The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Br&#233;mont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.

Plazmid ve Shadoo İfade 1. Üretim Not: Gen kodlayan sıçangil Shadoo protein (Shadoo 25-122), ekspresyon vektörü pET-28 11 içine alt klonlandı. Bu klon, E. dönüştürüldü Daha önce açıklandığı gibi, 11 coli, bir N-ucu heksahistidin etiketi, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) ile Shadoo proteinini ifade etmek için, bir bakteri suşunun SoluBL21. Plazmid yazarlarından talep edilebilir. Amino asit dizisinden hesaplanan Shadoo molekül ağırlığı 12,243.2 Da&#39;dır. Not: Bir laminal akış kaputu altında veya yakınında Bunsen aleve bakteriler ile tüm manipülasyonlar gerçekleştirin. <ol><li> Standart ısı şok protokolü kullanarak, pET-28-His 6 -Shadoo plazmid ile yetkili SoluBL21 bakteri Transform. Plazmid 1 5 ul bu karışıma için (tipik olarak 10 pg ile 100Bir tüp içinde bakteri 50 ul halinde ng). 45 saniye için 42 ° C &#39;de bir ısı şoku gerçekleştirin. </li><li> Kültür 40 mg / ml kanamisin (Şekil 1B) ile takviye edilmiş Luria-Bertani ortamında 0.5-0.7 arasında bir 600 kadar 37 ° C &#39;de bakteri dönüştürdü. </li><li> Kültür, 240 ug / ml izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid, ITPG ekleyerek Shadoo sentezleme O / N neden. 37 ° C&#39;de 150 rpm&#39;de çalkalanarak kültür bakterileri. Not: Genellikle, bakteri kültürü 600 3 O / N ulaşır. Not: Transforme bakteriler sonraki protein üretimi için -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Bunun için, bakteri kültürü kısma 10% -50% (v / v) steril gliserol ekleyin ve -80 ° C&#39;de dondurmak. </li></ol><img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" /> Shadoo ifade Shadoo sentezleme konstruktu, bakteri dönüşüm ve indüksiyon Şekil 1, Şema (aşama 1 olarak tarif edilmiştir). </strong&gt; (A) Shadoo için ekspresyon yapısı, bir protein, Nt N-terminalinde kaynaşmış bir hekzahistidin etiketi kodlar. Düzeni Shadoo proteini C-ucu (Ct), ardından bazik arginin / glisin tekrarları (yeşil silindir), bir hidrofobik domain (HD), ve tek bir N-glikosilasyon sitesi (CHO) içerdiğini göstermektedir. (B), pET-28-His 6 -Shadoo plazmid 42 ° C&#39;de 45 saniye boyunca ısı şoku ile SoluBL21 bakterilerin içine transforme edilir. Dönüştürülen bakteriler, seçici agar / ml kanamisin ihtiva eden 40 ug ekilir. Levhasından tek bir koloni, bir 1,000-3,000 ml&#39;lik bir çalkalama şişesinde bir kültürü inoküle etmek için kullanılır. Rekombinant proteinin ifadesi 1 mM IPTG ile uyarılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Düşük Basınçlı Sıvı Kromatografisi Shadoo Protein 2. saflaştırma (LPLC) <ol><li> Hücre parçalama ve deetme gövdelerinin hazırlık <ol><li> Bakteri süspansiyonu toplayın ve santrifüj tüpleri (Şekil 2) içine aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2500 x g&#39;de Spin. Dekantasyon ve hücre kültürü 500 ml elde edilen her bir pelet için tekrar süspansiyon peletler (anti-proteaz kokteyli ile 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8) 15 ml tampon maddesi içinde süpernatantı. Not: Tekrar süspansiyon haline getirilen topaklar dondurulmuş ve birkaç gün boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. Donma bakteri hücreleri lizisini kolaylaştırır. </li><li> SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama Ham bakteri pelet kullanılarak rekombinant proteinin aşırı ekspresyonunu kontrol edin. <ol><li> Bunun için, bakteri kültürü santrifüj 1 mi pelet hücreleri. 5 dakika boyunca 100 ° C &#39;de 100 ul Laemmli denatürasyon: pelet çözeltisi (277,8 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 4.4 SDS,% 44.4 w / v gliserol,% 0.02 bromofenol) ile ısıtılır. </li><li> % 12 akrilamid jeline Yük örnek 10 ul, çalışma SDS-PAGE ve visualize Coomassie boyaması proteinleri ayrıldı. </li></ol></li><li> ) 2.1.2 tamamen yeniden süspanse pelet% 0.5 nihai konsantrasyona kadar Triton X-100 ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de su banyosu içinde süspansiyon inkübe edin. </li><li> Bakteriyel hücreler lize edildi, buz soğukluğunda su içinde 6-12 mikron tepe-tepe genlik 5 dakika boyunca bir süspansiyon sonikasyon. </li><li> Aktarım, temiz 50 ml&#39;lik santrifüj tüpleri içine süspansiyon sonike edilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15.000 x g&#39;de santrifüje tüpleri. </li><li> Boşaltma yoluyla Süpernatantı ve tüp başına bağlanma tamponu (20 mM Tris-HCl tamponu, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Üre, 5 mM İmidazol) kullanılarak, 5 ml ilave edin. </li><li> Dönen tekerlek O / N yerleştirin tüpleri tamamen cisimcikler proteinleri tekrar süspansiyon. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" /> Içerme arınma Şekil 2. ŞemaShadoo eksprese organları (adım 2.1 de tarif edildiği gibi). Transforme bakteriler santrifüje tabi tutularak toplanmış ve liziz tamponunda yeniden süspanse edilir. Süspansiyon 30 dakika için 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilir ve daha sonra mekanik olarak bakteriyel hücreler kırmak için ses dalgalarına tabi tutulur. Sonikasyon örnek ısınmasını önlemek için buz üzerinde yapılır. Kırık hücreler santrifüj ile toplanır ve inklüzyon cisimciklerinin proteinleri çözünür 8 M üre ihtiva eden bir tampon içinde tekrar süspanse edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </li><li> Ni2 + -affinity kromatografisi Not: Kromatografi 5 mi Sefaroz kenetleme kolonu (Şekil 3A), bir Ni 2+ -yüklü kullanılarak FPLC Sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bütün çözeltiler 1 ml / dakika bir akış oranı ile sütun üzerine yüklenir. <ol><li> Şarj etmek için Sepharose sütuna 0.2 M Niso 4 su çözeltisi 10 ml enjekteNi 2+ -ions ile. </li><li> Imidazol düşük konsantrasyonda (20 mM Tris-HCl tamponu, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Üre, 5 mM İmidazol) ihtiva eden bağlama tamponu 30-50 ml enjekte edilmesi ile Ni2 + -ions görevli sütun dengelenmesi. </li><li> 50 ml&#39;lik enjeksiyon döngüsü ile üre çözünebilir proteinleri yükleyin. </li><li> İyice bağlanmamış proteinin maksimum çıkarmak için 10 mi, düşük imidazol bağlanma tamponu (20 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.4, 0.5 M NaCI, 8 M Üre, 5 mM İmidazol) ile yıkanması sureti ile akış geçiş kısmını kurtarma kolondan. </li><li> (MM Tris-HCI, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M üre, 80 mM imidazol 20) spesifik olmayan Sütuna bağlanmış proteinler elüt edilmesi için yıkama tamponu 50-100 ml sütun yıkayın. </li><li> 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M üre ihtiva eden tampon maddesi içinde 80-800 mM imidazol 15 dakika lineer gradyan uygulanır. Degrade uygulama sırasında 1 ml kesirler toplayın. Not: His-etiketli proteinleri wit elüte edilir(a rakip olarak kullanılabilir) imidazol ihtiva eden tampon ha gradyanı. </li><li> (2.1.3.1 bakınız) Her bir fraksiyonun bir 8 ul tablet alın ve 4 ul 4x Laemmli denatürasyon çözeltisi ilave edilir. 5 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısı çözümler. </li><li> Yük Coomassie boyama ile protein boyut işaretleyici 10 ul% 12 akrilamid jeline her numunenin 10 ul, çalışma SDS-PAGE ve görselleştirmek ayrılan proteinler. Not: hesaplanan Shadoo molekül ağırlığı, amino asit sekansı 12,243.2 Da&#39;dır oluştururlar. </li><li> Havuz Shadoo içeren tüm fraksiyonlar. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" /> (Adımları 2.2-2.4 de tarif edildiği gibi) 3. saflaştırma prosedürü Şekil. (A) Ni2 + -ions polihistidin ile işaretlenmiş olan proteinlerin seçici olarak temizlenmesini mümkün kılmaktadır histidin artığının koordine edilebilir. İmidazol ile, protein elüt edilmesi için kullanılmaktadırNi2 + -iyon ile koordine ve bağlı proteinin yerini yeteneğidir. (B) bir ebat eksklüzyon kolonu üzerine ayrılır Sütunlu Ni 2+ üzerinde tutulan edildi değişen hidrodinamik radius proteinler. Proteinler küçük olanlar büyük elüte edilir. (C) Kullanımdan önce, Shadoo ihtiva eden fraksiyonlar bir araya toplanmış ve üre, imidazol ve tuzları yok etmek için tuzdan arındırılmıştır edilir. Kalite kontrol deneyleri SDS-PAGE / Coomassie lekeleme, Western blotlama içerir. Saflaştırılmış Shadoo dondurularak kurutulabilir. -20 ° C&#39;de saklandığında Liyofilize Shadoo ay boyunca stabildir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </li><li> Ebat eksklüzyon kromatografı Not: İkinci bir saflaştırma adımı diğer proteinler, birinci saflaştırma aşaması sırasında birlikte elüt gelen Shadoo proteini ayıran boyut dışlama kromatografisi oluşur(Şekil 3B). <ol><li> 1,5 ml / dakika akış hızında 20 mM Tris-HCI tamponu, pH 7.4, 0.5 M NaCI, 8 M Üre, 250 ml enjekte edilerek toplam yatak hacmi 120 ml Superdex sütunu dengelenmesi. </li><li> Dengelenmiş sütun üzerinde 2.2.9 den Shadoo ihtiva eden yükleme Bir araya toplanan fraksiyonlar. Yukarıda bahsedilen tampon maddenin sürekli bir akımının meydana getirilmesi üzerine 40 ml sütun boşluk hacmi sonra, 1 ml&#39;lik fraksiyonların toplayın. </li><li> Her bir fraksiyonun bir 10 ul tablet alın ve fraksiyonlar Shadoo içeren olduğunu öğrenmek için yukarıda tarif edildiği gibi SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama yapar. </li><li> Shadoo ihtiva eden fraksiyonlar Havuz. </li></ol></li><li> Tuzdan arındırma Not: tuz giderme işlemi daha biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalar (Şekil 3C) için uygun olan bir tampon maddesi içinde rekombinant Shadoo proteini elde etmek üzere tuzlar, imidazol ve üre kaldırır. Aynı sonuç tampon maddesine karşı diyaliz örnekleri ile elde edilebilir. <ol><li> 150 ml 53 ml &#39;lik bir tuz giderme kolonu dengeye/ dakika, 5 ml akış hızında 10 mM amonyum asetat tamponu, pH 5, arasında. </li><li> Yük kolonu üzerinde Shadoo fraksiyonlar havuzlandı. Amonyum asetat tamponu enjeksiyonu üzerine elle UV detektörü çıkışında 280 nm&#39;de sinyal bir artış olduğunu göstermektedir fraksiyonlarım toplamak. </li><li> -Freeze kurutmak tuzu giderilmiş Shadoo ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Uygun bir tampon maddesi içinde liyofilize Shadoo, örneğin 10 mM sodyum asetat tamponu, pH 5 içinde çözündürülür, kullanımdan önce. Not: polihistidin etiketi enterokinaz ile temizlenebilir. </li></ol></li></ol> Fizyolojik pH&#39;da Amiloid fibrillerin içine Shadoo in vitro bir araya 3. Not: kendiliğinden Shadoo Protein topakları gece boyunca pH ≥ 7 11 de fibriller oluşturur. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" /> Shadoo amiloid fibrillere refolding Şekil 4. Programı (descri olarakÇalkalarken bir asidik çözeltinin pH ≥ 7 tampon içinde çözüldüğünde Adım 3&#39;te yatak). Saflaştırılmış Shadoo kendiliğinden amiloid fibrillere dönüştürür Shadoo 1 M Gdn-HCl ile kuluçkaya yatırıldıktan sonra amiloid fibrillere dönüştürür. Kalite kontrol deneyleri, elektronik mikroskop ve ThT boyama bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> 20 mM Tris-HCI tampon maddesi, pH 7.4 içinde 2 uM&#39;lik bir son konsantrasyona Shadoo seyreltilir. 280 nm &#39;de çözeltinin optik yoğunluğu ölçmek ve 20,970 arasında Shadoo amino asit bileşimi çıkarsanan sönüm katsayısı kullanarak konsantrasyonu ölçümü. </li><li> Amiloid yapılarına (Şekil 4) kendiliğinden protein dönüşümü sağlamak için, bir kaç hafta boyunca 4 ° C &#39;de konik bir plastik tüp içinde solüsyon 500 ul inkübe edin. </li><li> Taze nihai conce, T (ThT), Tioflavin hazırlanabilir ekleShadoo solüsyonu, 100 ul bölüntüde 10 uM ntration. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çözelti inkübe edin. Amiloid yapılarına 17 varlığını doğrulamak için 435 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu kullanılarak 460 520 nm floresan emisyon ölçün. </li></ol> Asidik pH&#39;larda Amiloid fibrillerin için Shadoo in vitro bir araya 4. <ol><li> 2 uM nihai konsantrasyona kadar 1 M GdnHCl, 20 mM Na-asetat tampon, pH 5 Shadoo seyreltilir. </li><li> 3-7 gün boyunca, 37 ° C&#39;de sürekli çalkalanarak konik bir tüp içinde, bu çözeltinin 500 ul inkübe edin. </li><li> 3.3 olarak çözeltisinin bir alikotuna THT ekleyerek Amiloid fibrillerin varlığını kontrol edin. </li><li> Shadoo amiloid fibrillerine arındırmak için, 10 mM Na-asetat tamponu, pH 5.0 karşı elde edilen süspansiyonun Dialyze. </li><li> 4 ° C&#39;de saflaştırılmış fibriller saklayın. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg"/&gt; Ni2 + elüt Şekil 5. Örnek sonuçlanır. Protein fraksiyonlar kenetleme kolonu (A) ve boyut dışlama kolonu (B), SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilmiştir -yüklü. Saflaştırılmış Shadoo tanımlanması SPRN anti-Shadoo antikoru (C) kullanılarak değerlendirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+at+the+crossroads+of+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Prion protein at the crossroads of physiology and disease.</a> Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).</li>
<li>Colby, D. W., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">De novo generation of prion strains.</a> Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435, 773-778 (2005).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+amyloid+formation+and+membrane+interaction+with+amyloidogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).</li>
<li>Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+of+lipid-prion+interactions%3A+insights+on+charge+effect%2C+Cu%28II%29-ions+binding+and+prion+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).</li>
<li>Watts, J. C., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion+protein+family%3A+diversity%2C+rivalry%2C+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).</li>
<li>Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PrP-like+proteins+Shadoo+and+Doppel%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The PrP-like proteins Shadoo and Doppel.</a> Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).</li>
<li>Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+versus+doppel+protein+misfolding%3A+new+insights+from+replica-exchange+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations.</a> Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).</li>
<li>Daude, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Shadoo+proteins+convert+to+amyloid-like+forms+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions.</a> Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadoo+binds+lipid+membranes+and+undergoes+aggregation+and+fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CNS+glycoprotein+Shadoo+has+PrP%28C%29-like+protective+properties+and+displays+reduced+levels+in+prion+infections%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections.</a> The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-resistant+prions+selectively+decrease+Shadoo+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002382(2011).</li>
<li>Westaway, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Shadoo+in+prion+infections+traces+a+pre-clinical+event+inversely+related+to+PrP%28Sc%29+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002391(2011).</li>
<li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PB1-F2+influenza+A+virus+protein+adopts+a+beta-sheet+conformation+and+forms+amyloid+fibers+in+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).</li>
<li>Tarus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+paths+of+the+nucleoprotein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus.</a> Biochimie. 94, 776-785 (2012).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+Thioflavin-T+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).</li>
<li>Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+system+as+a+screening+tool+for+pharmacological+assessment+of+g+protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors.</a> Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).</li>
<li>Schein, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cool+way+to+make+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cool way to make proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+genetic+strategies+for+recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+glycosylation+enhances+ubiquitin-mediated+proteasomal+degradation+of+Shadoo+in+Scrapie-infected+rodents+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells.</a> Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).</li>
<li>Englund, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+biosynthesis+of+glycosyl+phosphatidylinositol+protein+anchors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors.</a> Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).</li>
<li>Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPI-anchoring+of+PrP%3A+implications+in+sorting+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis.</a> Prion. 8, 11-18 (2014).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

İfade ve rekombinant fare Shadoo proteininin büyük miktarda saflaştırılması hem de kolay ve etkin bir protokol verilmektedir. Anlatılan yöntem başarılı çözülmesini ve (O&#39;nun 6) etiketli rekombinant Shadoo proteinin saflaştırılması verir. Başlığında belirttiği gibi bu, önemli bir prokaryotik bakterinin E. olarak ifade edildiğinde E. coli katma kütlelerinin Shadoo birikir. Shadoo arıtılmadan önce, bakteri Triton X-100 içeren bir tampon içinde sonifikasyon il...

İnsanlarda koyun ve Creutzfeldt-Jakob hastalığında sığır süngersi sığır ensefalopati, skrapisini dahil prion nörodejeneratif hastalıklar, ölümcül ve çaresiz. Prion hastalıkları esas olarak çapraz β-tabaka içine α-helisler oluşan hücresel prion proteininin konformasyonel değişiklikler ile karakterize edilen 1,2 konformer amiloid zenginleştirilmiş. Çapraz β-yapılar yoğun paketlenmiş içeren ve son derece düzenli kristal benzeri β-yaprak hidrojen bağları 3,4 ile stabilize. Prion amiloidleri işe bir şablon sağlamak ve bir monomerik protein birimi dönüştürme büyüyen kenarında β-ipliklerini nedeniyle kendini kopyalayan yapabilirsiniz. &quot;Protein sadece&quot; hipotezine göre, prion proteininin amiloid konformer tek bulaşıcı ajandır. Bununla birlikte, başka bir biyomoleküllerin prion bozukluklarına gerekli olduğu önerilmiştir. Örneğin, hücre zarları, bir yer burada conversi olduğu düşünülmektediryer alır ve bazı negatif yüklü lipidler dönüştürme işlemi, 5,6 artırmak için gösterilmiştir. Buna ek olarak, bazı proteinler de prion patolojilerinde dahil olabilir. Doppel ve Shadoo 7,8: Spesifik olarak, prion proteini ailesinin iki diğer üyeleri vardır. Doppel di-sülfit köprüler ile stabilize nispeten rijit bir yapıya sahiptir ve Amiloid fibrillerin 9 kendi kendine polimerleşme ve agrega başarısız olur. Bunun aksine, prion proteinine benzer Shadoo amiloid fibril yapılarına bir β-tabaka zenginleştirilmiş bir yapı ve kendi kendine ilişkilendirmek alabilir. Bu Shadoo doğal koşullar altında, veya negatif yüklü membranlar 10,11 bağlanması üzerine liflenme denetlenebilir olduğu gösterilmiştir. Amiloid benzeri lif haline Shadoo dönüştürülmesi patolojileri ile ilişkili olabilir. Nitekim, amiloid benzeri yapılar hastalığa neden olan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Shadoo bir hidrofobik domain (HD) ve tandem Arg / Gly dizisi yer almaktadır içindeki t tekrarlarPrion proteininin (Şekil 1A) N-terminal parçası o. Prion proteininin N-terminal parçası olarak, Shadoo yüksek pozitif yüklü ve doğal olarak yapılandırılmamış bir protein 11,12 olduğu görünür. Doğrudan prion proteininin bağlanabildiği yana Shadoo prion bozukluklarına işlevsel olarak ilişkili gibi görünmektedir. Buna ek olarak, ifade aşağı prion patoloji 13,14 sırasında düzenlenir. Ancak, prion hastalığı Shadoo rolü henüz kurulmuş değildir. Bu fare Shadoo geninin kodlama dizilimini taşıyan bir plazmit geliştirdi. Plasmid E. dönüştürmek için kullanılmış E. coli, N-terminal His 6 füzyon Shadoo proteinin üretimi için. Bu sentezleme sistemi de laboratuvarımızda kurulan ve yaygın devam eden projelerde 6,15,16 kullanılır. Shadoo ekspresyonu için önemli bir husus, E. seçimdir coli suşu. Yetkili BL21 bakteri suşu, rekombinant pro ekspresyonu için kullanılır ikenproteinlerinin Shadoo başarılı bir şekilde eksprese ve transforme SoluBL21 bakteri suşunun sadece saflaştırılmıştır. SoluBL21 yeterli E. E. coli ekspresyonu üst BL21 tespit edilebilir çözünebilir ürün elde proteinlerin üretimi için geliştirilmiş BL21 konak suşunun geliştirilmiş bir mutantıdır. SoluBL21 E. Shadoo yüksek düzeyde tanımlama E. coli katma kütlelerinin protein birikimine yol açar. Olmayan bir doğal proteinin, oldukça E. ifade edilir için genel bir özellik olarak, E. coli, bu protein, erimez içerik korları toplanma eğilimindedir. Shadoo muhtemelen farklı derecelerde katlanmış protein ile oluşturulan zenginleştirilmiş dinamik yapılara kovalent olmayan bir hidrofobik ya da iyonik etkileşimler (ya da her ikisinin bir kombinasyonu) ile toplanır. (I) denatürasyon ortamı içindeki diğer biyomoleküllerin proteinin bir seçici olarak ayrılması, ve (ii) saflaştırılmış proteinin bir renatürasyon in vitro katlanmasına kullanılarak: Sonuç olarak, en azından iki saflaştırma adımları içerirteknikleri. Shadoo seçici ayrılması 8 M üre elde edilmiştir (ya da seçenek olarak 6M Guanidin-HCl) ihtiva eden bir tampon çözeltisi içinde sağlanmıştır. (I) renatürasyon bir asidik pH çözelti içinde polimerize edilmiş Shadoo elde etmek için pH ≥ eden bir çözeltiye, 7 bir yapısal olmayan monomerik Shadoo proteini, ya da (ii) renatürasyon elde etmek üzere üre uzaklaştırılması ve protein renatürasyon çeşitli protokoller uygulanarak yapılabilir Karakteristik çapraz β-yaprak motifleri ile istikrarlı amiloid liflerinin içine.

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&amp;nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 Desalting column</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 Competent E. coli</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometar</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>protein size marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

purification and refolding to amyloid fibrils of (his)6-tagged recombinant shadoo protein expressed as inclusion bodies in e. coli

Escherichia coli sentezleme sistemi rekombinant ökariyotik proteinlerin üretimi için güçlü bir araçtır. Biz Shadoo prion familyasına ait bir proteini üretmek için kullanılır. Katma kütleleri tarif edildiği gibi (His) 6-etiketli rekombinant Shadoo saflaştırılması için bir kromatografik yöntem olarak ifade edilmiştir. Inklüzyon cisimcikleri, 8 M üre içinde çözülür ve iyon afinite kromatografisi gerçekleştirmek için bir Ni2 + -yüklü kolona bağlanmıştır. Bağlanmış proteinler imidazol gradyanı ile elüe edilir. Shadoo proteinini ihtiva eden fraksiyonlar bir yüksek ölçüde saflaştırılmış proteini elde etmek üzere boyut çıkarma kromatografisine tabi tutulur. Son adım saflaştırılmış Shadoo tuzlar, üre ve imidazol kaldırmak için HCl. Rekombinant Shadoo proteini prion hastalıklarda ortaya çıkan protein konformasyon bozukluklarının biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalar için önemli bir reaktiftir. Birçok rapor prion nörodejeneratif hastalıklar bıçak birikimi kaynaklı olduğunu gösterdile, amiloid fibrilleri emretti. Asidik ve nötr olarak amiloid fibrilleri içine Shadoo fibrillate açıklayan örnek protokoller / temel pHs sunulmuştur. Üretilmesi ve bir hızlı ve düşük maliyetli bir şekilde proteinin büyük miktarlarda üretilmesine imkan verir çünkü Shadoo, prion hastalıkları üzerinde çalışan laboratuarlarında araştırma kolaylaştırabilir liflenme ile ilgili yöntemler.

Saflaştınldı Shadoo proteinin yaklaşık 5-10 mg bakteri kültürü litresinde elde edilir. Bir iki-aşamalı saflaştırma yüksek saflıkta rekombinant Shadoo elde etmek için gereklidir. İlk adım, His-etiketli-proteinleri muhafaza eden bir Ni 2+ -yüklü kolon ile afinite kromatografisi ile gerçekleştirilir. Elüsyona uğratılan kısımlar SDS-PAGE tabi tutulur ve Coomassie Brilliant Blue (Şekil 5A) ile boyanır. Shadoo proteini ihtiva eden fraksiyonlar bir araya toplanmış ve da...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli at JoVE.com

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Saflaştırma ve Amiloid fibrillerin kadar yeniden katlama (His)<sub&gt; 6</sub&gt; etiketli Rekombinant Shadoo Protein Eklenmesi Organları olarak ifade<em&gt; E.coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

purification-refolding-to-amyloid-fibrils-his-6-tagged-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

14.1K Görüntüleme.  INRA. A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures. 

Video: Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis difficult1. Definite AD diagnosis is achieved only postmortem, thus establishing presymptomatic, early diagnosis of AD is crucial for developing and administering effective therapies2,3.
Amyloid &beta;-protein (A&beta;) is central to AD pathogenesis. Soluble, oligomeric A&beta; assemblies are believed to affect neurotoxicity underlying synaptic dysfunction and neuron loss in AD4,5. Various forms of soluble A&beta; assemblies have been described, however, their interrelationships and relevance to AD etiology and pathogenesis are complex and not well understood6. Specific molecular recognition tools may unravel the relationships amongst A&beta; assemblies and facilitate detection and characterization of these assemblies early in the disease course before symptoms emerge. Molecular recognition commonly relies on antibodies. However, an alternative class of molecular recognition tools, aptamers, offers important advantages relative to antibodies7,8. Aptamers are oligonucleotides generated by in-vitro selection: systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)9,10. SELEX is an iterative process that, similar to Darwinian evolution, allows selection, amplification, enrichment, and perpetuation of a property, e.g., avid, specific, ligand binding (aptamers) or catalytic activity (ribozymes and DNAzymes).
Despite emergence of aptamers as tools in modern biotechnology and medicine11, they have been underutilized in the amyloid field. Few RNA or ssDNA aptamers have been selected against various forms of prion proteins (PrP)12-16. An RNA aptamer generated against recombinant bovine PrP was shown to recognize bovine PrP-&beta;17, a soluble, oligomeric, &beta;-sheet-rich conformational variant of full-length PrP that forms amyloid fibrils18. Aptamers generated using monomeric and several forms of fibrillar &beta;2-microglobulin (&beta;2m) were found to bind fibrils of certain other amyloidogenic proteins besides &beta;2m fibrils19. Ylera et al. described RNA aptamers selected against immobilized monomeric A&beta;4020. Unexpectedly, these aptamers bound fibrillar A&beta;40. Altogether, these data raise several important questions. Why did aptamers selected against monomeric proteins recognize their polymeric forms? Could aptamers against monomeric and/or oligomeric forms of amyloidogenic proteins be obtained? To address these questions, we attempted to select aptamers for covalently-stabilized oligomeric A&beta;4021 generated using photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP)22,23. Similar to previous findings17,19,20, these aptamers reacted with fibrils of A&beta; and several other amyloidogenic proteins likely recognizing a potentially common amyloid structural aptatope21. Here, we present the SELEX methodology used in production of these aptamers21.

Selection of Aptamers for Amyloid &#946;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Aptamers are short ribo-/deoxyribo-oligonucleotides selected by in-vitro evolution methods based on affinity for a specific target. Aptamers are molecular recognition tools with versatile therapeutic, diagnostic, and research applications. We demonstrate methods for selection of aptamers for amyloid &beta;-protein, the causative agent of Alzheimer's disease.

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Nörobilim

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Biyokimya

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Biyoloji

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Tıp

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

Saflaştırma ve Amiloid fibrillerin kadar yeniden katlama (His)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu