The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.

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The authors have nothing to disclose.

Verwendung bedingter cre-lox-transgenen Mäusen, die Funktion der Gene und Zellen zu zerlegen ist ein häufig verwendeter Ansatz. Diese Modelle sind mit großem Erfolg im Darm verwendet worden, um zu identifizieren und zu charakterisieren, die Stammzellen 2,4-6 und zu verstehen, ihre Rolle bei der Krankheit 25. Diese Modelle voll auszuschöpfen erfordert eine umfassende Charakterisierung des Systems zu ermöglichen, dass Daten richtig interpretiert werden. Ein vollständiges Verständnis dieser Systeme ist schwierig zu erreichen, aufgrund von Genen nur selten spezifisch für eine Einzelzelle Typ oder Ort, einer geringen biologischen Erkenntnisse und Ineffizienz der verwendet wird, um Cre Expression zu induzieren Systeme. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, wie wir diese Probleme durch experimentelle Gestaltung und Anwendung des vorhandenen Wissens zu überwinden. Obwohl wir diese Methoden verwendet werden, um eine spezifische Fragestellung der hier vorgestellten Techniken sind generisch und kann für jede Forschung Untersuchung der Muri ausgenutzt werden, zu beantwortenne Darm. Vorbereitung der Darmgewebe Der entscheidende Schritt für die Gewährleistung robustere Ergebnisse ist die Ernte und Verarbeitung des Gewebes, die zeitnah und Fixierung Protokolle genau eingehalten verarbeitet werden muss. Da fast alle wichtigen Fragen können stromabwärts zu Artefakten mit dem Gewebe Austrocknen und / oder unvollständige Fixierung zugeordnet zurückzuführen. Timing ist entscheidend, um eine Verschlechterung der Gewebearchitektur und / oder Nukleinsäuren und Proteinen zu verhindern. Unvollständige oder übereifrigen Fixierung kann zum Verlust der histochemischen Auflösung führen. Unvollständige Fixierung aufgrund unzureichender Zeit oder Abschnitte zu dick, um zu ermöglichen Fixiermittel Penetration kann zu einem Verlust der Auflösung innerhalb der Darmkrypten, die als &quot;Wassermarke&quot; auf IHC-Analyse beobachtet werden kann, führen. Weiterhin ist es wichtig, dass Fixierung nicht zu lange zu verlängern, wie kern β-Catenin aus dem Zellkern, sofern nicht sofort pro diffundierenbeitet und Wachs eingebettet folgenden Formalinfixierung. Rolle der Paneth-Zellen in der ISC-Nischen- Die hier vorgestellten Daten effektiv zu zeigen, wie wichtig die Paneth-Zellen in Krypta Regeneration im adulten Darm folgenden ISC Verlust. Allerdings blieb die Möglichkeit, dass Ah-cre erspart eine Bevölkerung von ISCs dass vil-Cre-ER T2 Ziele. Tian et al. 26 elegant gezeigt, dass die Lgr5 hallo ISCs werden von einer Bevölkerung von Lgr5 lo Reserve ISCs ersetzt. Es scheint nun wahrscheinlich, dass diese ISCs in der Ah-cre-System aufgrund der Reservepopulation, die als sekretorischen Zellvorläufer 6,7 identifiziert verschont. Die Bedeutung des reifen Paneth Zelle bei der Unterstützung dieser sekretorischen Zellvorläufer bei Bedarf zu einem ISC Zustand zurück bleibt unbeantwortet. Wie Paneth-Zellen bilden die ISC Nischen 8 und spielen eine Rolle bei der Regulierung der ISC-Antworten, die Kalorienaufnahme 27 und Entzündung 28 bleibt es wahrscheinlich, dass ihre Pflegefunktionen, um ihre eigenen Vorprodukte zu verlängern. Neue Konzepte und Technologien zur effektiven Modell Menschen Darmkrebs Die Entdeckung des ISC führte zur Identifizierung von Genen, die nun verwendet werden, um neue Mausmodelle für die Untersuchung der Rolle der Gene und Zellen in Darm-Biologie und Erkrankung durch Clarke et al 9 Bewertung zu erzeugen. Die einzigen Einschränkungen dieser Technik ist die Identifizierung von Genen, die Cre-Protein zu exprimieren. Derzeit ISCs werden routinemäßig untersucht mit Hilfe von bedingten transgenen Mäusen auf der Grundlage der Lgr5 Genexpressionsmuster. Mäuse, die Cre vom Lgr5 Promotors exprimieren, wurden verwendet, um APC, das Gen am häufigsten bei Darmkrebs mutiert (CRC zu löschen), Was die ISC als Ursprungszelle 25. Selektiven Löschen anderer CRC-Gene in diesen Zellen wird einen Einblick in den Krankheitsverlauf und die Ausbreitung z. PTEN 29. Weitere Einblicke in ISC-Funktion wird von speziell Abtragen Lgr5 exprimierenden Zellen in Mäusen mit einem menschlichen Diphtherie-Toxin-Rezeptor abgerufen (DTR) Gen klopfte in die Lgr5 Locus 26. Andere Strategien nutzen die Tet-A-System, das laufende reversible Expression der mutierten Proteine ​​30 ermöglicht. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, um Gen (en) in verschiedenen Zellen 31 und Standorte 32,33 ändern wird verwendet, um zu verstehen, wie Krebs auslösen, Fortschritt und metastasieren 34. Alternativ Mutagenese mit dem Transposon Sleeping Beauty System ist die Identifizierung neuer Fahrer von CRC. Die Weiterentwicklung von Mäusen, Techniken und genetische Veränderung Strategien weiterhin mehr Patienten relevanten Modelle zu entwickeln. New methoden wurden zur Charakterisierung der Darmepithelien und ISCs entwickelt. Charakterisierung des Verhältnisses der epithelialen Zelltypen können mit Strömung erreicht werden Zytometrie auf die differentielle Expression von Lectin und CD24 35 basierend. Möglicherweise der größte Fortschritt in der ISC Verständnis der Biologie und ihre Rolle bei der Krankheit mit der ex vivo organoiden Kultursystem 36 durchgeführt werden. Dieses System erlaubt es normalen und malignen ISCs zu Kultur in 3D, wo sie zu replizieren und zu differenzieren in einem physiologisch relevanten Art und Weise. Es ist zu hoffen, dass diese direkte Prüfung von Arzneimitteln am Patientenproben in vitro zu ermöglichen und damit den Weg für die personalisierte Medizin 37.

Die luminale Oberfläche der Säugerdarm Merkmale Repetiereinheiten der Krypten und fingerartigen Vorsprüngen, bezeichnet Zotten, die in das Lumen ragen. Diese Oberfläche ist eine kontinuierliche Bahn von Epithelien, die komplette Selbsterneuerung etwa alle 3 unterzogen - 4 Tage 1. Diese dynamische Gewebe wird durch eine Population rasch proliferierender Stammzellen unterstützt (ISCs; auch als Krypta Basis Cylinderzelle bekannt), die zunächst durch ihre Expression des Gens Lgr5 2,3 identifiziert wurden. Diese Zellen existieren in einer spezialisierten Nischen am Boden der Krypten der Lieberkühn. Zunächst wird die Feststellung, daß ISCs wurden rasch proliferierender war diskordanten mit der herrschenden Vorstellung, daß eine Stammzelle war Ruhe Natur. Vor der Identifizierung des Lgr5 + ISC wurde postuliert, dass eine Population von Ruheetikettenhaltende Zellen auf der + 4-Position, relativ zu der Basis der Krypta waren die ISCs 1. Neuere Forschungen hwie jetzt durch den Nachweis, dass in erster Linie gibt es einen Pool von äquipotent Radfahren ISCs in jeder Krypta, deren Schicksal durch seine Nachbarn 4,5 reguliert versöhnt diese Beobachtungen. Für den Fall, sie verloren sind diese durch ruhende Zellen, die normalerweise an den sekretorischen Linie verpflichtet, sondern kann auf ISCs zurück, wenn das ISC Bevölkerung beschädigt 6 ersetzt werden. ISC Nachbarn können entweder ISCs oder deren Tochterzellen. Die ISCs produzieren naiv Tochterzellen, die sich vermehren und differenzieren sich in den spezialisierten Zelltypen, die die epithelialen Blatt, Linien Darmlumen 1 umfassen. Der Kelch, enteroendokrinen, Enterozyten, Büschel und M Zellen wandern nach oben, um die luminale Oberfläche, wo sie bieten verschiedene Absorptions- und Regulierungsfunktionen bleiben jedoch die Paneth Zellen am Boden der Krypta, wo sie existieren, mit der ISCs vermischt. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass ein Anteil des naiven daughtER-Zellen für einen sekretorischen Linie dazu bestimmt sind Ruheetiketthalte Lgr5 lo Zellen, die Rückkehr zu einer ISC auf Verletzungen 6,7. Aufgrund ihrer Bedeutung in Krypta Regeneration eine Priorität auf das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen der ISCs und seinen Nachbarn, insbesondere der Panethzellen platziert. Die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Nische, die die ISCs 8 unterstützt. Neben bakterizide Produkte die Paneth Zellen Signalmoleküle, die Wege, die ISC Erneuerung oder Differenzierung regieren zu aktivieren. Frühere Studien zeigten, dass die Lgr5 + ISCs könnte nur dann verbindlich, wenn sie für wesentliche Nische Signale durch ihre Tochter Panethzellen 8 vorgesehen konkurrieren könnte. Diese Studien untersuchten die Rolle von Paneth-Zellen an normalen Lgr5 + ISCs und nicht in einer Situation, wo sie beschädigt sind und Nachschub von einer Lgr5 lo Bevölkerung. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Um zu verstehen, Darm Biologie und Modellerkrankung untersuchen wir die funktionelle Rolle der Zellen und / oder Gene mit transgenen Mausmodellen 9,10. Häufig sind diese Modelle verwenden cre-lox-Technologie, um Gen (e) 9,10 bedingt zu ändern. Cre (Ursachen Rekombination) Rekombinase ist eine ortsspezifische Rekombinase des Integrase-Familie, isoliert aus dem Bakteriophagen P1. Cre katalysiert ortsspezifische Rekombination zwischen definierten 34 bp &#39; Lox P &#39;(Locus χ der Crossover-P1) Websites. Mäuse gentechnisch so verändert LoxP Websites, die interessierenden Bereiche, die bei der Expression der Cre-Rekombinase ausgeschnitten flankieren, enthalten. Verknüpfung der Expression der Cre-Gens in eine Zelle oder entwicklungsspezifischen Promotors ermöglicht die Änderung in einer räumlichen Mode 9,10 hergestellt werden, ist dies besonders nützlich bei der Überwindung embryonale letale Mutationen. Weitere Verknüpfung des Cre-Expression zu einem Rezeptor-Weg,daß künstlich aktiviert werden, erlaubt zeitlichen Veränderungen. Mit dieser Technologie haben wir inaktiviert die CatnB Gen 11 in den Darmepithelien. β-Catenin, das CatnB Genprodukt ist ein wichtiger Regulator des Wnt-Signalwegs, der ISC-Homöostase regelt. Zwei frühere Studien mit dieser Strategie erzeugt widersprüchlichen Ergebnissen 12,13. Die Studie von FEVR et al. 12 gezeigt Verlust von Stammzellen und Darm Homöostase. Während die Ireland et al. 14 Studie berichtet, dass im Anschluss an eine Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen die Krypta-villus Achse wurde aus Wildtyp-Zellen, die CatnB neu besiedelt. Der Hauptunterschied in diesen Studien war der Promotor verwendet werden, um Cre in Darmepithelien auszudrücken. Die FEVR et al., Verwendet Studie die Villin-Gen-Promotor an den Östrogenrezeptor verbunden, die durch die Verabreichung von t aktiviert werden kannamoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Im Gegensatz Ireland et al., Verwendet das Promotorelement des Ratten-Cytochrom P450A1 (CYP1A1) Gens Cre-Expression in Reaktion auf die xenobiotischen β-Naphthoflavon (Ah-cre) anzutreiben. Die Eigenschaften dieser verschiedenen Systemen erzeugten zwei Hypothesen für diese verschiedenen Beobachtungen erklären. Das erste, das CatnB effizienter im ISC mit der vil-Cre-ER T2 System im Vergleich zu den Ah-cre gelöscht wird, wodurch die Anzahl der ISCs, um Unter Repopulation Niveaus verringert wird. Alternativ war es aufgrund CatnB Deletion Differenz in der differenzierten Zellpopulation. Die vil-Cre-ER T2-System richtet sich an alle Epithelzellen der Krypta und Zotten während die Ah-cre-System zielt nur die nicht-Panethzellen des ISC-Nische und Krypta. Diese Systeme bereitgestellt ideale Werkzeuge für die Prüfung des Behavior der ISCs und ihrer Wechselwirkung mit den Paneth-Zellen. Hier stellen wir verschiedene ausführliche Protokolle auf, wie wir früher, diese Systeme zu bestimmen, dass Panethzellen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der intestinalen Reaktion auf eine Verletzung 17 zu spielen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetate buffer</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate &#38; 50ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/0400/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue ph2.5</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue &#38; 485ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B(beta)-Naphthoflavone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3633</td>
			<td>BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used &#8211; store at -20&#176;C between uses, do not reheat more than twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bloxall</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/4920/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demucifiying solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g.&#160; Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101509944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3690</td>
			<td>0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3000917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBL11382V</td>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>Raymond A Lamb</td>
			<td>12698616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-053</td>
			<td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation buffer</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>&#160;5&#215; SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroquinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB Peroxidase</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intestinal tissue powder</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0380000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacarn</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1012</td>
			<td>NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit serum</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0902</td>
			<td>NRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x solutiuon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td>Poly-L-lysine microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase k solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>Dilute Proteinase K at 200 &#181;g/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ralwax</td>
			<td>BDH</td>
			<td>36154 7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reducer Solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite &#38; 100ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>0.9% NaCl in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S/1240/46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/2120/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6753</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93017</td>
			<td>20x saline sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12960495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used &#8211; store at -20&#176;C between uses, do not reheat more than twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS/T</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>#9997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TP9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal fixative</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal stain</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS).&#160; Solution B can be made up oin advance and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X/0200/21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for analyzing the role of paneth cells in regenerating the murine intestine using conditional cre-lox mouse models

Die epitheliale Oberfläche der Säugerdarm ein dynamisches Gewebe, das alle 3 erneuert - 7 Tagen. Das Verständnis dieser Erneuerungsprozess identifizierten eine Population rasch proliferierender Darm-Stammzellen (ISCs), gekennzeichnet durch ihre Expression des Gens Lgr5. Diese werden von einem ruhenden Stammzellpopulation, von der BMI-1-Expression gekennzeichnet ist, in der Lage, im Falle einer Verletzung ersetzen unterstützt. Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Rolle in Erkrankungen und Krebs. Die ISCs existieren innerhalb Krypten auf der Darmoberfläche, diese Nischen unterstützen die ISC in Auffüllen der Epithelien. Die Wechselwirkung zwischen den aktiven und ruhenden ISCs wahrscheinlich mit anderen differenzierten Zellen innerhalb der Nische, wie es zuvor gezeigt worden ist, dass die &#39;&#39; stemness &#39;&#39; der Lgr5 ISC ist eng mit der Gegenwart ihrer benachbarten Panethzellen gebunden. Bedingte cre-lox-MausModelle, die wir untersucht den Effekt des Löschens der Mehrzahl der aktiven ISCs in Gegenwart oder Abwesenheit von Paneth-Zellen. Hier beschreiben wir die Techniken und Analysen durchgeführt, um den Darm zu charakterisieren und zu zeigen, dass die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der ISC Nische bei der Unterstützung Erholung nach erheblichen Beleidigung.

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Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

protocols-for-analyzing-role-paneth-cells-regenerating-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

17.5K Aufrufe.  Cardiff University.  Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen. 