The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.

<ol>
	<li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types.">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The gut, a clonal conveyor belt. , (2015).</li><li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift.">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li><li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5.">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li><li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5++crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele.">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li><li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer.">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development.">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li><li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells.">Wnt/&#946;-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li><li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract:+effect+of+loss+of+beta-catenin.">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li><li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+background+recombination:+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity.">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+(crypt)+and+horizontal+(duodenum,+cecum)+axes+of+the+intestine.">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li><li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury.">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development.">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li><li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine.">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice:+evidence+for+a+delayed,+p53-independent+G2/M-associated+cell+death+after+gamma-irradiation.">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li><li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine.">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li><li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells.">Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reserve+stem+cell+population+in+small+intestine+renders+Lgr5-positive+cells+dispensable.">A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable.</a> Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li><li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation.">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li><li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation.">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li><li>Jard&#233;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O&#916;N89&#946;-catenin+system.">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-O&#916;N89&#946;-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li><li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment.">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li><li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+alpha1(I)-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast.">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li><li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation.">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li><li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo.">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li><li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling.">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients.">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Genler ve hücrelerin fonksiyonunu incelemek için koşullu CRE-LOX transgenik fareler kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu modeller belirlemek ve tanımlamak kök hücreleri 2,4-6 ve hastalık 25 rollerini anlamak için bağırsaklarda büyük bir başarı ile kullanılmaktadır. Tam bu modeller yararlanmak için doğru yorumlanmalıdır verileri sağlamak için sistemin kapsamlı bir karakterizasyonu gerektirir. Bu sistemlerin tam anlaşılması nedeniyle genleri nadiren yalnız hücre tipi veya konumu, biyolojik bilgi ve Cre ifadesini uyarmak için kullanılan sistemlerin verimsizlik eksikliği özgü olmasının elde etmek zordur. Burada açıklanan yöntemler deneysel tasarım ve mevcut bilginin uygulanması yoluyla bu sorunları aşmak nasıl gösterilmektedir. Burada sunulan genel ve muri araştıran herhangi araştırma için istismar edilebilir teknikler belirli bir araştırma soruyu cevaplamak için bu yöntemleri kullanmasına rağmenne bağırsak. Bağırsak Doku Hazırlanması Sağlam sonuçlar sağlamaya yönelik önemli bir adım kesinlikle uyulması zamanında bir şekilde ve tespit protokollerinde işlenmesi gereken doku hasat ve işleme. Hemen hemen tüm önemli konular aşağı doku kuruma ve / veya eksik fiksasyonu ile ilişkili eserler isnat edilebilir. Zamanlama doku mimarisi ve / veya nükleik asitlerin ve proteinlerin bozulmasını önlemek için çok önemlidir. Eksik veya overzealous tespit histokimyasal çözünürlük kaybına neden olabilir. Yeterli zaman veya fiksatif penetrasyon İHK analizi üzerine bir &quot;gelgit işareti&quot; olarak görülebilir bağırsak kriptlerin içinde çözünürlük kaybına neden olabilir izin vermek için çok kalın bölümlere bağlı Eksik tespit. Bundan başka, nükleer β-katenin hemen yanlısı sürece çekirdeğin dışına dağılacaktır gibi tespit, çok uzun süre uzatmak etmediğini önemlidirulaşıldığı ve formalin fiksasyonu aşağıdaki gömülü balmumu. ISC Niche Paneth Hücrelerinin Rolü Burada sunulan veriler etkili bir ISC kaybını takiben yetişkin bağırsakta kript rejenerasyonu Paneth hücrelerinin önemini göstermektedir. Ancak orada Ah-CRE o vil-Cre-ER T2 hedefleri ISCs nüfusu yedek ihtimalini kalmıştır. Tian ve diğ. 26 zarif Lgr5 hi ISCs Lgr5 lo karşılık ISCs nüfusu ile ikame edildiğini göstermiştir. Şimdi bu ISCs nedeniyle rezerv nüfus salgı hücre öncüleri 6,7 olarak tespit edilerek için Ah-CRE sisteminde bağışladı olduğu muhtemel görünüyor. ISC duruma dönmek için gerektiğinde bu salgı hücre öncüleri destekleyen olgun Paneth hücrenin önemi cevaplanması gereken kalır. Paneth hücrelerinin I teşkil gibiSC niş 8 ve onların hemşirelik işlevleri kendi öncüleri uzatmak olasıdır kalır kalori alımı 27 ve inflamasyon 28 ISC yanıtlarını düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Yeni Yaklaşımlar ve Teknoloji Etkili Model İnsan Kolorektal Kanser için ISC keşfi şimdi Clarke ve diğerleri tarafından gözden 9 barsak biyoloji ve hastalık, gen ve hücre rollerini araştırmak için yeni fare modelleri oluşturmak için kullanılan genlerin belirlenmesine yol açmıştır. Bu teknik için tek sınırlama, Cre proteinini ifade etmek için genlerin tanımlanmasıdır. Şu ISCs rutin Lgr5 gen ekspresyon modeline göre koşullu transgenik fareler kullanılarak incelenmiştir. Lgr5 promoterinden Cre ifade Fareler aPC, en yaygın olarak kolorektal kanserde mutasyona uğramış gen (CRC silmek için kullanılmıştır), Orijin 25 hücre olarak ISC gösteren. Seçerek silme bu hücrelerde diğer CRC genleri hastalığın ilerlemesi içgörü sağlanması ve yayılır örneğin. PTEN 29. ISC işlevi ayrıntılı fikir özellikle ablasyon Lgr5 insan difteri toksini reseptörü kullanılarak farelerde hücrelerin -expressing tarafından alındığını (DTR) geninin Lgr5 içine lokusu 26 çaldı. Diğer stratejiler mutant proteinlerin 30 devam eden geri dönüşümlü ifadesini sağlayan Tet-O sistemi kullanın. Farklı hücreler 31 ve yerlerde 32,33 yılında gen (ler) değiştirmek için bu araçları kullanarak kanser başlatmak nasıl anlamak, ilerleme ve 34 metastaz için kullanılır. Alternatif uyuyan güzellik transpozon sistemi kullanılarak mutajenez ÇHS yeni sürücüleri tespitidir. Farelerde, teknikleri ve genetik değişim stratejileri sürekli gelişimi daha sabırlı, ilgili modeller geliştirmeye devam ediyor. Yeni methods bağırsak epitel ve ISCs karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Akış kullanılarak elde edilebilir epitel hücre tiplerinin oranı karakterizasyonu sitometri Lektin ve CD24 35 farklı ekspresyonu göre. Potansiyel büyük anlayış ISC biyolojide kaydedilen ilerleme ve hastalık rolleri ex vivo organoid kültür sistemi kullanılarak 36 yapılacaktır. Bu sistem, bu çoğaltma ve fizyolojik olarak daha uygun bir şekilde ayırt 3B, kültür normal ve habis ISCs sağlar. Bu kişiselleştirilmiş tıp 37 önünü, in vitro hasta örnekleri üzerinde ilaçların doğrudan test sağlayacak umulmaktadır.

Memeli bağırsak lümen yüzeyi projeksiyonları gibi kriptalarının ve parmak tekrar birimlerinden özellikleri, lümen içine çıkıntı villus olarak adlandırılan. 4 gün 1 - Bu yüzey, yaklaşık her 3 tam kendini yenileme uğrar epitel sürekli bir tabakadır. Bu dinamik Doku hızla kök hücreleri bisiklet nüfusu tarafından desteklenmektedir (ISCs, aynı zamanda kript baz kolon hücreleri olarak da bilinir) ilk olarak Lgr5 geni 2,3 kendi ifadesi ile tanımlandı. Bu hücreler Lieberkühn kript altındaki özel bir niş bulunmaktadır. Başlangıçta, ISCs hızla bisiklet vardı keşif kök hücre doğada sakin olduğunu hakim fikri ile uyumsuz oldu. O durgun etiket nüfus crypt tabanına göre 4 pozisyonunda hücreleri, istinat öne sürülmüştür Lgr5 + ISC tanımlanmasına Önceki, ISCs 1 idi. Son zamanlarda yapılan araştırmalar hşimdi öncelikle kader komşuları 4,5 düzenlenir her crypt ekipotent bisiklet ISCs bir havuz olduğunu göstererek bu gözlemleri barıştırdı. Halinde bunlar, bu normalde salgı soyu adadık ancak ISC nüfus 6 hasar görmüşse ISCs dönebilirsiniz durgun hücreleri tarafından değiştirilebilir kaybolur. ISC komşuları ISCs veya kızları hücreler olabilir ya. ISCs çarpma ve hangi hatlar bağırsak lümen 1 epitel tabaka oluşturan özelleşmiş hücre tiplerine ayırt naif kızı hücreleri üretirler. Goblet, enteroendokrin, enterositler, püskül ve M hücreleri çeşitli emici ve düzenleyici işlevleri sağlamak lümen yüzeyine yukarı göç, ancak, Paneth hücreleri ISCs ile iç içe bulunmamakta crypt dibinde kalır. Son yıllarda ortaya konmuştur, bu naif kız çocuğu bir kısmınınbir salgı soy için mukadder er hücreleri yaralanma 6,7 üzerine bir ISC geri döndürme yeteneğine Lgr5 lo hücrelerini koruyarak hareketsiz etiket vardır. Nedeniyle kript rejenerasyon önemi bir öncelik ISCs ve komşuları, özellikle Paneth hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamaya yerleştirildi. Paneth hücrelerinin ISCs 8 destekleyen niş önemli bir rol oynamaktadır. Bakterisit ürünlerinin yanı sıra Paneth hücrelerinin ISC yenileme veya farklılaşmasını düzenleyen yolları aktive sinyal molekülleri üretirler. Önceki çalışmalar onların kızları Paneth hücreleri 8 tarafından sağlanan temel niş sinyalleri için rekabet edebilecek ne zaman Lgr5 + ISCs sadece var olduğunu gösterdi. Bu çalışmalar, normal Lgr5 + ISCs üzerinde değil, onlar zarar ve bir Lgr5 lo nüfus ikmal gerektiren bir durumda Paneth hücrelerinin rolü incelenmiştir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Biz transgenik fare modelleri 9,10 kullanılarak hücrelerin ve / veya genlerin işlevsel rolünü incelemek bağırsak biyoloji ve model hastalığını anlamak için. Sıkça bu modeller şartlı gen (ler) 9,10 değiştirmek için CRE-lox teknolojisini kullanmaktadır. Cre rekombinaz bakteriyofaj P1 izole integraz ailesinin bir site özgü rekombinaz olduğunu (rekombinasyon Nedenleri). Cre tanımlanan 34 bp arasındaki alana özgü rekombinasyon katalize &#39; Lox P &#39;siteleri (geçit P1 odağı χ). Fareler genetik Cre rekombinazın ifadesi üzerine eksize ilgi alanları kuşatan LoxP siteleri içerecek şekilde tasarlanmıştır. Bir hücre ya da gelişimsel belirli bir promotere Cre geni ekspresyonunu bağlama işleminin tahrip edici bir mekansal biçimde 9,10 yapılabilmesi için, bu oluşum safhasındaki ölümcül mutasyonlar aşılmasında özellikle yararlıdır sağlar. Ayrıca, bir alıcı yolu Cre ifade bağlayanBu yapay aktive edilebilir, zamansal değişiklikler izin verir. Bu teknolojiyi kullanarak, biz bağırsak epitel CatnB genini 11 inaktive. β-katenin, CatnB gen ürünü, ISC homeostazı tabi doğal Wnt sinyal yolunun bir anahtar düzenleyicisidir. Bu stratejiyi kullanarak iki önceki çalışmalarda çelişkili sonuçlar 12,13 üretti. AEVR ve ark., 12 tarafından yapılan çalışmada, kök hücre ve bağırsak homeostazisinin kaybı gösterdi. İrlanda ve ark. Oysa 14 çalışma hücre canlılığında bir azalma, aşağıdaki kript-villus ekseni CatnB eksprese vahşi tip hücrelerden yeniden doldurulur olduğunu bildirdi. Bu çalışmalarda önemli fark bağırsak epitel Cre ifade etmek için kullanılan promotör oldu. AEVR ve diğ., Çalışma t tatbik edilmesiyle aktive edilebilir östrojen reseptörüne bağlanmış villin gen promotörü kullanılıramoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Buna karşılık Ireland ve arkadaşlarının., Ksenobiyotik β-naphthoflavone (Ah-CRE) yanıt olarak Cre sentezlenmesini tahrik etmek için, sıçan sitokrom P450A1 (CYP1A1) geni promoter dizisi kullanılmıştır. Bu farklı sistemlere dair özellikler bu farklı gözlemler için hesap, iki hipotez oluşturulur. CatnB daha verimli ve böylece alt repopulation seviyelerine ISCs sayısını azaltarak, Ah-CRE kıyasla vil-Cre-ER T2 sistemi kullanılarak ISC silinir ilk. Alternatif olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda CatnB silme diferansiyel kaynaklanıyordu. Vil-Cre-ER T2 sistemi hedefleri Ah-CRE sistemi ise crypt ve villuslarının tüm epitel hücreleri yalnızca ISC niş ve crypt olmayan Paneth hücreleri hedefliyor. Bu sistemler Behav incelenmesi için ideal araçlar teminISCs ve ior ve Paneth hücreleri ile etkileşimi. İşte biz Paneth hücrelerinin yaralanma 17 bağırsak cevabı aracılık önemli bir rol oynadığını belirlemek için bu sistemlerin nasıl kullandığını dayalı birçok detaylı protokoller sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetate buffer</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate &#38; 50ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/0400/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue ph2.5</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue &#38; 485ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B(beta)-Naphthoflavone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3633</td>
			<td>BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used &#8211; store at -20&#176;C between uses, do not reheat more than twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bloxall</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/4920/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demucifiying solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g.&#160; Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101509944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3690</td>
			<td>0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3000917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBL11382V</td>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>Raymond A Lamb</td>
			<td>12698616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-053</td>
			<td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation buffer</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>&#160;5&#215; SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroquinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB Peroxidase</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intestinal tissue powder</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0380000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacarn</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1012</td>
			<td>NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit serum</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0902</td>
			<td>NRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x solutiuon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td>Poly-L-lysine microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase k solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>Dilute Proteinase K at 200 &#181;g/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ralwax</td>
			<td>BDH</td>
			<td>36154 7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reducer Solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite &#38; 100ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>0.9% NaCl in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S/1240/46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/2120/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6753</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93017</td>
			<td>20x saline sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12960495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used &#8211; store at -20&#176;C between uses, do not reheat more than twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS/T</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>#9997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TP9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal fixative</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal stain</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS).&#160; Solution B can be made up oin advance and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X/0200/21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for analyzing the role of paneth cells in regenerating the murine intestine using conditional cre-lox mouse models

7 gün - memeli bağırsak epitel yüzeyi her 3 yenileyen dinamik bir dokudur. Hızla Lgr5 geninin kendi ifadesi ile karakterize bağırsak kök hücreleri (ISCs) bisiklet nüfusu bu yenilenme sürecini belirlenen anlama. Bunlar yaralanma durumunda bunların yerine yeteneğine Bmi-1 ifadesi ile işaretlenmiş bir sakin kök hücre popülasyonu, tarafından desteklenmektedir. Bu nüfus arasındaki etkileşimi araştıran hastalığı ve kanser rollerini anlamak için çok önemlidir. ISCs bağırsak yüzeyindeki crypts içinde var, bu nişler epitel Yenileyici de ISC destekliyoruz. Bir önceki Lgr5 ISC&#39;nin &#39;stemness&#39; yakından komşu Paneth hücreleri varlığına bağlı olduğunu göstermiştir edildiği gibi, aktif ve pasif ISCs arasındaki etkileşim olasılığı, kovan içinde diğer farklılaşmış hücreleri içerir. Koşullu CRE-lox Fareyi kullanarakmodeller Paneth hücreleri varlığında veya yokluğunda aktif ISCs çoğunluğu silme etkisi test edilmiştir. Burada bağırsak karakterize ve taahhüt teknikler ve analiz Paneth hücrelerinin önemli hakaret aşağıdaki kurtarma yardım ISC niş içinde çok önemli bir rol oynadığını göstermektedir açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models at JoVE.com

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Bağırsak epitel kök hücreler (ISCs) Paneth hücreleri ile iç içe. Bu hücreler ISCs destekleyen ve antibakteriyel koruma sağlamak ISC, soyunu ayırt edilirler. İşte biz Paneth hücrelerinin bağırsak epithelia sürdürmek çok önemli bir rol oynadığını kurmak için transgenik fare koşullu modellerini nasıl kullandıklarını göstermektedir.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

protocols-for-analyzing-role-paneth-cells-regenerating-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

17.5K Görüntüleme.  Cardiff University.  Bağırsak epitel kök hücreler (ISCs) Paneth hücreleri ile iç içe. Bu hücreler ISCs destekleyen ve antibakteriyel koruma sağlamak ISC, soyunu ayırt edilirler. İşte biz Paneth hücrelerinin bağırsak epithelia sürdürmek çok önemli bir rol oynadığını kurmak için transgenik fare koşullu modellerini nasıl kullandıklarını göstermektedir. 