The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.

<ol>
	<li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types.">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The gut, a clonal conveyor belt. , (2015).</li><li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift.">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li><li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5.">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li><li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5++crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele.">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li><li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer.">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li><li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1.">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li><li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development.">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li><li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells.">Wnt/&#946;-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li><li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract:+effect+of+loss+of+beta-catenin.">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li><li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+background+recombination:+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity.">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+(crypt)+and+horizontal+(duodenum,+cecum)+axes+of+the+intestine.">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li><li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury.">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development.">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li><li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine.">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice:+evidence+for+a+delayed,+p53-independent+G2/M-associated+cell+death+after+gamma-irradiation.">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li><li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine.">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li><li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells.">Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reserve+stem+cell+population+in+small+intestine+renders+Lgr5-positive+cells+dispensable.">A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable.</a> Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li><li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation.">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li><li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation.">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li><li>Jard&#233;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O&#916;N89&#946;-catenin+system.">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-O&#916;N89&#946;-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li><li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment.">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li><li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+alpha1(I)-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast.">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li><li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation.">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li><li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo.">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li><li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling.">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients.">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שימוש בעכברים הטרנסגניים Cre-לקס מותנים לנתח את הפונקציה של גנים ותאים הוא גישה נפוץ. מודלים אלה היו בשימוש בהצלחה רבה במעי לזהות ולאפיין את תאי גזע 2,4-6 ולהבין את תפקידם במחלה 25. כדי לנצל באופן מלא דגמים אלה מחייב אפיון מקיף של המערכת כדי לאפשר נתונים להתפרש בצורה נכונה. הבנה של מערכות אלה מלאים היא קשה להשגה בשל גנים לעתים רחוקות להיות ספציפיים לסוג תא בודד או מיקום, חוסר ידע וחוסר היעילות של המערכות המשמשות כדי לעודד ביטוי Cre ביולוגיים. השיטות שתוארו כאן להדגים כיצד אנו להתגבר על בעיות אלה באמצעות עיצוב ויישום של ידע הקיים ניסיוניים. למרות שאנו משתמשים בשיטות אלה כדי לענות על שאלת מחקר ספציפית הטכניקות מוצגות כאן הנן גנריים וניתן לנצל לכל מחקר חוקר את Muriמעי ne. הכנת רקמת מעי הצעד החיוני להבטחת תוצאות חזקות הוא הקצירה והעיבוד של הרקמות, אשר צריך להיות מעובד באופן פרוטוקולים וקיבעון בזמן דבק בקפדנות. נושאים כמו כמעט כל משמעותיים במורד הזרם ניתן לייחס לחפצים הקשורים לייבוש הרקמות החוצה ו / או קיבעון שלם. העיתוי הוא קריטי כדי למנוע השפלה של אדריכלות רקמות ו / או חומצות גרעין וחלבונים. קיבעון שלם או נלהב מדי יכול לגרום לאובדן של הרזולוציה histochemical. קיבעון שלם בשל זמן או חלקים עבים מדי כדי לאפשר חדירה מקבע יכולה לגרום לאובדן של רזולוציה בתוך מאורות המעי שיכול להיות שנצפו כ&quot; סימן גאות &quot;על ניתוח IHC מספיק. בהמשך זה קריטי, כי קיבעון לא להאריך יותר מדי זמן, כמו β-קטנין הגרעיני יכול לפזר מתוך הגרעין, אלא אם כן באופן מיידי פרוcessed והשעווה המוטבעת הבאים קיבעון פורמלין. תפקיד של תאי פנט בנישת ISC הנתונים המוצגים כאן ביעילות להראות את החשיבות של תאי פנט בהתחדשות קריפטה במעי המבוגר הבאה אובדן ISC. עם זאת נותר האפשרות שאה-Cre חוסך אוכלוסייה של ISCs שמטרות T2 ויל-Cre-ER. טיאן et al. 26 באלגנטיות הוכיח כי ISCs היי Lgr5 מוחלפים על ידי אוכלוסייה של ISCs המילואים Lgr5 lo. סביר להניח כי ISCs אלה חסכו במערכת אה-Cre בשל אוכלוסיית המילואים שזוהתה כמבשרי תא הפרשת 6,7 עכשיו. חשיבותו של תא פנט הבוגר בתמיכת מבשרי תא הפרשה אלה בעת הצורך לחזור למדינת ISC נותרת ענתה. כתאי פנט מהווים אניהנישה SC 8 ולשחק תפקידים בויסות תגובות ISC לצריכת קלוריות 27 ודלקת 28 הוא נשאר סביר להניח כי פונקציות הסיעוד שלהם תהיה להאריך למבשרים שלהם. גישות וטכנולוגיות ליעילות המודל אנושי של סרטן המעי הגס חדשות הגילוי של ISC הוביל לזיהוי של גנים עכשיו שנמצא בשימוש כדי ליצור מודלים עכבר חדשים לחקירה את התפקידים של גנים ותאים בביולוגיה מעיים ומחלות, נסקרה על ידי קלארק ואח &#39;9. המגבלות רק לטכניקה זו היא זיהוי של גנים לבטא חלבון Cre. נכון לעכשיו ISCs באופן שיגרתי נחקר באמצעות עכברים הטרנסגניים מותנים המבוססים על תבנית ביטוי גני Lgr5. עכברים אשר מבטאים Cre מאמרגן Lgr5 שימשו למחוק APC, הגן שעבר מוטציה הנפוצה ביותר בסרטן מעי גס (CRC), הממחיש את ISC כתא ממוצא 25. סלקטיבי מחיקת גני CRC אחרים בתאים אלה מספק תובנה התקדמות מחלה והתפשטו לדוגמא. PTEN 29. תובנה נוספת לתוך פונקצית ISC מתבצעת תוחזר על ידי ablating במיוחד Lgr5 -expressing תאים בעכברים באמצעות קולטן רעלן דיפתריה האנושית גן (DTR) דפק לLgr5 לוקוס 26. אסטרטגיות אחרות להשתמש במערכת ט-O המאפשרת ביטוי הפיך מתמשך של חלבוני מוטציה 30. שימוש בכלים אלה כדי לשנות גן (ים) בתאים שונים ובמקומות 31 32,33 משמש כדי להבין איך הסרטן ליזום, התקדמות ולשלוח גרורות 34. לחלופין mutagenesis באמצעות מערכת transposon יופי השינה הוא זיהוי נהגים חדשים של CRC. הפיתוח המתמשך של עכברים, טכניקות ואסטרטגיות שינוי גנטיות ממשיך לפתח מודלים רלוונטיים יותר סבלניים. מ &#39;חדשethods פותחו לאפיון של epithelia וISCs המעיים. אפיון של היחס של סוגי תאי האפיתל יכול להיות מושגים באמצעות זרימה מבוסס cytometry על ביטוי ההפרש של קטינים ו -35 CD24. פוטנציאל ההתקדמות הגדולה ביותר בביולוגיה ISC ההבנה ותפקידם במחלה ייעשה באמצעות לשעבר vivo organoid מערכת תרבות 36. מערכת זו מאפשרת ISCs הנורמלי וממאירים לתרבות ב3D, שבו הם לשכפל ולהבדיל באופן יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. יש לקוות כי אלה יאפשר בדיקה ישירה של תרופות על דגימות מטופל במבחנה, סוללים את הדרך לרפואה מותאמת אישית 37.

משטח luminal של מעי היונקים תכונות חוזר יחידות של מאורות ואצבע כמו תחזיות, כינה villi, שבולט לתוך הלום. משטח זה הוא גיליון רציף של epithelia שעובר התחדשות עצמית מלאה כל 3 כ - 4 ימים 1. רקמה דינמית זו נתמכת על ידי אוכלוסייה במהירות רכיבה על אופניים בתאי גזע (ISCs; הידוע גם בבסיס קריפטה תאי עמודים), אשר בתחילה זוהו על ידי הביטוי שלהם של גן Lgr5 2,3. תאים אלה קיימים בנישה מיוחדת בתחתית מאורות של Lieberkuhn. בתחילה, הגילוי שהיה רכיבה על אופניים במהירות ISCs היה צורם עם הרעיון הרווח שתאי גזע היו שקטים בטבע. קודם לזיהוי Lgr5 + ISC הוא הניח שאוכלוסייה של תווית שקטה שמירת תאים בעמדה 4, ביחס לבסיס של קריפטה, היו ISCs 1. h המחקר אחרוןכמו עכשיו השלים תצפיות אלה על ידי הוכחה כי בעיקר יש בריכה של רכיבה על אופניים equipotent ISCs בכל כוך שגורלם מוסדרים על ידי שכנותיה 4,5. במקרה שהם איבדו יכולים להיות מוחלפים על ידי תאים אלה שקטים שבדרך מחויבים לשושלת ההפרשה אך יכול לחזור לISCs אם אוכלוסיית ISC פגומה 6. שכנים ISC יכולים להיות או ISCs או תאי הבת שלהם. ISCs לייצר תאי בת נאיביים שרבו ולהתמיין לסוגי תאים מיוחדים המרכיבים את גיליון אפיתל שקווי לומן מעי 1. הגביע, enteroendocrine, enterocytes, ציצה ותאי M להעביר כלפי מעלה אל פני השטח luminal שבו הם מספקים פונקציות הקליטה ורגולטורים שונות, לעומת זאת, תאי פנט יישארו בתחתית הכוך שבו הם קיימים התערבבו עם ISCs. בשנים האחרונות זה כבר הוכיח כי חלקם של daught הנאיבי<html> תאים אה מיועדים לשושלת הפרשה הם תווית שקטה שמירת תאי Lgr5 lo מסוגלים חוזר לISC על פציעת 6,7. בשל חשיבותו בהתחדשות קריפטה עדיפות הונחה על הבנת יחסי הגומלין בין ISCs ושכנותיה, במיוחד תאי פנט. תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בנישה שתומכת ISCs 8. בנוסף למוצרי bactericidal תאי פנט לייצר מולקולות איתות המפעילות את המסלולים המסדירים חידוש ISC או בידול. מחקרים קודמים הראו כי Lgr5 + ISCs יכול להתקיים רק כאשר הם יכולים להתחרות על אותות נישה חיוניים הניתנים על ידי תאי פנט בתם 8. מחקרים אלו בדקו את התפקיד של תאי פנט על Lgr5 הרגיל + ISCs ולא במצב שבו הם פגומים ודורשים חידוש מאוכלוסיית Lgr5 lo. class = &quot;jove_content&quot;&gt; כדי להבין מחלה ביולוגיה ומודל מעיים אנו בוחנים את התפקיד הפונקציונלי של תאים ו / או גנים באמצעות מודלים עכבר מהונדסים 9,10. לעתים קרובות מודלים אלה לנצל את טכנולוגית cre-לקס לשנות גן (ים) 9,10 תנאי. Cre (גורם רקומבינציה) recombinase הוא recombinase אתר ספציפי של משפחת אינטגראז, מבודד מP1 bacteriophage. Cre catalyses רקומבינציה הספציפית אתר בין BP המוגדר 34 &#39; לקס P &#39;(χ מוקד P1 מוצלב) אתרים. עכברים מהונדסים גנטית להכיל אתרי LoxP כי האגף אזורים של עניין שעל ביטוי של recombinase Cre הם נכרת. קישור הביטוי של גן Cre לתא או אמרגן ספציפי התפתחותי מאפשר שינוי להתבצע בצורה מרחבית 9,10, זה שימושי במיוחד בהתגברות על מוטציות קטלניות עובריות. נוסף המקשר את ביטוי Cre למסלול קולט,כי יכול להיות מופעל באופן מלאכותי, מאפשר שינויים זמניים. שימוש בטכנולוגיה זו אנו מומת גן CatnB 11 בepithelia המעיים. β-קטנין, מוצר גן CatnB, הוא רגולטור מרכזי של מסלול איתות Wnt הקנונית אשר מסדיר הומאוסטזיס ISC. שני מחקרים קודמים באמצעות אסטרטגיה זו הניבו תוצאות סותרות 12,13. המחקר על ידי Fevr et al. 12, הפגין אובדן של תאי גזע והומאוסטזיס מעיים. ואילו אירלנד et al. 14 מחקר דיווח כי בעקבות ירידה בכדאיויות תא הציר קריפטה-סיסי היה אוכלס מחדש מהתאים מהסוג בר להביע CatnB. ההבדל העיקרי במחקרים אלה היה האמרגן משמש להביע Cre בepithelia המעיים. Et al Fevr., מחקר השתמש אמרגן גן villin הצמוד לקולטן אסטרוגן שיכול להיות מופעל על ידי מתן tamoxifen (T2 ויל-Cre-ER) 15,16. בניגוד אירלנד et al., ניצלה את אלמנט האמרגן של גן P450A1 ציטוכרום החולדה (CYP1A1) לנהוג ביטוי Cre בתגובה לβ-naphthoflavone xenobiotic (אה-Cre). המאפיינים של המערכות השונות הללו נוצרו שתי השערות לחשבון לתצפיות שונות אלה. הראשון שCatnB נמחק בצורה יעילה יותר בISC באמצעות מערכת T2 ויל-Cre-ER לעומת אה-cre, ובכך להפחית את מספר ISCs לרמות תת-אכלוס. לחלופין היה זה בשל דיפרנציאלי מחיקת CatnB באוכלוסיית התאים המובחן. מטרות מערכת T2 ויל-Cre-ER כל תאי האפיתל של הכוך וסיסי ואילו מערכת אה-Cre מטרות רק תאים-פנט שאינו של הנישה ISC וקריפטה. מערכות אלה סיפקו כלים אידיאליים לבחינת behavIOR של ISCs והאינטראקציה שלהם עם תאי פנט. כאן אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על אופן בו אנו משמשים מערכות אלה כדי לקבוע שתאי פנט לשחק תפקיד מכריע בתיווך תגובת המעיים לפציעה 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetate buffer</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate &#38; 50ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/0400/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue ph2.5</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue &#38; 485ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B(beta)-Naphthoflavone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3633</td>
			<td>BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used &#8211; store at -20&#176;C between uses, do not reheat more than twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bloxall</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/4920/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demucifiying solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g.&#160; Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101509944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3690</td>
			<td>0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3000917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBL11382V</td>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>Raymond A Lamb</td>
			<td>12698616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-053</td>
			<td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation buffer</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>&#160;5&#215; SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroquinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB Peroxidase</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>MP-7401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intestinal tissue powder</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0380000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacarn</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1012</td>
			<td>NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit serum</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0902</td>
			<td>NRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x solutiuon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td>Poly-L-lysine microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase k solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>Dilute Proteinase K at 200 &#181;g/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ralwax</td>
			<td>BDH</td>
			<td>36154 7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reducer Solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite &#38; 100ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>0.9% NaCl in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S/1240/46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver solution</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/2120/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6753</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93017</td>
			<td>20x saline sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12960495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used &#8211; store at -20&#176;C between uses, do not reheat more than twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS/T</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>#9997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TP9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal fixative</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal stain</td>
			<td>*</td>
			<td>*</td>
			<td>X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS).&#160; Solution B can be made up oin advance and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X/0200/21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for analyzing the role of paneth cells in regenerating the murine intestine using conditional cre-lox mouse models

משטח אפיתל במעי היונקים הוא רקמה דינמית שמחדשת כל 3-7 ימים. הבנת תהליך התחדשות זו זיהתה אוכלוסייה של מהירות רכיבה על אופניים תאי גזע מעיים (ISCs) מאופיינים בביטוים של גני Lgr5. אלה נתמכים על ידי אוכלוסייה שקטה תאי גזע, מסומנת על ידי ביטוי BMI-1, מסוגל להחליף אותם במקרה של פציעה. חוקר את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה הוא חיוני להבנת תפקידם במחלות וסרטן. ISCs קיימת בתוך מאורות על פני השטח המעיים, נישות אלה תומכים בISC בחידוש epithelia. האינטראקציה בין ISCs הפעיל והשקט סבירה כרוכה תאים מובחנים אחרים בתוך הנישה, כפי שכבר בעבר הוכיח כי &#39;&#39; stemness &#39;&#39; של ISC Lgr5 קשור באופן הדוק לנוכחות של תאי פנט השכנים. שימוש בעכבר cre-לקס מותנהדגמים שבדקו את ההשפעה של מחיקה רוב ISCs הפעיל בנוכחות או עדר של תאי פנט. כאן אנו מתארים את הטכניקות והניתוח התחייבו מאפיין את המעי ולהוכיח שתאי פנט לשחק תפקיד מכריע בתוך הנישה ISC בסיוע ההתאוששות הבאה עלבון משמעותי.

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models at JoVE.com

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

protocols-for-analyzing-role-paneth-cells-regenerating-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

17.5K Views.  Cardiff University.  תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים. 

Video: Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...