inhibitörleri, proteaz inhibitörleri ve gerekirse kullanımı hücre lizizi sırasında meydana gelen ve 4 ° C &#39;de muhafaza örnekleri hücre içi proteazlar ya da fosfatazların serbest bırakıldıktan sonra önemlidir İstenmeyen enzimatik bozunmasını önlemek için. Bu deneylerin toplu iş içinde numunelerin içi kullanıcı varyasyonları önlemek için eşit ve düzenli işlenir önemlidir; Birden çok frebu potansiyel fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlarını geri olabilir eze-eritme çevrimleri kaçınılmalıdır. Numunelerin çok sayıda inceleyen immunoblotlarda veri jelleri diğer tüm örneklerin ve bu örneğe başvurulan tüm verilere paralel olarak çalışmalıdır bir örnek, normalize olması gerektiğini olduğunda bir kritik nokta akılda tutulması. Bu birkaç blotlar arasındaki immunoblot verilerinin normalleşmesini sağlamak için yapılır. Bu bizim son çalışmada 22 benimsenen yöntemdir. Düşük arka plan ECL tutmak için, benekler western blot protokolü esnasında herhangi bir zamanda kurumasına izin verilmesi gerektiği not edilmelidir. Bu ECL sinyalinin doygunluk yol açacaktır ve yanlış kantitatif yol açacaktır ek olarak, otoradyografi filmlerde çok uzun pozlama (&gt; 10 dk) kaçınılmalıdır. Bu, yukarıda protokol ortak laboratuvar reaktifler ve kullanılan oldukça basit bir tekniktirKumanda elemanları ve PD araştırma α-syn proteinin patofizyoloji araştırmak için değerli bir araç olabilir. Bu metodoloji, sadece α-sin transgenik hayvanlarda α-sin biyolojisi çalışmalarına uygun modifikasyonlar ile değil, aynı zamanda, AD, MSA, DLB, HD ve frontotemporaldementias gibi kümelenmiş proteinlerin anormal mevduat sahip diğer nörodejeneratif bozukluklar ile uzatılamaz. Ancak, burada tarif edilen Western blot verileri de α-syn 31 ile ilgili spesifik formlar için antikorlar kullanılarak enzim bağlı immünosorbent deneyleri kullanılarak onaylayabilir.

Birçok nörodejeneratif hastalıklar arasında ortak anahtarı, patolojik özelliklerinden biri bir protein / hastalığın spesifik bir şekilde 1 oluşur anormal protein agregalarının oluşmasıdır. Böylece, Alzheimer hastalığı (AH) nöronların içindeki karakteristik ekstranöronal amiloid beta plaklar ve toplulaştırılmış hiperfosforile tau mevduat vardır; Lewy Bodies intranöronal kapanımlar olan (Liderler), ve ayrıca Lewy neurites (LN) Lewy organları (DLBs) 2-4 ile PD PD demans ve Demans denilen distrofik nöronal süreçleri içinde toplu α-syn mevduat. Anormal α-syn mevduat da MSA 5 glial sitoplazmik inklüzyonlar damgasını lezyonlar görülür. Huntington hastalığında, orada karakteristik Poly-Q yatakları ve anormal Tar DNA protein-43 ve sarkom proteinleri (FUS) erimiş Frontotemporal demanslar biriken bağlayıcı. Önemli olarak, PD, α-sin geni mutasyonları Cau bulunmuşturPD 6-11 dominant se otozomal. Ayrıca, α-sin gen triplication 12 ve çoğaltılması 13 de böylece PD patomekanizmaların artan α-sin ifadesini bağlayan ailesel PD neden olur. Özellikle, ailesel ve sporadik hem PD olgular α-sin patoloji 14 anormal mevduat liman. PD Güncel mevcut tedaviler palyatif sadece ve durdurma ya da amansız bir hastalık ilerlemesini geciktirmek üzerinde hiçbir etkisi yoktur. α-sin bol insan beyninde ifade ve toplam beyin proteininin yaklaşık% 1&#39;ini yapar. Bu nöronların içindeki daha özel olarak mevcut ancak glial hücreleri içinde daha düşük miktarlarda da olsa var olabilir. Bir tartışmalı nokta rastgele bir monomer 15 veya katlanmış bir tetramer 16 olarak var olabilir α-syn yerli yapıdır. Hastalık sırasında, α-sin o katlanan almayı sağlar şeklini değiştirir ve bu süreç hastalığın pathoge neden olduğu düşünülmektedirNesis. Α-syn ve hastalığın patofizyolojik yönlerini içine soruşturma birkaç yıl olmasına rağmen, hastalık mekanizmaları kesin nedenleri 14 zor kalmıştır. Parkinson beyinlerin otopsi analizleri kullanılarak yapılan çalışmalar bugüne kadar α-syn sporadik PH ve aynı zamanda hem LRRK2 gen 17-22 mutasyonlarla ilişkili PD normal ve anormal biyoloji ile ilgili önemli ipuçları vermiştir. Burada, çeşitli derecelerde α-syn agrega liman insan post-mortem PD beyin dokusunda giderek çözünmez α-syn mevduatlar için bir biyokimyasal çıkarma protokolü (bkz şeması Şekil 1&#39;de sunulan) tarif edilmiştir. Bu teknik aynı zamanda diğer nörodejeneratif hastalıklar 23,24 için ortalama proteinleri çalışma tamponu bileşimlerinde değişikliklerle ve aynı zamanda transgenik hayvan beyin dokusu 25-27 den adapte edilebilir. Uyarlamalar ana dikkate solubi farklılıklar vardırğı ve bazıları, ilgili proteinlerin toplam miktarları, esasen, nükleer ve FUS 28 için gösterildiği gibi, en uygun çıkarılması için yüksek tuzlu tampon gerekebilir.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE transfer buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrane&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM filter paper</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris gels 4-12%&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Thickwall Beckman Polycarbonate tubes</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Western blot stripping buffer</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>beta-actin primary antibody (mouse monoclonal&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ model no&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Ultracentrifuge Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogeniser</td><td>Jenke and Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential extraction of soluble and insoluble alpha-synuclein from parkinsonian brains

Alfa-sinüklein (α-sin) proteini bol esas olarak nöronlar içinde ifade edilir ve farklı şekillerde bir dizi mevcut olduğu - monomerler, tetramerler, oligomerler ve fibrillerin. Hastalık sırasında, α-sin proteini daha fazla sayıda çözünmez hale getirme eğiliminde oligomerleri ve yüksek moleküler ağırlıklı agregaların meydana getirmek üzere uygun değişikliklere uğrar. Anormal toplu α-sin Parkinson hastalığı (PH), Lewy organları (LCD) ve çoklu sistem atrofisi (MSA) ile demans nöropatolojik özelliğidir. Biyokimyasal karakterizasyon ve artan deterjan gücü ve yüksek hızda ultrasantrifüjleme ile çözünmez α-syn kullanarak tamponların analiz hastalığın ilerlemesi ile ilişkili α-sin patolojinin gelişimini belirlemek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokol ölüm sonrası insan beyin dokusunun giderek çözülmez / toplu α-syn izolasyonunu anlatmaktadır. Bu metodoloji, normal ve anormal a çalışmalarına değişikliklerle uyarlanabilirFarklı α-syn mutasyonlar barındıran transgenik hayvan modellerinde hem de ilgili patolojileri ile ilişkili proteinlerin anormal, fibriler birikintilerin, özelliği diğer nörodejeneratif hastalıklarda -SYN biyolojisi.

TBS, SDS ve Şekil 1 &#39;de gösterilen protokol takip bazal gangliyonlar elde Üre çözünür proteinler jeller üzerinde yürütülmüştür ve α-sin Syn-1 fare monoklonal primer antikor ile bağışık lekelenmesi edildi. TBS çözünür fraksiyonlar incelenmiş PD ve kontrol olgularında monomerik α-syn (~ 14 KDa türleri) (Şekil 2A) varlığını gösterdi. SDS çözünür fraksiyonları aynı zamanda düşük maruziyet blot (Şekil 2C) görüntülenen olarak ele olguların her üç alt tiplerinin bol monomerik α-syn gösterdi. PD durumlarda da oligomerler (Şekil 2C) olması muhtemeldir yüksek maruz kalma lekesi üzerinde görülen daha yüksek moleküler ağırlıklı (MW) α-syn türler göstermiştir. PD olgulardan üre çözülebilir fraksiyonları α-syn monomerlerin, oligomerlerin ve davaları kontrol grubuna kıyasla toplulaştırılmış türlerin yüksek miktarlarda gösterdi. Neokortikal idiyopatik PD olgular aggreg yüksek miktarlarda göstermek<html> Limbik olgular çözünmez α-syn orta düzeyde göstermek iken ated, türler α-syn. Hem idiopatik PD olgulardan SDS ve üre fraksiyonları değişken 12 kDa&#39;da kesik α-syn ürünlerin düzeyleri ve 6 kDa 20 anlatıldığı gibi göstermektedir. Buna karşılık, kontrol olgusu herhangi çözülmeyen veya kümelenmiş α-syn (Şekil 2E) yoktu. Yarı nicel yoğunluğu ölçümleri neokortikal ve limbik PD durumlarda toplanan α-syn çözünmeyen doğası (Şekil 2B, 2D, 2F) gösteren α-sin immünohistokimya kullanılarak categoriesd olarak LB yükün miktarını yansıtmaktadır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Şekil 1. çözünmez α -SYN ekstraksiyon prosedürü şematik.rYer = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Şekil 2. PD gelen α -SYN seviyelerde Temsilcisi imünoblotların ve insan dokusu kontrol. TBS, SDS ve üre çözünür fraksiyonlar bazal ganglionlar (kontrol) idiyopatik PD vakalarının ve nörolojik olarak normal (PD durumlarda α-syn patoloji barındıran bölgede) den beyinleri western immüno kullanılarak α-syn varlığı için analiz edilmiştir. Protein 10 ug her bir şeride yüklendi. TBS fraksiyonlar (A) olarak, esas olarak α-sin monomerler, her durumda mevcuttur. SDS fraksiyonlar (C) olarak, α-syn bazı oligomerleri özellikle PD dokusunda monomerleri ile birlikte görülür. Üre fraksiyonları (C) monomer, oligomer ve toplanmış α-syn olarak değişken PD olgu Yansıtıcı olarak ifade edilmiştirg, kendi LB yükü. Nörolojik normal kontrol numuneleri monomerik α-syn, sadece az miktarda varlığını göstermektedir. Yüksek LB yük ile vakaların bazılarında görülen α-syn olası bozunma ürünlerini unutmayınız. Katı ok başı α-syn monomerik formunu temsil eder. * Muhtemelen daha önce 20,26 açıklandığı gibi α-syn bir C-terminal kesik formunu temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Vaka </td><td> Seks </td><td> Ölüm yaş yaşı </td><td> otopsi gecikmesi (saat) </td><td> dokusunun pH değerinin, </td></tr><tr><td> Neokortikal 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neokortikal 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Limbik 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Limbik 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Kontrol 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Kontrol 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Kullanılan olguların Tablo 1. Sınırlı demografik

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains at JoVE.com

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K Görüntüleme.  UCL Institute of Neurology. Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Video: Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Biyokimya

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Biyomühendislik

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Tıp

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Nörobilim

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Serbest yüzen Immünofluorescence tahlil ile kutanöz periferik sinir lifleri Alfa Synuclein toplamları hedefleme

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Pre-formed Fibril Indüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelendirilmesi

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, consequently, the progressive loss of control of voluntary movements. This neurodegenerative process is triggered by the deposition of protein aggregates in the brain, which are mainly constituted of &#945;-synuclein. Several studies have indicated that neuroinflammation is required to develop the neurodegeneration associated with Parkinson&#39;s disease. Notably, the neuroinflammatory process involves microglial activation as well as the infiltration of peripheral T cells into the substantia nigra (SN). This work analyzes a mouse model of Parkinson&#39;s disease that recapitulates microglial activation, T-cell infiltration into the SN, the neurodegeneration of nigral dopaminergic neurons, and motor impairment. This mouse model of Parkinson&#39;s disease is induced by the stereotaxic delivery of adeno-associated viral vectors encoding the human wild-type &#945;-synuclein (AAV-h&#945;Syn) into the SN. The correct delivery of viral vectors into the SN was confirmed using control vectors encoding green fluorescent protein (GFP). Afterward, how the dose of AAV-h&#945;Syn administered in the SN affected the extent of h&#945;Syn expression, the loss of nigral dopaminergic neurons, and motor impairment were evaluated. Moreover, the dynamics of h&#945;Syn expression, microglial activation, and T-cell infiltration were determined throughout the time course of disease development. Thus, this study provides critical time points that may be useful for targeting synuclein pathology and neuroinflammation in this preclinical model of Parkinson&#39;s disease.

This work analyzes the vector dose and exposure time required to induce neuroinflammation, neurodegeneration, and motor impairment in this preclinical model of Parkinson&#39;s disease. These vectors encoding the human &#945;-synuclein are delivered into the substantia nigra&#160;to recapitulate the synuclein pathology associated with Parkinson&#39;s disease.

İnsan α-Sinükleini Kodlayan Adeno İlişkili Viral Vektörler Tarafından İndüklenen Parkinson Hastalığı Fare Modelinin Analizi

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

<meta charset="utf8"></head><body>α-Sinüklein Yayılımı: Parkinson Hastalığında İntranazal Uygulama

Technique for Intranasal Administration of &#945;-Synuclein Aggregates

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by the presence of Lewy bodies, which are aggregates of &#945;-synuclein (&#945;-Syn). Recently, the disease was proposed to develop and progress through the prion-like propagation of &#945;-Syn aggregates from the olfactory bulb (OB) or dorsal nucleus of the vagus nerve. Although the origin of &#945;-Syn aggregates in the OB remains unclear, their propagation from the olfactory mucosa has been recently suggested. We previously showed that intranasal administration of &#945;-Syn aggregates in a mouse model induced &#945;-Syn pathology in the OB of mice. In this study, we present a method of intranasal administration of &#945;-Syn aggregates that induced &#945;-Syn pathology in the OB of mice. Intranasal administration of &#945;-Syn aggregates is a very simple and straightforward method, and we believe it will be a useful tool in the research for elucidating the origin of &#945;-Syn pathology in the OB and the pathway of &#945;-Syn propagation through the olfactory system.

<meta charset="utf8"></head><body>α-Sinüklein Agregatlarının İntranazal Uygulama Tekniği

The present protocol describes a method for intranasal administration of &#945;-synuclein aggregates. This method provides insights into &#945;-synuclein propagation from the olfactory mucosa to the olfactory bulb in Parkinson's disease.