I thank Dr Adamantios Mamais for extracting &#945;-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.

Tessuto cerebrale post-mortem è stato donato al Queen Square Cervello Banca dei disturbi neurologici, University College di Londra, Istituto di Neurologia utilizzando protocolli eticamente approvati e conservati per la ricerca con una licenza rilasciata dall&#39;autorità tessuto umano (HTA) Inglese (n. 12198). Vedere elenco dei casi usati per questo protocollo (Tabella 1). 1. Preparazione del buffer <ol><li> Preparare 1X TBS (soluzione fisiologica tamponata con Tris) buffer: <ol><li> Preparare 10X TBS come soluzione di riserva con NaCl 500 mm Tris-HCl pH 7.4 e 1.500. <ol><li> Pesare 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 e 87,6 g di NaCl in 800 ml di acqua ad elevata purezza. Regolare il pH con 1 M HCl e fare il brodo volume finale per 1 L. </li></ol></li><li> Preparare la concentrazione finale di 1X TBS diluendo lo stock 10 volte in acqua distillata. </li><li> Aggiungi inibitori della proteasi (PI), (1 compressa al 50 ml di tampone) e Phos-stop inibitori fosfatasi compresse (1 compressa ogni 10 ml di tampone) aabolisce gli effetti della non-specifiche azioni enzimatiche di proteasi e fosfatasi. Nota: Qui abbiamo utilizzato l&#39;enzima inibitore di compresse da Roche, ma ugualmente altri inibitori disponibili in commercio possono essere utilizzati secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Preparare tampone TBS-SDS aggiungendo 5% w / v di sodio dodecil solfato (SDS) a 1X TBS (pH 7,4) buffer. Riscaldare la soluzione a 60 ° C con agitazione costante con un agitatore magnetico per solubilizzare SDS. </li><li> Preparare tampone TBS-SDS-Urea aggiungendo urea ad una concentrazione finale di 8 M w / v di tampone 1X TBS-SDS (pH 7,4). Riscaldare la soluzione a 60 ° C con agitazione costante su un agitatore magnetico a dissolversi urea. </li></ol> 2. omogeneizzazione del campione e ultracentrifugazione differenziale Nota: La seguente parte del lavoro comporta movimentazione del tessuto cerebrale umana secondo le regole di HTA UK. Procedure operative standard locali sono seguite affatto times. Campioni di cervello sono sezionati da blocchi cerebrali congelati e materiale tissutale omogeneizzati in un microcabinet mantenuto a pressione negativa. Camici monouso guanti, volto-maschera, oltre a ferro di proteggi schermi e occhiali di sicurezza sono indossati durante l&#39;intera procedura. Rifiuti tessuto umano viene scartata dopo autoclave a 121 ° C per 20 minuti per lo smaltimento sicuro. Sharps (lame di bisturi) sono disposti in un apposito contenitore adeguato per il contenimento e smaltimento sicuro. <ol><li> Prendete un pezzo di tessuto umano congelato (circa 0,5 g di peso dalla regione gangli basali) e rapidamente tritate in piccoli frammenti (circa 1 mm 2) sul ghiaccio con una piccola piastra di Petri e una lama di bisturi sterile. Utilizzare una piastra di Petri separato e bisturi per ogni campione. Raccogliere il tessuto tritato in una provetta da 15 ml e aggiungere 10 volumi di tampone 1XTBS ghiacciato al tubo. </li><li> Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore meccanico a 20.000 rpm per 10 sec. Raffreddare in ghiaccio per 2 minuti. Ripetere questa operazione tre volteS. Nota: Questo è fatto in modo che i campioni non sono riscaldati durante omogeneizzazione. </li><li> Chiarire per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare pellet di materiale non omogeneizzato. </li><li> Prendere surnatante (omogenato greggio), aggiungere al policarbonato provette (dimensioni del tubo dipende dalle dimensioni del rotore) e bilanciare con attenzione. Centrifugare a 100.000 xg per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Conservare surnatante come questa è la frazione TBS-solubile. </li><li> Lavare pellet due volte in cinque volumi di tampone 1X TBS e centrifugare ogni volta a 100.000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. <ol><li> Risospendere il pellet finale sonicating pellet per 10 sec a 20 KHz in circa 5 volumi di 1X TBS-SDS a RT. Nota: Prima di aggiunta dei campioni contenenti tampone SDS dovrebbe essere portato a 10 ° C per evitare la precipitazione SDS. </li><li> Ultracentrifuga a 100.000 xg per 30 min a 25 ° C. </li></ol></li><li> Conservare il surnatante come questo è the SDS frazione solubile. <ol><li> Lavare pellet due volte in 5 volumi di tampone 1X TBS-SDS a RT. Centrifugare ogni volta a 100.000 xg per 15 min a 25 ° C. </li><li> Solubilizzare precipitato finale in 50 ml di 1X tampone TBS-SDS-UREA usando un sonicatore fissato a 20 KHz per 10 secondi per raggiungere la completa solubilizzazione; questo è chiamato la frazione solubile urea. </li></ol></li><li> Analizzare ogni frazione di contenuto proteico totale utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​commerciale secondo il protocollo del produttore. Diluire i campioni TBS-SDS-Urea 1: 1 con tampone 1X TBS per consentire la compatibilità con i reagenti del test della proteina. Congelare i campioni in piccole aliquote (20 mL) a -80 ° C per ridurre i cicli di gelo e disgelo. Nota: l&#39;aggiunta del 10% glicerolo ai campioni è consigliato per lo stoccaggio a lungo termine a -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting di Campioni e risultati Analisi <ol><li> Campioni eseguito da TBS, TBS-SDS ed estratti TBS-SDS-urea su 10 ben 4-12% gel Bis-Tris poliacrilammidecon MOPS come tampone di corsa utilizzando tecniche standard. Vedere Gallagher e Chakravarti (2008) 29 per un protocollo Western Blot dettagliata. </li><li> Carico 10 ug di proteine ​​di ogni campione su ogni corsia con un marcatore di peso molecolare per TBS e SDS e frazioni urea. </li><li> Eseguire gel a 200 V per 1 ora o finché il colorante blu di tampone di caricamento ha raggiunto il fondo del gel. </li><li> Trasferimento proteine ​​da gel elettroforesi su membrane di nylon 28, pre-umidificato prima in metanolo 100% e poi in buffer di trasferimento contenente 20% di metanolo. Fornire un marchio di identificazione sul blot per determinare il lato proteine ​​e l&#39;orientamento dei marcatori di dimensioni peso molecolare. <ol><li> Sandwich il gel con la membrana a fianco carta da filtro bagnata. Corretto posizionamento membrana è cruciale con la membrana tra il gel e l&#39;anodo. Eseguire il trasferimento per 2 ore a 40 V. </li><li> Make up 1X PBS-Tween (1X PBS-T) buffer: Sciogliere 1 compressa di PBS in 200 mlacqua dando 0,01 M tampone fosfato, cloruro di potassio 0,0027 M e 0,137 M di cloruro di sodio, pH 7,4. </li><li> Bloccare la membrana in soluzione BSA 5% in PBS-T 1X per 30 minuti con agitazione a 70 rpm. Questo impedisce legame dell&#39;anticorpo primario alla membrana non specifico. </li></ol></li><li> La sonda blot proteina con 6 ml di α-syn anticorpo primario Syn-1 (BD Biosciences, anticorpo monoclonale di topo) a 1: 750 di diluizione (O / N a 4 ° C) seguita da una serie di lavaggi con PBS 1X-T ( 3 x 5 minuti ogni volta) 28. </li><li> Incubare la macchia con la HRP appropriata coniugato anticorpo secondario a 1: 2.000 diluizione per 30 min. Eseguire una serie di lavaggi (3 x 5 min ogni volta) con 1X PBS-T. <ol><li> Immergere macchie in soluzione chemiluminescence migliorato per 15 secondi in una stanza buia. Macchie Coprire con una pellicola trasparente e mettere film autoradiografia contro la macchia con lato di proteine ​​fino a una cassetta a tenuta di luce per catturare i segnali appropriati (bande di dimensioni adeguate). </li><li> Sviluppare film autoradiografia in uno sviluppatore automatico. Nota: Macchie può anche essere sviluppato manualmente utilizzando sviluppo e di fissaggio da una fonte commerciale in caso di una macchina automatica sviluppatore non è disponibile. </li></ol></li><li> Incubare il Western Blot con 6 ml di western blot di stripping buffer per 10 minuti con costante scuotendo per togliere la macchia di segnale di anticorpi α-syn. Seguire i passaggi da 3.43 fino alla 3.6.2 con la beta-actina anticorpo primario (monoclonale murino) a 1: 8.000 diluizione. </li><li> Scansione e convertire l&#39;immagine finale in un&#39;immagine e misurare Tiff densità utilizzando NIH ImageJ a fini di quantificazione (un software scaricabile gratuitamente). Nota: Il software permette la lettura di densità di superficie relativa di interesse (le bande di dimensioni appropriate) ei dati può essere espressa sia come rapporto di α-syn densità / β-actina (un gene house-keeping) come unità arbitrarie o su proprio quando un gene casa armonia non è valido (come nel caso di campioni solubili-urea). </li&gt; </ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+&#945;-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous &#945;-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).</li></ol>

L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo di biochimica per l&#39;estrazione e l&#39;esame delle caratteristiche di solubilità differenziale di monomeri, oligomeri e aggregate α-syn da cervelli malati utilizzando denaturanti condizioni di gel di marcia. Questa è una tecnica consolidata per studiare α-syn 17, 18, ​​20, 21, una proteina che è normalmente solubili nella sua forma nativa ma ottenere proprietà di aggregazione amiloidogeniche o maggiori con progressione della malattia o con mutazioni genetiche aggregata. Ciò nonostante, alcuni gruppi hanno usato leggere variazioni delle concentrazioni SDS nei loro buffer (8% o il 10% invece del 5%) 21,22, 30. La SDS è un detergente anionico e solubilizza α-syn oligomeri che possono includere membrana legati forme di α-syn, mentre l&#39;urea, un reagente caotropico snatura le forme insolubili aggregati fibrillari e amiloidogeniche o di α-syn 20. A questo proposito uno studio sistematico da Paleologou et al 31 ha esaminato la stabilitàdi oligomeri e fibrille con concentrazioni variabili di urea alfa-syn (6.5 - 8 M) o SDS (0,25-2%) e ha riferito che oligomeri stabili in concentrazioni SDS ma non con elevate concentrazioni di urea. Il loro FILA-1 anticorpo, specifico per oligomeri e fibrille alfa-syn rilevato concentrazioni più elevate di fibrille a 6.5 M concentrazioni di urea in condizioni non denaturanti. Le concentrazioni tampone utilizzate in questo protocollo rispecchia fedelmente quanto descritto in Culvenor et al. (1999) 32. Le regioni cerebrali anatomiche per l&#39;estrazione biochimica di insolubile α-syn devono essere attentamente selezionati e questo dovrebbero riflettere LB e LN carico α-syn seconda progressione della malattia 33,34. I casi utilizzati qui sono campioni dei gangli della base dei sottotipi neocorticale e limbiche del PD che riflettono ultime fasi intermedie e di progressione PD secondo McKeith ctriteria 34. Al cervello Banca Queen Square, una metà del cervello èordinariamente fissato in formalina per analisi istochimica e l&#39;altra metà è accuratamente sezionato in diverse regioni anatomiche e flash congelato e conservato a -80 ° C congelatori per ulteriori studi biochimici e DNA / RNA analisi. In seguito la fissazione in formalina dei cervelli e la dissezione di neuropatologi, immunoistochimica viene eseguita utilizzando α-syn anticorpi e risultati archiviati. Anche come una procedura di routine, il pH del tessuto cerebrale viene misurata all&#39;arrivo come misura di stato agonal del tessuto cerebrale. Questo forma una base solida per la qualità di conservazione del tessuto per l&#39;analisi biochimica. I nostri dati dimostrano che qui ci sono più solubili in SDS monomero α-syn nei casi PD rispetto ai controlli; in particolare i casi di PD neocorticali ha elevato carico α-syn rispetto alla varietà PD limbico. I casi neocorticale rappresentano una maggiore progressione della PD α-syn patologia nelle regioni neocorticali come le cor frontali e parietalitiche 33,34. I casi PD limbiche hanno alti punteggi LB nelle zone basali prosencefalo / regioni limbiche, come l&#39;amigdala, transentorhinal e le regioni cingolato. Per i dati significativi e l&#39;analisi statistica, si deve eseguire almeno 4 casi di ogni coorte. Allo stesso modo non abbiamo tentato analisi statistica dei dati blot qui presentati. Si deve anche notare che gli anticorpi diversi possono riconoscere diverse forme / composizione di ordine superiore alfa-syn oligomeri e ciascuno può avere la propria sensibilità relativa e preferenza. Ciò è evidente dai risultati di Tong et al. 29 dove si mostrano che 4 differenti anticorpi alfa-syn (Syn-1, SS, Onco e LB509) danno risultati variabili almeno per alfa-syn oligomeri / aggregati. I monomeri α-syn stati riconosciuti in misura simili tutti 4 anticorpi anche se questi possono avere variazioni a seconda che l&#39;epitopo anticorpo α-syn si trova sia nel N-terminale o C-Terminal 29. Analogamente, anticorpi specifici per fosfo-alfa sinucleina determinare il peso molecolare elevato distinta α-sinucleina specie 20,21. Nel protocollo qui descritto, l&#39;anticorpo altamente caratterizzato Syn-1 è stato utilizzato 19-21. Tuttavia, è importante considerare convalidare qualsiasi nuovo anticorpo su western blot mediante esperimenti preassorbimento anticorpi e anche sovraespressione e arresto della proteina nelle cellule. È importante considerare altre varianti che sono state applicate dai ricercatori per determinare frammenti più piccoli di forme alfa-syn e tetramerici o instabili alfa-syn. Questo potrebbe includere lieve fissaggio di membrane con 0,4% PFA in PBS a conservare forme troncate di α-syn 35 o il trattamento di omogenati with linker croce per stabilizzare tetrameri 36. Valutazione accurata biochimica delle proteine ​​usando post mortem tiSSUE richiede la minimizzazione della degradazione enzimatica delle proteine ​​e la modifica. Si consiglia pertanto di utilizzare il tessuto con i più brevi ritardi post mortem e / o dei campioni appaiati nei casi coorti. Immunoistochimica utilizzando anticorpi standard per la α-syn immunoistochimica deve essere eseguita prima di avviare il protocollo di isolamento. L&#39;entità di α-syn patologia è molto variabile e può variare a seconda delle regioni selezionate. Si consiglia di selezionare le regioni con abbondante patologia come controllo positivo per la resa ottimale di ogni corsa. L&#39;uso di inibitori della proteasi e, se necessario, fosfatasi inibitori per prevenire la degradazione enzimatica indesiderata dopo il rilascio di proteasi intracellulari o fosfatasi che si verificano durante la lisi cellulare e mantenere i campioni a 4 ° C è cruciale. È importante che tutti i campioni all&#39;interno del lotto di esperimenti vengono gestiti in modo uniforme e costante per evitare variazioni intra-utente; fre multiplacicli di Eze-disgelo dovrebbero essere evitati in quanto ciò potrebbe potenzialmente rientrare modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione. Un punto critico da tenere a mente quando si esamina un gran numero di campioni è che i dati di immunoblot dovrebbero essere normalizzato su un campione, che dovrebbe funzionare in parallelo a tutti gli altri campioni su gel, e tutti i dati di riferimento per quel campione. Questo viene fatto per garantire la normalizzazione dei dati immunoblot tra più macchine. Questo è il metodo adottato nel nostro recente studio 22. Va notato che, al fine di mantenere lo sfondo ECL basso, le macchie non devono essere lasciati essiccare in qualsiasi momento durante il protocollo Western Blot. Inoltre, molto lunghe esposizioni (&gt; 10 min) su film autoradiografia dovrebbe essere evitato come questo porterà alla saturazione del segnale ECL e porterà alla quantificazione imprecisa. Questo protocollo di cui sopra è una tecnica relativamente semplice utilizzando reagenti di laboratorio comuni e instruments e può essere un valido strumento per studiare la fisiopatologia della proteina α-syn nella ricerca PD. Questa metodologia non può essere prorogato solo con le opportune modifiche allo studio di α-syn biologia in animali transgenici alfa-syn ma anche ad altre malattie neurodegenerative che caratterizzano i depositi anomali di proteine ​​aggregate, quali AD, MSA, DLB, HD e frontotemporaldementias. Tuttavia i dati Western Blot qui descritte potrebbero anche essere convalidati utilizzando enzyme-linked immunosorbent test utilizzando anticorpi per forme specifiche di α-syn 31.

Una delle principali caratteristiche patologiche comuni tra varie malattie neurodegenerative è la formazione di aggregati proteici anormali che si verifica in una proteina / malattia maniera specifica 1. Quindi, ci sono i caratteristici extraneuronale placche di beta-amiloide e tau aggregati depositi iperfosforilata all&#39;interno dei neuroni nella malattia di Alzheimer (AD); i depositi alfa-syn aggregati in Lewy Bodies (LBS), che sono inclusioni intraneuronali, e anche all&#39;interno dei processi distrofici neuronale chiamato Lewy neurites (LNS) di PD, PD demenza e demenza con corpi di Lewy (DLBs) 2-4. Depositi alfa-syn anormali sono visti anche nelle lesioni segno distintivo di inclusioni citoplasmatiche gliali in MSA 5. Nella malattia di Huntington, ci sono i caratteristici depositi Poly-Q, e il DNA anormale Tar legame proteina-43 e fusi in proteine ​​sarcoma (FUS) sono depositati in demenze frontotemporali. È importante sottolineare che per PD, mutazioni del gene α-syn sono stati trovati a cause autosomica dominante PD 6-11. Inoltre, α-syn gene triplicazione 12 e duplicazione 13 causa anche PD familiare collegando così aumentata espressione α-syn ai meccanismi patogenetici del PD. In particolare, i casi PD sia sporadici e familiari ospitano depositi anormali di α-syn patologia 14. Gli attuali trattamenti disponibili per il PD sono solo palliativi e non hanno effetto sulla necessità di arrestare o ritardare la progressione della malattia inesorabile. α-syn è abbondantemente espresso nel cervello umano e che costituisce circa l&#39;1% del totale delle proteine ​​del cervello. E &#39;presente in particolare all&#39;interno dei neuroni, ma può esistere anche se in quantità inferiori all&#39;interno delle cellule gliali. Un punto controverso è la struttura nativa di α-syn che può esistere come monomero casuale 15 o come tetramero piegata 16. Durante la malattia, α-syn cambia la sua conformazione che consente di ottenere misfolded e questo processo è pensato per essere la causa della malattia pathogeNesis. Nonostante diversi anni di indagini gli aspetti fisiopatologici della α-syn e la malattia, le cause esatte dei meccanismi della malattia sono rimasti inafferrabile 14. Gli studi che utilizzano analisi post-mortem del cervello parkinsoniani hanno finora fornito indizi importanti per quanto riguarda la biologia normale e anormale di α-syn sia in sporadici PD e anche PD associata a mutazioni del gene LRRK2 17-22. Qui, un protocollo di estrazione biochimico (vedi schema presentato in Figura 1) per i depositi alfa-syn sempre insolubili dal post-mortem di tessuto cerebrale umano PD che ospitano aggregati α-syn varia misura è stata descritta. Questa tecnica può anche essere adattato con modifiche in composizioni tampone per studiare proteine ​​aggregate da altre malattie neurodegenerative 23,24 e anche da animali transgenici tessuto cerebrale 25-27. La considerazione principale per gli adeguamenti sono le differenze di solubilità e gli importi totali delle rispettive proteine ​​alcune delle quali sono principalmente nucleare e potrebbe essere necessario buffer alto contenuto di sale per l&#39;estrazione ottimale, come indicato per FUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE transfer buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrane&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM filter paper</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris gels 4-12%&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Thickwall Beckman Polycarbonate tubes</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Western blot stripping buffer</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>beta-actin primary antibody (mouse monoclonal&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ model no&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Ultracentrifuge Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogeniser</td><td>Jenke and Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential extraction of soluble and insoluble alpha-synuclein from parkinsonian brains

Alpha-synuclein (α-syn) proteina è abbondantemente espresso prevalentemente all&#39;interno dei neuroni, ed esiste in diverse forme - monomeri, oligomeri, tetrameri e fibrille. Durante la malattia, α-syn subisce variazioni conformazionali per formare oligomeri e alti aggregati peso molecolare che tendono a rendere il più proteina insolubile. Anormalmente aggregati α-syn è una caratteristica neuropatologici della malattia di Parkinson (PD), la demenza con corpi di Lewy (DLB) e l&#39;atrofia multisistemica (MSA). Caratterizzazione e l&#39;analisi dei tamponi insolubili alfa-syn utilizzando con crescente forza detergente e ultracentrifugazione ad alta velocità biochimico fornisce un potente strumento per determinare lo sviluppo della patologia α-syn associata a progressione della malattia. Questo protocollo descrive l&#39;isolamento di sempre insolubile / aggregato α-syn dal tessuto post mortem cervello umano. Questa metodologia può essere adattata con modifiche a studi di α normale e anormalebiologia -syn in modelli animali transgenici ospitano diverse mutazioni alfa-syn così come in altre malattie neurodegenerative che caratterizzano i depositi fibrillari aberranti di proteine ​​legate alle rispettive patologie.

TBS, SDS e urea solubile proteine ​​estratte da gangli basali seguendo il protocollo illustrato nella Figura 1 sono stati analizzati su gel e immunoblotted con il Syn-1 monoclonale α-syn anticorpo primario. Le frazioni solubili TBS visualizzata la presenza di monomero α-syn (~ 14 specie KDa) nei casi di PD e controllo esaminati (Figura 2A). Le frazioni solubili SDS ha anche mostrato abbondante monomerico α-syn in tutti e tre i sottotipi di casi studiati come visualizzato nella bassa macchia di esposizione (Figura 2C). I casi PD hanno anche mostrato maggiori peso molecolare (MW) specie alfa-syn come si è visto in alto macchia di esposizione, che sono suscettibili di essere oligomeri (Figura 2C). Le frazioni solubili urea da casi di PD hanno mostrato elevate quantità di monomeri alfa-syn, oligomeri e specie aggregate rispetto per controllare casi. I casi neocorticale PD idiopatica dimostrano una maggiore quantità di AGGREG<html> specie ATED α-syn, mentre i casi limbiche mostrano livelli intermedi di insolubile α-syn. Entrambe le SDS e urea frazioni di casi di Parkinson idiopatica dimostrano livelli variabili di prodotti alfa-syn troncati a 12 kDa e 6 kDa come descritto 20. Al contrario, i casi di controllo non hanno mostrato alcun α-syn insolubili o aggregati (figura 2E). Misure semi-quantitative densità riflettono la quantità di carico LB come categoriesd con α-syn immunoistochimica dimostrare la natura insolubile di aggregati α-syn (Figura 2B, 2D, 2F) nei casi PD neocorticale e limbico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di α insolubile procedura di estrazione -syn.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figura 2. immunoblot rappresentativi dei livelli -syn alfa da PD e controllo tessuti umani. TBS, SDS e frazioni solubili urea da gangli basali (una regione che ospita α-syn patologia nei casi PD) dei casi di Parkinson idiopatica e neurologicamente normali (controllo) cervelli sono stati analizzati per la presenza di α-syn utilizzando Western immunoblot. 10 ug di proteina stato caricato su ogni corsia. In TBS frazioni (A), principalmente monomeri α-syn sono presenti in tutti i casi. In SDS frazioni (C), alcuni oligomeri di α-syn sono visti con monomeri principalmente nel tessuto PD. In frazioni di urea (C), monomeri, oligomeri e aggregata α-syn sono variamente espresse nel caso PD reflecting loro rispettivo carico LB. I campioni di controllo neurologicamente normali mostrano la presenza di piccole quantità di monomero α-syn. Si prega di notare eventuali prodotti di degradazione di α-syn sono visti in alcuni dei casi con elevato carico LB. La freccia testa continua rappresenta la forma monomerica di α-syn. Il * forse rappresenta una forma C-terminale troncata di α-syn come descritto in precedenza 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Caso </td><td> Sesso </td><td> all&#39;età di anni </td><td> ritardo di post-mortem (ore) </td><td> pH del tessuto </td></tr><tr><td> Neocorticale 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neocorticale 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Limbico 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Limbico 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Controllo 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Controllo 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. demografia limitati dei casi utilizzati

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Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K Views.  UCL Institute of Neurology. Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Ricerca

Biochimica

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Bioingegneria

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Medicina

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Neuroscienze

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, consequently, the progressive loss of control of voluntary movements. This neurodegenerative process is triggered by the deposition of protein aggregates in the brain, which are mainly constituted of &#945;-synuclein. Several studies have indicated that neuroinflammation is required to develop the neurodegeneration associated with Parkinson&#39;s disease. Notably, the neuroinflammatory process involves microglial activation as well as the infiltration of peripheral T cells into the substantia nigra (SN). This work analyzes a mouse model of Parkinson&#39;s disease that recapitulates microglial activation, T-cell infiltration into the SN, the neurodegeneration of nigral dopaminergic neurons, and motor impairment. This mouse model of Parkinson&#39;s disease is induced by the stereotaxic delivery of adeno-associated viral vectors encoding the human wild-type &#945;-synuclein (AAV-h&#945;Syn) into the SN. The correct delivery of viral vectors into the SN was confirmed using control vectors encoding green fluorescent protein (GFP). Afterward, how the dose of AAV-h&#945;Syn administered in the SN affected the extent of h&#945;Syn expression, the loss of nigral dopaminergic neurons, and motor impairment were evaluated. Moreover, the dynamics of h&#945;Syn expression, microglial activation, and T-cell infiltration were determined throughout the time course of disease development. Thus, this study provides critical time points that may be useful for targeting synuclein pathology and neuroinflammation in this preclinical model of Parkinson&#39;s disease.

This work analyzes the vector dose and exposure time required to induce neuroinflammation, neurodegeneration, and motor impairment in this preclinical model of Parkinson&#39;s disease. These vectors encoding the human &#945;-synuclein are delivered into the substantia nigra&#160;to recapitulate the synuclein pathology associated with Parkinson&#39;s disease.

Analisi del modello murino della malattia di Parkinson indotto da vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina umana

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Propagazione della α-sinucleina: somministrazione intranasale nella malattia di Parkinson

Technique for Intranasal Administration of &#945;-Synuclein Aggregates

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by the presence of Lewy bodies, which are aggregates of &#945;-synuclein (&#945;-Syn). Recently, the disease was proposed to develop and progress through the prion-like propagation of &#945;-Syn aggregates from the olfactory bulb (OB) or dorsal nucleus of the vagus nerve. Although the origin of &#945;-Syn aggregates in the OB remains unclear, their propagation from the olfactory mucosa has been recently suggested. We previously showed that intranasal administration of &#945;-Syn aggregates in a mouse model induced &#945;-Syn pathology in the OB of mice. In this study, we present a method of intranasal administration of &#945;-Syn aggregates that induced &#945;-Syn pathology in the OB of mice. Intranasal administration of &#945;-Syn aggregates is a very simple and straightforward method, and we believe it will be a useful tool in the research for elucidating the origin of &#945;-Syn pathology in the OB and the pathway of &#945;-Syn propagation through the olfactory system.

<meta charset="utf8"></head><body>Tecnica per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina

The present protocol describes a method for intranasal administration of &#945;-synuclein aggregates. This method provides insights into &#945;-synuclein propagation from the olfactory mucosa to the olfactory bulb in Parkinson's disease.